CD95 Ölüme Neden Olan SinyalIzasyon Kompleksinin Bileşiminin Ölçülmesi ve Procaspase-8'in Bu Komplekste İşleniş
August 2nd, 2021
Burada, doğrudan ölüme neden olan sinyal kompleksinde (DISC) caspase-8 işlemenin algılanmasını sağlayan ve bu kompleksin bileşimini belirleyen deneysel bir iş akışı sunulmaktadır. Bu metodoloji, hücre ölüm yollarının moleküler mekanizmalarının çözülmesinden apoptoz ağlarının dinamik modellemesine kadar geniş uygulamalara sahiptir.
Apoptozun başlatılması, marker moleküler platformlarda kaspazların aktivasyonu ile aracılık eder. Caspase-8 aktivasyonu için bir platform görevi gören anahtar başlatma hücre ölüm kompleksi DISC'nin tespitini sunuyoruz. Bu tekniğin avantajı, bu komplekste kaspaz-8 işleme hakkında bilgi sağlamanın yanı sıra montajın ve DISC kompleksinin bileşiminin algılanmasını sağlamasıdır.
Deneye% 80 ila% 90 birleştiği ve çanağa yapışan hücrelerle başlayın. Ortamı atın ve yapışık hücrelere taze ortam ekleyin. Daha sonra plakayı bir açıyla tutarak ve ligand'ı yapışık hücrelere dokunmadan ortama pipetleyerek hücreleri seçilen CD95L konsantrasyonu ile uyarın.
Hücreleri toplamak için hücre kabını buza yerleştirin. Hücre süspansiyonu içine 10 mililitre soğuk PBS ekleyin ve ekli hücreleri plakadan kazıyın. Hücre süspansiyonu 50 mililitrelik bir tüpte toplayın.
Hücre kabını 10 mililitre soğuk PBS ile iki kez yıkayın ve yıkama çözeltisini aynı 50 mililitrelik tüpe ekleyin. Daha sonra hücre süspansiyonu 500 kez G'de dört santigrat derecede beş dakika santrifüjleyin. Üstnatant attıktan sonra, hücre peletini bir mililitre soğuk PBS'de yeniden depola.
Daha sonra hücre süspansiyonu 1,5 mililitrelik bir tüpe aktarın. Hücre süspansiyonu santrifüj ve tekrar soğuk PBS bir mililitre hücre pelet resuspend. Santrifüjü bir kez daha tekrarlayın, ardından hücre peletini bir mililitrelik lizis tamponunda yeniden ıslatın ve buzda 30 dakika kuluçkaya bırakın.
Kuluçkadan sonra, lisatı dört santigrat derecede 15 dakika boyunca maksimum hızda santrifüjleyin, ardından süpernatantı temiz bir tüpe aktarın. Peletin atılması ve protein konsantrasyonunun belirlenmesi için başka bir tüpte 50 mikroliterlik bir lysate örneği toplayın. İmmün önkseçim için, iki mikrolitre anti-APO1 antikoru ve 10 mikrolitre hazırlanmış Protein A Sepharose boncuklarını lisate ekleyin.
Boncuk kontrolü görevi görmek için lysate içeren ayrı bir tüpe sadece boncukların 10 mikrolitresini ekleyin. Lysate, antikorlar ve Protein A Sepharose boncuklarını içeren karışımı hafif karıştırma ile dört santigrat derecede bir gecede kuluçkaya bırakın. Ertesi gün, karışımı dört santigrat derecede dört dakika boyunca 500 kez G'de santrifüjleyin.
Süpernatantı attıktan sonra, bir mililitre soğuk PBS ekleyerek ve santrifüjü takiben süpernatantı atarak boncukları yıkayın. Bu adımı en az üç kez tekrarlayın. Son PBS yıkamayı attıktan sonra, boncukları tercihen 50 mikroliter Hamilton şırıngası ile aspire edin.
Batı lekesini gerçekleştirmek için boncuklara 20 mikrolitre 4X yükleme tamponu ekleyin ve 10 dakika boyunca 95 santigrat derecede ısıtın. Aynı anda, lisat kontrollerini 95 santigrat derecede beş dakika ısıtın. Lysates, immün önkupitantlar ve bir protein standardını %12,5 SDS jeline yükleyin ve 80 volt sabit voltajla çalıştırın.
Jel çalışması tamamlandıktan sonra, proteinleri SDS jelinden nitroselüloz bir zara aktarın. Aktarım tamamlandıktan sonra, şişmiş zarı bir kutuya yerleştirin ve nazik ajitasyon altında blokaj çözeltisinde bir saat kuluçkaya yatırın, ardından membranı PBST ile beş dakika boyunca üç kez yıkayın. Proteinleri tespit etmek için, belirtilen seyreltmedeki ilk birincil antikoru zara ekleyin ve hafif ajitasyonla dört santigrat derecede bir gecede kuluçkaya bırakın.
Ertesi gün, zarı üç beş dakikalık PBST yıkama ile yıkayın, ardından membranı oda sıcaklığında bir saat boyunca hafifçe sallanarak 20 mililitre ikincil antikorla kuluçkaya yatırın. Membranı pbst ile tekrar üç kez yıkayın. Son PBST yıkamasını attıktan sonra, zara yaklaşık bir mililitre yaban turpu peroksidaz substratı ekleyin ve kemomünsans sinyalini algılayın.
Serviks kanseri HeLa-CD95 hücrelerinin CD95L ile uyarılması, CD95 immün önkekipitasyon yoluyla izlenen yüksek düzeyde CD95 DISC oluşumuna neden oldu. Bu CD95 immünopipitasyonlarında etkili DISC oluşumunu gösteren CD95, FADD, procaspase-8, procaspase-10 ve c-FLIPS gözlenmiştir. İmmün önkupitasyonlarda p43-FLIP ve p22-FLIP'in kaspaz-8 aktivasyonunu gösteren dekolteli ürünleri tespit edildi.
CD95 DISC oluşumunun analizi için c-FLIP uzun uzun uzun ifade eden HeLa-CD95 hücreleri kullanılmıştır. Ebeveyn HeLa-CD95 hücrelerine benzer şekilde, CD95L tedavisi olmayan bu hücrelerden immün önkupitasyonlarda FADD, procaspase-9, procaspase-10, c-FLIP proteinleri ve PARP1 alımı saptanmamıştır. Aktif primer T hücreleri anti-CD95 immünöteniasyonlarda yüksek düzeyde CD95, FADD, procaspase-8, procaspase-10 ve c-FLIPS ile karakterize edildi.
Bu teknik, DISC'de caspase-8'in işlenmesi de dahil olmak üzere moleküler DISC oluşumunun analizini sağlar. Tüm yıkama adımları çok önemlidir. Ayrıca stimülasyon noktaları ve kuluçka süreleri de ciddiye alınmalıdır.
Disc kompleksindeki derlemeyi ölçmenin tek yolu budur. Bununla birlikte, caspase-8 aktivasyonunu ölçmek için, caspase-8 aktivite tahlilleri de uygulanabilir. Bu yaklaşım, apoptozun başlatılması hakkında yeni içgörüler elde etmemizi sağladı.
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
Genel Bakış
Bu makale, ölüme-yol açan sinyal kompleksi (DISC) üzerinde kaspaz-8 işlemesini tespit etmek için deneysel bir iş akışını sunmaktadır. Metodoloji, hücre ölümü yollarını ve apoptoz ağlarını anlamak için geniş uygulamaları olan DISC kompleksinin bileşiminin belirlenmesine olanak tanır.
Çalışmanın Temel Bileşenleri
Bilim Alanı
- Hücre Biyolojisi
- Apoptoz
- Moleküler Mekanizmalar
Arka Plan
- Apoptoz, spesifik moleküler platformlarda kaspaz aktivasyonu ile başlatılır.
- DISC kompleksi, kaspaz-8 aktivasyonu için kritik öneme sahiptir.
- DISC'in bileşimini anlamak, hücre ölümü mekanizmalarına dair içgörüler sağlayabilir.
- Bu teknik, apoptoz dinamiklerini inceleme yeteneğini artırır.
Çalışmanın Amacı
- DISC montajının ve bileşiminin tespit edilmesi için bir yöntem sunmak.
- DISC içinde kaspaz-8 işlemesine dair içgörüler sağlamak.
- Apoptoz ağları üzerinde araştırma yapmayı kolaylaştırmak.
Kullanılan Yöntemler
- Yapışkan hücrelerle %80 ila %90 konfluenste başlayın.
- Ortamı taze ortamla değiştirin.
- Ortama pipetle yaparak hücreleri CD95L ile uyarın.
- DISC kompleksinin montajını gözlemleyin.
Ana Sonuçlar
- Metodloji, DISC bileşimini başarılı bir şekilde tespit eder.
- Kaspaz-8 işlemesi DISC'te doğrudan gözlemlendi.
- Teknik, apoptoz ağlarının dinamik modellenmesine olanak tanır.
- Hücre ölümü yollarını incelemede geniş uygulamalar tanımlandı.
Sonuçlar
- Bu deneysel iş akışı, apoptozun anlaşılmasını artırır.
- Hücre ölümü mekanizmalarını inceleyen araştırmacılar için değerli bir araç sağlar.
- Bulgular, apoptozu hedefleyen terapötik stratejilerde yeni içgörülere yol açabilir.
Sıkça Sorulan Sorular
Executive Industry Relevance
Understanding the composition and dynamics of the death-inducing signaling complex (DISC) is critical for de-risking apoptosis-targeted therapeutic strategies. This method enables direct measurement of procaspase-8 recruitment and processing within the DISC, providing mechanistic insights that support target validation in extrinsic apoptosis pathways. By quantifying DISC formation and caspase-8 activation, researchers can assess target engagement and pathway modulation with greater predictive confidence in preclinical models.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of DISC assembly to validate death receptor targets like CD95/Fas in apoptosis pathways.
- Operational Value: Provides a reproducible immunoprecipitation-western blot workflow to assess target complex formation and caspase-8 processing.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates quantitative readouts of DISC components (CD95, FADD, procaspase-8/10, c-FLIP) and cleavage products for assay standardization.
- Operational Value: Supports development of cell-based assays to screen modulators of death receptor signaling with defined biochemical outputs.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Links DISC composition to caspase-8 activation, enabling mechanistic de-risking of apoptosis-inducing compounds in disease-relevant systems.
- Operational Value: Facilitates comparison of DISC dynamics across models (e.g., HeLa-CD95, primary T-cells) to support translational continuity.
Pipeline & Workflow Integration
This method fits within the discovery continuum from target validation through lead identification to preclinical assessment by providing biochemical evidence of pathway modulation at the DISC level.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing of death receptor agonists or antagonists by measuring DISC assembly and caspase-8 processing.
- Screening: Enables assay readiness through standardized detection of DISC components and cleavage fragments as quantitative endpoints.
- Analytics: Delivers measurable outputs (e.g., p43-FLIP, p22-FLIP cleavage) that allow comparison of compound effects on caspase-8 activation within the DISC.
- Translational Research: Connects early DISC dynamics to apoptotic outcomes, supporting risk-adjusted advancement decisions in preclinical development.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable platform for characterizing death receptor-targeted therapeutics across multiple apoptosis models.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in target validation by directly measuring caspase-8 processing at the DISC.
- Operational Value: Delivers a standardized, scalable workflow for DISC analysis applicable across adherent and primary cell models.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions by reducing mechanistic ambiguity in apoptosis-inducing compound screening.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of death receptor modulators based on DISC engagement and caspase-8 activation data.
Implementation Considerations
- Requires expertise in immunoprecipitation, western blotting, and apoptosis biology.
- Dependent on high-quality antibodies (e.g., anti-APO1/CD95) and Protein A Sepharose beads for efficient DISC isolation.
- Necessitates standardized cell stimulation, lysis, and washing conditions to ensure reproducible DISC recovery.
- Adaptation to non-adherent or primary immune cells may require optimization of stimulation and harvesting steps.
- Practical limitations include the need for careful titration of death ligand (e.g., CD95L) to avoid nonspecific activation and ensure physiological relevance.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:05
Introduction
0:44
Preparing Cells and CD95L Stimulation
1:11
Cell Harvest and Lysis
2:29
Immunoprecipitation
3:28
Western Blot
4:21
Western Blot Detection
5:05
Analysis of CD95 DISC Formation in HeLa-CD95 cells, c-FLIPL-overexpressing HeLa-CD95 cells, and Primary T Cells
6:25
Conclusion
