Name: Hücre Dışı Veziküllerin Üç Boyutlu Doğrudan Stokastik Optik Rekonstrüksiyon Mikroskopisi (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-08-26T14:45:00.000+00:00
Duration: 9 min 36 s
Description: Keşfedin dSTORM ile hücre dışı veziküllerin üç boyutlu süper çözünürlüklü görüntülenmesini. Bu yöntem nanometre ölçeğinde EV yapısını aydınlatır ve SARS-CoV-2 gibi viral enfeksiyonlarda biyobelirteç keşfi için güçlü bir araç sunar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Oxford Nanoimaging'e yapıcı geri bildirimleri ve rehberliği için teşekkür ederiz. Bu çalışma 5UM1CA121947-10 tarafından R.P..M.'a ve 1R01DA040394'den D.P.D.'ye finanse edildi.

1 Hücre hatlarının yayılması ve bakımı
<ol><li>İnsan osteosarkom hücreleri (U2OS) alıp hücreleri %10 eksozom içermeyen Fetal Sığır Serumu ve 1x Penisilin/Streptomisin çözeltisi ile desteklenmiş büyüme ortamına yerleştirin. NOT: McNamara et'te sunulan protokol sonrasında ekzozomsuz Fetal Sığır Serumu üretildi. al.26.</li>
	<li>U2OS hücrelerini % 5CO 2'de 37 °C'de bakır kaplı bir inkübatörde ve T175 şişelerinde geçiş hücrelerinde26,27'desakla. Hücreler, subpopulasyonların ortaya çıkmasını önlemek için orta logaritmik büyüme aşamasında veya sabit faz sırasında apoptotik kalıntıların birikmesinden korunmalıdır.</li>
</ol>2 Eksozom izolasyonu ve saflaştırma
<ol><li>Şişe başına 50 mL ortam ile 10 ayrı T175 şişesinde U2OS hücre hatlarını tam izdiah eder. Hücre üstnatantı çıkarın ve art arda 0,45 μm ve 0,22 μm vakum filtrasyon aparatına geçirin.</li>
	<li>Daha küçük proteinleri veya metabolitleri kaldırmak için 750 kDa içi boş lif kartuşu ile donatılmış bir filtrasyon sisteminde çapraz akış filtrasyonuna(teğetsel akış filtrasyonu olarak da bilinir) maruz kalın.<ol>
<li>10 veya daha fazla psi Δ basıncı üretmek için 20 psi < tutma basıncını korurken, süpernatantı teğet akış filtrasyon operatöründen 30 psi sabit ileri basınçta geçirin. Retentate tankına manyetik bir karıştırma çubuğu yerleştirin ve 150 rpm26olarak ayarlayın.</li>
		<li>Besleme hızını 40 mL/dk veya daha yüksekte koruyun. Geçirgenliği bir rezervuarda toplayın ve atın.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Süpernatant'ı 30 mL'ye konsantre edin ve ardından dört adet 1x PBS hacmi ile dengeyi sağlar. Çapraz akış filtreli ve eşkenel çözeltiyi 50 mL konik bir tüpte toplayın.</li>
	<li>EV'leri 4 °C'de bir gecede 40 mg/mL polietilen glikolün son konsantrasyonunda 8.000 Da moleküler ağırlığa sahip çökeltici 1.200 x g'da 1 saat boyunca 4 °C'de santrifüj ve 1x PBS'nin 500 μL'sinde resüspend.</li>
	<li>EV'leri 50 μg/mL fotoğraf büyülenebilir kırmızı membran aralayıcı boya ve 1 saat boyunca 4 °C'de 1x PBS'de 50 μg/mL RNase A ile kuluçkaya yatırın.</li>
	<li>Fraksiyon toplayıcıya bağlı bir protein arıtma sistemindeki bir sütundan fazla boyayı çıkarın. UV absorbansı ile EV fraksiyonlarını tanımlayın ve bir mikrosantrifüj tüpü26içine birleşin.</li>
	<li>Benzeşim- 1x PBS'de eşleştirilmiş anti-CD81 manyetik boncuklar kullanarak toplam 200 μL EV seçin.<ol>
<li>Anti-CD81 manyetik boncukların 100 μL'sini 1x PBS'de toplam 1 mL hacme seyreltin ve sürekli sallanan 2 mL mikrosantrifüj tüpünde 2 saat boyunca 4 °C'de bağlanmalarını sağlar.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Anti-CD81 boncukları ve EV'yi 1x PBS ile üç kez yıkayın. 37 °C'de 30 dakika boyunca pH 2.0'da 100 mM Glisin ile çözeltiden Elute CD81+ EV.</li>
	<li>Pipet saflaştırılmış CD81+ EV, 1x PBS'de pH 7.5'te 100 mM Tris-HCl eşit hacimde. NOT:26EV'lerin çözeltisinin saflığını ve varlığını doğrulamak için Nanopartikül Takip Analizi veya elektron mikroskopisi için saflaştırılmış CD81+ EV çözeltisi aliquot rezerve edilebilir.</li>
</ol>3 Fiksasyon ve hazırlık
<ol><li>Benzeşimli EV'leri cam tabanlı μ-slide 8 kuyu plakalarına toplam 200 μL hacimde yerleştirin (EV örneğini pH 7,5'te 1x PBS'de 100 mM Tris-HCl'de seyreltebilir) ve 4 °C'de bir gecede yüzeye yapışmaya izin verin.</li>
	<li>Mevcut çözeltiyi 8 kuyulu plakadan çıkarmadan, her kuyudaki EV içeren çözeltiye 1x PBS'de 200 μL% 4 paraformaldehit ekleyerek EV'leri plakalara sabitlayın ve oda sıcaklığında 30 dakika kuluçkaya yatmaya izin verin21.</li>
	<li>EV'leri rahatsız etmemek için paraformaldehit ve fazla çözeltiyi bir mikropipette dikkatlice çıkarın. Fazla paraformaldehit gidermek için EV'yi 1x PBS ile yıkayın. Yıkama prosedürünü üç kez gerçekleştirin. Fazla 1x PBS'yi çıkarın.</li>
	<li>Üretici protokolü başına görüntüleme tamponunda (Bölüm B) seyreltilmiş 5 mM protocatechuate dioksijenaz (Bölüm A) çözeltisi oluşturarak numune başına 250 μL dSTORM B küplü tampon çözeltisi hazırlayın. NOT: Fotobleaching meydana gelirse, tampondaki enzimin konsantrasyonu iki katına çıkarılarak 10 mM'ye çıkarılabilir.<ol>
<li>Oksitleyici molekülleri atmadan önce oda sıcaklığında 20 dakika boyunca üretici protokolü başına her kuyuya 250 μL hazırlanan tampon ekleyin. NOT: EV daha sonra hemen görüntülenebilir veya bir haftaya kadar 4 °C'de saklanabilir. Her görselleştirmeden önce depolamayı izleyen arabelleği değiştirin.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4 Doğrudan stokastik optik rekonstrüksiyon mikroskopi kalibrasyonu
<ol><li>100 nm mikrokürecikleri moleküler biyoloji sınıfı suda % 0,5 konsantrasyona seyrelterek ve cam tabanlı μ slaytlı 8 kuyu plakasının her kuyusuna 200 μL pipetle vurarak süper çözünürlüklü mikroskobun kalibrasyonu için gerekli boncukları hazırlayın.<ol>
<li>Boncukların oda sıcaklığında 1 saat boyunca kuyulara yerleşmesine izin verin.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Mevcut çözeltiyi çıkarmadan, kalibrasyon boncuk çözeltisine her kuyuya PBS'de 200 μL% 4 paraformaldehit ekleyin ve oda sıcaklığında 30 dakika kuluçkaya yatmaya izin verin.</li>
	<li>Boncukları rahatsız etmemek için paraformaldehiti bir mikropipetle dikkatlice çıkarın ve boncukları 1x PBS ile üç kez yıkayın. Arabelleği adım 3.4'e göre hazırlayın.</li>
	<li>1x PBS'yi çıkarın ve hazırlanan tamponun 250 μL'lik kısmını her kuyuya ekleyin. Görselleştirmeden önce arabelleğin 20 dakika oturmasına izin verin.</li>
	<li>Sahne alanına herhangi bir şey yerleştirmeden önce, Mikroskobu Bağla düğmesini kullanarak 3-B mikroskopa bağlanın. Hedefe 100x yağ ekleyin ve kuyunun merkezini hedefin üzerine yerleştirin. Edin ayarında, 473 ve 640 nm heyecan lazerlerini açın ve Görüntüle 'yetıklayın.<ol>
<li>3-B lens etkinleştirilmeden, Görüntü Görüntüleme seçeneklerinde Foton Sayıları'na tıklayarak foton doygunluğu ayarının altındaki boncukları görüntüleyin. İlk lazer güçlerini 473 nm lazer için 8,4 mW'a ve 640 nm lazer için 11,6 mW'a ayarlayın.</li>
		<li>Lazerin odağını yaklaşık -300 nm'ye veya kalibrasyon boncuklarının odak düzlemine düşürerek tek tek boncukların net bir çözünürlüğünü üretin. Z düzlemi odaklandıktan sonra, lazer güç seviyelerini her görüş alanındaki varyasyonu hesaba katacak şekilde daha fazla ayarlayın.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Cihaz işlevleri altında, X, Y ve Z eksenindeki hataları elde etmek için 3-B haritalama kalibrasyonunu ve kanal haritalama kalibrasyonunu tamamlayın. Kanal eşleme kalibrasyonu sırasında en fazla EV sayısını 20'ye, hedef nokta sayısını 4.000'e, kanallar arasındaki maksimum mesafeyi 5,0 piksele ve kanallar arasındaki dışlama yarıçapını 10,0 piksele ayarlayın.</li>
	<li>Kalibrasyonun %90'> bir nokta kapsama alanı ve iyi bir haritalama kalitesi ürettiğinden emin olun. Verilen kalibrasyon verilerini gelecekteki görüntü alımları için kaydedin.</li>
</ol>5 EV'nin üç boyutta görselleştirilmesi
<ol><li>Hedefe 100x yağ ekleyin ve hazırlanan EV'leri mikroskopa yerleştirin. 3-B lens etkinleştirilmeden, 640 nm uyarlama lazerini açın ve kırmızı membran intercalating boya boyalı EV'leri heyecanlandırmak için sinyalin ve görüş alanının yoğunluğuna bağlı olarak başlangıçta 1,2 mW ile 12,5 mW arasında yükseltin.<ol>
<li>Görüntü Görüntüleme seçenekleri altında, EV'leri daha iyi görselleştirmek için görüntüleme yöntemini foton doygunluğundan yüzdelik dilimlere geçirin. Sinyali en üst düzeye çıkarırken gürültüyü en aza indirmek için lazer gücünü ayarlayın. Diğer tüm parametreleri koruyun.</li>
		<li>Z eksenindeki yukarı veya aşağı simgesini tıklatarak Z düzleminin odağını ayarlayın. NOT: Z düzlemi -200 ile -350 nm arasında odaklanmalıdır, ancak görüş alanına bağlı olarak değişecektir.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Pozlama süresini 20 ms, kare yakalamayı 10.000 kareye ve ilk lazer gücünü 1,2 mW ile 12,5 mW arasında veya sinyalin yoğunluğuna ve görüş alanına bağlı olarak 5,1 adımda belirlenen lazer gücüne ayarlayın.<ol>
<li>Simgeyi kullanarak 3-B lensi etkinleştirin ve Edin düğmesine tıklayarak satın almaya başlayın.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Görüntü alımı boyunca, lazer gücünü her 1000 karede 3 artışla veya yüksek sinyal-gürültü oranını korumak için yeterli artırın. Satın alma sırasında Z düzlemini ayarlamayın. NOT: Lazer maksimum 90 mW lazer gücüne yükseltilebilir.</li>
</ol>6 Satın alma sonrası modifikasyon ve EV izleme
<ol><li>Görüntü alımından sonra, Görüntülemeyi çözümle penceresine geçiş yapma. Filtrelenmemiş görüntüde sürüklenme düzeltmesi gerçekleştirin ve filtreleri etkinleştirin. Foton sayısını, yerelleştirme hassasiyetini, sigmaları ve çerçeve dizinini Tablo 1'e göre ayarlayın.</li>
	<li>Görünüm ve dışa aktarma alanından tek tek EV'lerin X ekseni boyunca bir XYZ düzlem görünümü aracını kapla. Fotoğraf çekme olaylarının CSV dosyaları.</li>
	<li>X x x eksenindeki tek tek EV'leri X x x görüş alanında, fotoğraf çekme olaylarını ayarlanan mesafe gruplarına sığdıran bir çizgi histogram aracı kullanarak ikiye ayırın.</li>
	<li>Tek EV'lerin görüntülerini alın ve bunları .tiff dosyaları olarak kaydedin.</li>
	<li>Z ekseni boyunca yerleşime göre 3-B görselleştirme aracı ve rengi kullanarak tek tek EV'lerin 3-B videolarını oluşturun.</li>
</ol>

M.G.C.'nin beyan edecek bir çıkar çatışması yok. R.P.M ve D.P.D., Oxford Nanoimaging (ONI) Inc. ve Cytiva Inc.'den (eski adıyla GE Healthcare) malzeme desteği almaktadır. R.P.M. ve D.P.D. sunulan bazı bilgilerin olası ticarileştirilmesi için rakip çıkarlar beyan eder. Bunlar Kuzey Carolina Üniversitesi tarafından yönetilmektedir. Fon kaynakları bu makalenin yorumlanmasında veya yazılmasında yer almamaktadır.

EV'ler, birçok hücre içi işlemdeki önemli rolleri ve hücreden hücreye sinyalizasyon1,30. Bununla birlikte, küçük boyutları ışık mikroskopisinin kırınım sınırının altına düştüğü için görselleştirmelerinin zor olduğu kanıtlanır. Doğrudan stokastik optik rekonstrüksiyon mikroskopisi (dSTORM), zaman içinde bireysel floroforların fotoğraf çekme olaylarını yakalayarak ve bu yanıp sönen olaylara dayanarak bir görüntüyü yeniden oluşturarak kırınım sınırını atlayan doğrud...

Hücre dışı veziklinler (EV' ler) tüm hücre tipleri tarafından salınan membran bağlı veziküllerdir. Lipitler, proteinler, metabolitler ve nükleik asitler içerirler ve bu malzemeleri hücreler arasında lokal olarak ve dokular ve organlar arasında distal olarak aktarırlar. EV'lerin üç ana alt tipi vardır: apoptotik cisimler, mikrovesiküller ve ekzozomlar1,2. Burada, tartışmamızı eksozomlara ve ilişkili proteinlerine odaklıyoruz.
Ekzozomlar, erken endozomların çokvesiküler vücuda (MVB) içe doğru tomurcuklanmasından kaynaklanan veziküller salgılanır. MVB daha sonra plazma zarı ile kaynaşır ve eksozomları hücre dışı alana serbest bırakarak diğer hücrelere3,4. Ekzozomlar 40 ila 150 nm arasında değişen boyutlarda bulunur ve tetraspaninler (CD9, CD63, CD81), taşıma için gerekli olan membran bağlı endosomal sıralama kompleksi (ESCRT) ve lipid sal ile ilişkili proteinler 1,2 ,5,6,7olarak bilinen endosomal transmembran proteinleri ile zenginleştirilir.
Eksozomların biyokimyasal makyajını karakterize etmek, araştırmacıların işlevsel doğalarını daha iyi anlamaları için popüler bir alan haline gelmiştir. Nano ölçekli akış sitometrisi, nanopartikül izleme analizi (NTA), tarama ve iletim elektron mikroskopisi (TEM), yüzey plazmon rezonansı, dirençli darbe algılama ve her biri8,9eksileri içeren geleneksel ışık mikroskopisi dahil olmak üzere eksozomları görselleştirmek ve karakterize etmek için birçok yöntem mevcuttur. TEM ve kriyo-EM nanometre tabanlı çözünürlük elde edebilir, ancak genellikle susuz bırakma ve donma-kırılma adımları gerektirir, böylece 10,11 EV'leriküçültür veya yutabilir. NTA, aynı anda yüzlerce EV'nin karakterizasyonuna izin vererek ışık saçılımlarına dayanır, ancak parçacık boyutunun dolaylı bir ölçümüdür ve EV'ler, virüsler ve protein agregaları arasında kolayca ayırt edemez12 , 13,14,15,16. Nano ölçekli akış sitometrisi, daha sonra boyut ölçümlerine çevrilebilen bir heyecan yolundan ışık saçılımını istihdam eder, ancak gelişmekte olan bir teknolojidir ve çeşitli aletler için doğrusal algılama aralığında parçacıkların boyutu hakkında çok az fikir birliği vardır12,17,18.
Floresan proteinler veya boyalar kullanılarak geleneksel ışık mikroskopisi, hücre altı bölmeleri, protein komplekslerini ve bir hücre içindeki sinyal makinelerini görselleştirmek için en yoğun kullanılan tekniklerden biri olmuştur. Bu teknik komplekslerin lokalizasyonunu görselleştirmede yararlı olsa da, geleneksel ışık mikroskopisinin kırınım sınırı (yaklaşık 250-400 nm), bir ekzozom (40-150 nm) 12,19,20'nin tipik boyut aralığındaki proteinlerin veya yapıların net çözünürlüğünü önler.
Süper çözünürlüklü mikroskopi, yani doğrudan stokastik optik rekonstrüksiyon mikroskopisi (dSTORM), belirli floroforların fotowitchable özelliklerini kullanarak ve görüntüleri nanometre hassasiyeti21'ekadar yeniden oluşturmak için bu yanıp sönen olayları algılayarak geleneksel ışık mikroskopisinden kendini ayırır. Photoswitching olayları, on binlerce bireysel pozlama boyunca yüksek kare hızında algılama kamerası kullanılarak toplanır ve fotoğraf çekme floroforunun tam konumunu yüksek güvenle haritalamak için bir nokta yayma işlevi kullanılır19,20,22. Bu, dSTORM'un ışık mikroskopisinin kırınım sınırını atlamasına izin verir. Çeşitli gruplar, eksozomları ve ilişkili proteinleri22 , 23 , 24,25'igörselleştirmek ve izlemek için süper çözünürlüklü tekniklerin kullanıldığını bildirmektedir. Son çözünürlük floroforun biyofiziksel özelliklerine bağlıdır, ancak genellikle XY ekseni boyunca +/-10-100 nm arasında değişerek tek moleküllü çözünürlüğe izin verir.
XY ekseninde bu ölçekte bireysel floroforları çözme yeteneği mikroskopide devrim yaratmamıştır. Ancak, bir eksozom üç boyutlu (3-B) dSTORM hakkında çok az veri vardır. Bu nedenle, 3 boyutlu nanometre hassasiyetine ekozomlar da dahil olmak üzere saflaştırılmış EV'lerin dSTORM tabanlı görselleştirilmesi ve karakterizasyonu için standart bir işletim prosedürü (SÇP) oluşturmaya çalıştık.

<table><tbody><tr><td>15 &mikro;-Slayt 8 kuyulu plakalar</td><td>Ibidi</td><td>80827</td><td></td></tr><tr><td>1X PBS</td><td>Gibco</td><td>14190-144</td><td></td></tr><tr><td>1X Penisilin Streptomisin çözeltisi</td><td>Gibco</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>50 mL konik tüp</td><td>Thermo Fisher</td><td>339652</td><td></td></tr><tr><td>500 mL 0.22 &mikro; m vakum filtrasyon cihazı</td><td>Genesee</td><td>25-227</td><td></td></tr><tr><td>750 kDa içi boş fiber kartuş kesme filtresi</td><td>Cytiva</td><td>29-0142-95</td><td></td></tr><tr><td>AKTA Akı S</td><td>Cytiva</td><td>29-0384-37</td><td></td></tr><tr><td>AKTA Start</td><td>Cytiva</td><td>29022094-ECOMINSSW</td><td></td></tr><tr><td>Anti-CD81 manyetik boncuklar</td><td>Thermo Fisher</td><td>10616D</td><td></td></tr><tr><td>B-küp tampon</td><td>ONI</td><td>&nbsp; </td><td></td>BCA0017</tr><tr><td>CellMask Kırmızı</td><td>Thermo Fisher</td><td>C10046</td><td></td></tr><tr><td>Dubelco'nun Modifiye Eagle Orta</td><td>Thermo Fisher</td><td>10566016</td><td></td></tr><tr><td>Fetal Sığır Serumu</td><td>VWR</td><td>97068-085</td><td></td></tr><tr><td>Frac 30 Fraksiyon toplayıcı</td><td>Cytiva</td><td>29022094-ECOMINSSW Glisin</td><td></td></tr><tr><td>pH = 2.0</td><td>Thermo Fisher</td><td>BP381-5</td><td></td></tr><tr><td>HiTrap CaptoCore 700 Sütun</td><td>Cytiva</td><td>17548151</td><td></td></tr><tr><td>Moleküler Biyoloji Sınıfı Su</td><td>Corning</td><td>9820003</td><td></td></tr><tr><td>Nanoimager</td><td>Oxford Nanogörüntüleme</td><td>Özel</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehhyde</td><td>Elektron Mikroskobu Bilimleri</td><td>15710</td><td></td></tr><tr><td>Polietilen glikol</td><td>Thermo Fisher</td><td>BP233-1</td><td></td></tr><tr><td>RNase A</td><td>Promega</td><td>A797C</td><td></td></tr><tr><td>T175 Şişeler</td><td>Genesee</td><td>25-211</td><td></td></tr><tr><td>Tetraspek mikroküreler</td><td>Invitrogen</td><td>T7279</td><td></td></tr><tr><td>Tris- HCl pH = 7.5</td><td>Thermo Fisher</td><td>BP153-1</td><td></td></tr><tr><td>Unicorn V</td><td>Cytiva</td><td>29022094-ECOMINSSW</td><td></td></tr></tbody></table>

hücre dışı veziküllerin Üç boyutlu doğrudan stokastik optik rekonstrüksiyon mikroskopisi

Direct Stochastic Optical Reconstruction Microscopy of Extracellular Vesicles in Three Dimensions

Hücre dışı veziküller (EV' ler) tüm hücre tipleri tarafından salınır ve hücre sinyalizasyonu ve homeostazda önemli bir rol oynar. EV'lerin görselleştirilmesi genellikle tipik ışık mikroskopisinin kırınım sınırının altında olan küçük çapları (40-250 nm) nedeniyle dolaylı yöntemler gerektirir. Kırınım sınırını hem iki hem de üç boyutta atlamak için EV'lerin süper çözünürlüklü mikroskopi tabanlı bir görselleştirmesini geliştirdik. Bu yaklaşımı kullanarak, EV'lerin üç boyutlu şeklini XY ekseninde +/- 20 nm çözünürlüğe ve Z ekseni boyunca +/- 50 nm çözünürlüğe çözebiliriz. Sonuç olarak, süper çözünürlüklü mikroskopinin, ekzozomlar ve zarflı virüsler de dahil olmak üzere EV'lerin bir karakterizasyon yöntemi olarak kabul edilmesini öneriyoruz.

Bu çalışmanın amacı, nanometre çözünürlüğü olan bireysel EV'lerin üç boyutlu olarak (3-D) görselleştirilmesinde süper çözünürlüklü mikroskopinin etkinliğini değerlendirmektir. Bireysel EV'lerin şeklini ve boyutunu analiz etmek için, fotoğraflanabilir boya kullandık ve EV'leri uzak kırmızı, membran aralayıcı bir boya ile kuluçkaya yatırdık ve kromatografi29aracılığıyla fazla boyayı çıkardık. Benzeşim yakalanan anti-CD81 ve kırmızı lekeli EV'ler daha sonra 640 nm uyarım lazeri altında süper çözünürl...

Doğrudan stokastik optik rekonstrüksiyon mikroskopisi (dSTORM), ışık mikroskopisinin tipik kırınım sınırını atlamak ve ekzomları nanometre ölçeğinde görüntülemek için kullanılır. Eksozomları karakterize etmek için hem iki hem de üç boyutta kullanılabilir.

Hücre Dışı Veziküllerin Üç Boyutlu Doğrudan Stokastik Optik Rekonstrüksiyon Mikroskopisi

Extracellular vesicles (EVs) are released by all cell types and play an important role in cell signaling and homeostasis. The visualization of EVs often ...

Bu protokol, kırınım sınırını atlamak ve EV'leri üç boyutta nanometre hassasiyetiyle görselleştirmek için dSTORM olarak da bilinen stochastic optik rekonstrüksiyon mikroskopisini özellikle doğrudan doğrudan kullanır. dSTORM'un önemli bir avantajı, EV'nin biyokimyasal doğasını değiştiren adımlara zarar vermeden ışığın kırınım seviyesinin altındaki parçacıkları doğrudan görselleştirme yeteneğidir. Evrimsel olarak farklı birçok virüs EV sinyali verir, bu nedenle dSTORM, hastalık biyobelirteçleri ve ilerlemesi için EV'leri karakterize etmek ve SARS-CoV2 gibi bireysel virüs parçacıklarını görselleştirmek için kullanılabilir. Benzeşimli, hücre dışı veziküller veya EV'leri cam tabanlı, mikroslid, sekiz kuyulu plakalara toplam 200 mikrolitre hacimde yerleştirerek başlayın ve dört santigrat derecede bir gecede yüzeye yapışmalarını sağlar.Mevcut çözeltiyi sekiz kuyulu plakadan çıkarmadan, her kuyudaki EV içeren çözeltiye 1X PBS'de %4 paraformaldehitten oluşan 200 mikrolitre ekleyerek EV'leri plakalara sabitleyin ve plakaların oda sıcaklığında 30 dakika kuluçkaya yatmasını bekleyin. EV'leri rahatsız etmemek için paraformaldehit ve fazla çözeltiyi bir mikropipette dikkatlice çıkarın. Fazla paraformaldehit gidermek için EV'yi 1X PBS ile yıkayın.Yıkama prosedürünü üç kez gerçekleştirin. Fazla 1X PBS'yi çıkarın. Üreticinin protokolüne göre görüntüleme tamponunda seyreltilmiş beş milimolar protocatechuic dioksijenaz çözeltisi oluşturarak numune başına 250 mikrolitre dSTORM Bcubed tampon çözeltisi hazırlayın.Üretici protokolüne göre her birine 250 mikrolitre hazırlanan tamponu ekleyin ve oksitleyici molekülleri çöpe atmadan önce plakaları oda sıcaklığında 20 dakika kuluçkaya bırakın. EV'ler hemen görselleştirilebilir veya bir hafta boyunca dört santigrat derecede saklanabilir. Süper çözünürlüklü mikroskobun kalibrasyonu için gerekli boncukları hazırlamak için, 100 nanometre mikrokürecikleri moleküler biyoloji sınıfı suda% 0,5 konsantrasyonda seyreltin ve pipet 200 mikrolitreyi cam tabanlı, mikroslid, sekiz kuyulu bir plakanın her kuyusuna seyreltin.Boncukların oda sıcaklığında bir saat boyunca kuyulara yerleşmesine izin verin. Mevcut çözeltiyi çıkarmadan, kalibrasyon boncuk çözeltisine her kuyuya PBS'de% 4 paraformaldehit 200 mikrolitre ekleyin ve oda sıcaklığında 30 dakika kuluçkaya yatmaya izin verin. Boncukları rahatsız etmemek için paraformaldehiti bir mikropipetle dikkatlice çıkarın ve boncukları 1X PBS ile üç kez yıkayın.Arabelleği yazıda açıklandığı gibi hazırlayın. 1X PBS'yi çıkarın ve hazırlanan tamponun her kuyuya 250 mikrolitresini ekleyin. Arabelleğin görselleştirmeden önce 20 dakika oturmasına izin verin.Sahne alanına herhangi bir şey yerleştirmeden önce 3B mikroskoplara bağlanmak için Mikroskobu Bağla düğmesini kullanın. Hedefe 100X yağ ekleyin ve kuyunun merkezini hedefin üzerine yerleştirin. Edin ayarında, 473 ve 640 nanometrelik heyecan lazerlerini açın ve Görüntüle'ye tıklayın.3D lensi etkinleştirmeden, Görüntü Görüntüleme Seçenekleri'ndeki Foton sayılarına tıklayarak foton doygunluğu ayarının altındaki boncukları görüntüleyin. İlk lazer güçlerini 473 nanometre lazer için 8,4 miliwatt ve 640 nanometre lazer için 11,6 miliwatt olarak ayarlayın. Lazerin odağını eksi 300 nanometreye veya kalibrasyon boncuklarının odak düzlemine düşürerek tek tek boncukların net bir çözünürlüğünü üretin.Z düzlemi odaklandıktan sonra, lazer güç seviyelerini her görüş alanındaki varyasyonu hesaba katacak şekilde daha fazla ayarlayın. Cihaz işlevleri altında, X, Y ve Z eksenindeki hataları elde etmek için 3B haritalama kalibrasyonunu ve kanal eşleme kalibrasyonunu tamamlayın. kanal eşleme kalibrasyonu sırasında en fazla görüş alanı sayısını 20'ye, hedef nokta sayısını 4.000'e, kanallar arasındaki maksimum mesafeyi 5,0 piksele ve kanallar arasındaki dışlama yarıçapını 10,0 piksel olarak ayarlayın.Kalibrasyonun %90'dan daha yüksek bir nokta kapsama alanı ve iyi bir haritalama kalitesi ürettiğinden emin olun. Verilen kalibrasyon verilerini gelecekteki görüntü alımları için kaydedin. Hedefe 100X yağ ekleyin ve hazırlanan EV'leri mikroskopa yerleştirin.3D lensi etkinleştirmeden, 640 nanometrelik ekscitasyon lazerini açın ve kırmızı membran, interkalasyon, boya lekeli EV'leri heyecanlandırmak için görüş alanındaki sinyalin yoğunluğuna bağlı olarak başlangıçta 1,2 ila 12,5 miliwatt'a yükseltin. Görüntü Görüntüleme Seçenekleri'nin altında, EV'leri daha iyi görselleştirmek için görüntüleme yöntemini foton doygunluğundan yüzdelik dilimlere geçirin. Sinyali en üst düzeye çıkarırken gürültüyü en aza indirmek için lazer gücünü ayarlayın ve diğer tüm parametreleri koruyun.Z eksenindeki yukarı veya aşağı simgesini tıklatarak Z düzleminin odağını ayarlayın. Pozlama süresini 20 milisaniye, kare yakalamayı 10.000 kareye ve ilk lazer gücünü sinyalin yoğunluğuna ve görüş alanına bağlı olarak 1,2 ila 12,5 miliwatt arasında ayarlayın. Simgeyi kullanarak 3D lensi etkinleştirin ve Edin düğmesine tıklayarak satın almayı başlatın.Görüntü alma işlemi boyunca lazer gücünü her 1000 karede üç artışla veya yüksek sinyal-gürültü oranını korumak için yeterli artırarak artırın. Satın alma sırasında Z düzlemini ayarlamayın. Görüntü alımından sonra, Görüntülemeyi çözümle penceresine geçiş yapma.Filtrelenmemiş görüntüde sürüklenme düzeltmesi gerçekleştirin ve filtreleri etkinleştirin. Yazıda belirtildiği gibi foton sayısını, yerelleştirme hassasiyetini, sigmaları ve çerçeve dizinini ayarlayın. Tek tek EV'lerin X ekseni boyunca bir X, Y, Z düzlemi görüntüleme aracını görüntüleme alanından kaplayın ve fotoğraf çekme olaylarının tek tek csv dosyalarını dışa aktarın.Fotoğraf çekme olaylarını ayarlanan mesafe gruplarına sabitleyen bir Çizgi Histogram aracı kullanarak X üzerindeki tek tek EV'leri, X x Y görüş alanındaki Y eksenini ikiye ayırın. Tek EV'lerin görüntülerini alın ve bunları tif dosyaları olarak kaydedin. Z ekseni boyunca yerleşime göre bir 3B görselleştirme aracı ve rengi kullanarak tek tek EV'lerin 3B videolarını oluşturun.X, Y ekseninde ortalama 16 nanometre ve Z ekseninde 38 nanometre hata üreten mikroskobun kalibrasyonunun ardından, saflaştırılmış u20'ler EV'ler X, Y ekseninde 20 nanometreye kadar çözünürlük ve Z ekseni boyunca 50 nanometre ile başarıyla görselleştirildi. Lazer gücü arttıkça 10.000 kare pozlama boyunca 3D fotoğraflarda dSTORM aracılığıyla görselleştirilen bireysel EV'ler, elde edilen görüntüde kolayca belirgindi. Z düzleminde alım sonrası görüntü düzeltmesi, foton sayıları, sigmalar ve yeniden yapılanan görüntünün yerelleştirme hassasiyeti, EV'nin 3D olarak net bir şekilde çözülmesine neden oldu.EV fotoğrafları, sağ üst köşedeki gösterge tarafından görüldüğü gibi, yalnızca ilk 7.000 kare sırasında yeniden görüntülendi. Histogram, fotoğraf çekme olaylarının çoğunun 100 nanometre yarıçapında gerçekleştiğini doğrular, görselleştirilmiş EV'nin bir ekzozom olduğunu ve küçük çaplı EV'lerin izolasyonunun başarılı olduğunu doğrular. Hat Histogram aracı ve X, Y, Z-plane View aracı kullanılarak ayrı ayrı izlenen diğer EV'lerde gerçekleştirilen boyut dağılımı analizi, fotoğraf çekme olaylarının çoğunun merkezin 100 nanometre yarıçapında gerçekleştiğini doğruladı.Z ekseni boyunca hata artırıldı ve eksenel eksen boyunca EV'nin uzun bir son görüntüsü üretildi. Fotoğraf çekme olayları EV boyutuyla ilişkili değildi, bu da dSTORM tabanlı karakterizasyonun ekzozomlar gibi küçük EV'ler ve çapı 100 nanometreden küçük, zarflı virüsler için kullanılabileceğini gösterdi. dSTORM gerçekleştirirken, ilk lazer gücünü çok düşük ayarlamayı ve fotobleaching'i önlemek için görüntü alımı boyunca yavaşça yükseltmeyi hatırlamak önemlidir.Gelişiminden bu yana, dSTORM araştırmacıların tipik ışık mikroskopisinin kırınım sınırı nedeniyle daha önce görselleştirilmesi imkansız olan hücre altı yapıların morfolojisini daha iyi anlamalarını sağladı.

direct-stochastic-optical-reconstruction-microscopy-extracellular

Research

JoVE Journal

Biology

Biyoloji

Bu makale, negatif boyama elektron mikroskobu (EM) kullanarak biyolojik makromoleküllerin üç boyutlu (3B) rekonstrüksiyonu almak için standart bir yöntem açıklanır. Bu protokolde, rasgele konik eğim rekonstrüksiyon yöntemi (RCT) ile orta çözünürlükte Saccharomyces cerevisiae exosome kompleks 3D yapısı nasıl açıklayabilir.

Rastgele Konik Tilt Yöntemiyle Exosome Kompleksi Tek Parçacık Elektron Mikroskobu İmar

Bu videoda, hücre dışı veziküllerin veya EV'lerin hücresel alımını görselleştirmek ve ölçmek için bir test gösteriyoruz. Bu test, konfokal bir mikroskop kullanarak 3D floresan görüntülemeyi kullanır ve içselleştirilmiş EV'leri hücre yüzeyine yapışanlardan ayırt etmeye izin verir.

Hücre Dışı Vezikül Alım Testi: 3D Floresan Görüntüleme Tekniği Kullanarak Hücre Dışı Veziküllerin Hücresel Alımını Görselleştirmek ve Ölçmek İçin Bir Yöntem

Dört boyutlu (4D) görüntüleme omurgalı sinir terminalleri canlı endozomlar iki tip arasındaki davranış ve etkileşimleri incelemek için kullanılmaktadır. Bu küçük yapıların hareketi gibi endozom füzyon ve ekzositoz gibi olayların onay izin, üç boyutlu olarak karakterize edilir.

Dört boyutlu Floresans Görüntüleme ile Sinir Terminalleri Yaşayan endozom Dinamiği Görselleştirme

Bu video protokolünde, modifiye edilmiş iki fotonlu bir mikroskopta orbital izleme yöntemini kullanarak, canlı hücreler içindeki floresan olarak işaretlenmiş lizozomları - yüksek hızda ve üç boyutta - izliyoruz.

Modifiye İki foton mikroskop 3D Orbital Takip: Hücre içi veziküllerin İzlemeye Bir Uygulama

Bu metodoloji genel amacı en iyi deneysel koşullar numune hazırlama resim alma ve yeniden yapılanma için 2D çift renk dSTORM görüntülerini mikrotübüller ve ara filamentler sabit hücrelerde gerçekleştirmek için...

Ara filamentler ve mikrotübüller 2 boyutlu doğrudan Stokastik optik imar mikroskobu ile görüntüleme

Bu protokol, canlı üç boyutlu görüntüleme için bakteri örneklerinin nasıl hazırlanacağını ve monte edilebildiğini ve bu görüntülerden E. coli'nin üç boyutlu şeklinin nasıl yeniden yapılandırılabildiğini açıklar.

Doğru Hücresel Temsiller ve Hassas Protein Lokalizasyonu için Bakteri Hücrelerinin Üç Boyutlu Görüntülemesi

Çip tabanlı süper çözünürlüklü optik mikroskopi floresan mikroskobu için yeni bir yaklaşım dır ve maliyet etkinliği ve iş akışı avantajları sunuyor. Burada TIRF mikroskobu ve lokalizasyon tabanlı süper çözünürlüklü mikroskopi için çip hazırlama ve görüntüleme protokolleri gösterilmiştir.

Fotonik Çip Kullanarak Yüksek İşLeç Toplam İç Yansıma Floresansı ve Direkt Stokastik Optik Rekonstrüksiyon Mikroskobu

Hücre dışı veziklinler (EV' ler) hücresel biyolojiye ve hücreler arası iletişime katkıda bulunur. Hücrelerin ALDıĞı EV'leri görselleştirmek ve ölçmek için pratik tahlillere ihtiyaç vardır. Mevcut protokol, nano filtrasyon tabanlı bir mikroakışkan cihaz tarafından EV izolasyonunu takiben konfokal mikroskopi yoluyla üç boyutlu floresan görüntüleme kullanarak EV alma testini önermektedir.

Konfokal Mikroskop Görüntüleme Analizi ile Hücre Dışı Veziklin Alımı Analizi

Bu makalede, kapsüllenmiş sitoiskelet proteinleri ile dev unilamellar veziküllerin hızlı üretimi için basit bir yöntem tanıtılmaktadır. Yöntemin, hapsetmede ve sitoiskelet-membran etkileşimlerinde sitoiskelet yapılarının aşağıdan yukarıya doğru resulaştırılmasında yararlı olduğu kanıtlanmıştır.

Yeniden Yapılandırılmış Hücre İskeletinin Dev Unilameller Veziküller İçinde Hızlı Kapsüllenmesi

Bodrum zarı, gelişim sırasında doku ve organ morfogenezi için gereklidir. Bu yapının uygun şekilde yerleştirilmesine yol açan mekanizmaları daha iyi anlamak için, sunulan protokol, konfokal ve süper çözünürlüklü mikroskopi kullanarak epitel hücrelerinde bazal membran proteinlerinin hücre içi kaçakçılığını ve sekresyonunu görselleştirmek ve karakterize etmek için yöntemleri açıklamaktadır.

Drosophila Oogenezi Sırasında Polarize Hücre İçi Kaçakçılığın ve Bazalton Membran Proteinlerinin Sekresyonunun Konfokal ve Süper Rezolüsyonlu Görüntülenmesi

Bu protokol, tek objektifli, hafif tabakalı bir floresan mikroskobunun nasıl oluşturulacağını ve hücre iskeleti ağlarını görselleştirmek için kullanımını ayrıntılı olarak açıklar.

Hücre iskeleti ağlarının görselleştirilmesi için özelleştirilebilir, tek objektifli, ışık tabakalı floresan mikroskobunun tasarımı ve inşası

Keşfedin dSTORM ile hücre dışı veziküllerin üç boyutlu süper çözünürlüklü görüntülenmesini. Bu yöntem nanometre ölçeğinde EV yapısını aydınlatır ve SARS-CoV-2 gibi viral enfeksiyonlarda biyobelirteç keşfi için güçlü bir araç sunar.

Hücre Dışı Veziküllerin Üç Boyutlu Doğrudan Stokastik Optik Rekonstrüksiyon Mikroskopisi

Daha fazla video keşfet