İnositol Pirofosfatların Kapiler Elektroforez Elektrosprey İyonizasyon Kütle Spektrometrisi ile Mutlak Kantitasyonu
13 Ağustos 2021
Memeli hücre ekstraktlarından inositol pirofosfatların mutlak kantitasyonu için kılcal elektroforez elektrosprey iyonizasyon kütle spektrometrisi için bir prosedür tanımlanmıştır.
Bu, şimdiye kadar test ettiğimiz tüm organizmalarda inositol fosfat metabolizması için yüksek kaliteli sonuçlar sağlar. Ayrıca, şu anda farkında olduğumuz yeni hücresel biyosentetik yol hakkında fikir verecektir. İnositol fosfat metabolizmasının CE-ESI-MS ile analizi daha hızlı, oldukça hassastır ve inositol fosfat düzenekleri için yapı bilgisi sağlayabilir.
Başlamak için, ticari bir CE sisteminden oluşan bir Kapiler Elektroforez Elektrosprey İyonizasyon Kütle Spektrometresi veya CE-ESI-MS sistemi ve bir Agilent Jet Stream ESI kaynağı ile donatılmış üçlü bir dörtlü dörtlü tandem kütle spektrometresi kurun. Daha sonra, kılıf akışı 1:100 ayırıcıyı ve izokratik sıvı kromatografisi pompa çıkışını bağlayın ve CE sistemi giriş şişesinin kütle analizörünün püskürtücü ucuyla aynı yükseklikte olduğundan emin olun. Ardından, tüm sistemi ve veri toplama ve analizini kontrol etmek için MassHunter Workstation sürümünü veya benzer MS yazılımını kullanın.
CE çalışma tamponunu ve kılıf sıvısını hazırladıktan sonra, kılıf sıvısını beş dakika boyunca dakikada beş mililitrede temizleyerek takın. Ardından akış hızını dakikada bir mililitreye ve pompa basıncını 180 bar'a ayarlayın. Geri dönüştürülmüş borunun, çözücüyü yeniden kullanmak için kılıf sıvı şişesine geri bağlandığından emin olun.
Daha sonra, dönen elmas bıçaklı bir kılcal kolon kesici kullanarak, bir UV algılama penceresiyle bir CE-MS kılcal damarının her iki ucunu düzgün bir şekilde kesin. Daha sonra her iki uçtaki iki ila üç santimetre poliimid kaplamayı daha hafif bir şekilde çıkarın ve kılcal yüzeyi İzopropanol ile temizleyin. Kılcal damarı monte etmek için, kılcal damarı CE-MS kasetiyle eşleştirin.
Ardından Kaseti Değiştir düğmesine tıklayın ve kaseti CE cihazına takın. Kılcal damarı aktive etmek için, önce kılcal damarı bir molar sodyum hidroksit ile yıkayın, ardından 10 dakika boyunca su ve ardından 15 dakika boyunca CE çalışma tamponu ile yıkayın. Ardından, kılcal damarı CE-MS püskürtücüsüne yerleştirin.
Bir büyüteç ve püskürtücüdeki ayar vidasını kullanarak, kılcal çıkışı hassas bir şekilde ayarlayarak kılcal ucun püskürtücü ucundan yaklaşık 0,1 milimetre dışarı çıkıntı yapmasını sağlayın. ESI püskürtücünün stabilitesini Tam Tarama modunda kontrol edin. Toplam iyon elektroferogramlarının dalgalanması% 5 içinde olmalıdırDaha sonra, inositol fosfat standartları ile bir test çalışması yapın.
İç standartlar karışımını hazırladıktan sonra, numunenin 10 mikrolitresini 0,5 mikrolitre iç standartlar karışımı ve bir CE numune şişesi ile karıştırın. Yenileme sistemini kullanırken, Şişeyi Değiştir düğmesine tıklayın. Hazırlanan 250 mililitre CE çalışma tamponunu elektrolit şişesine koyun.
Ardından, yenileme iğnesini bir su şişesinde tutan Temiz Tüpler'e tıklayın. ESI ve MS parametrelerini ayarlayın. Ardından, inositol polifosfat standartlarının bir karışımına sahip bir kaynak optimize edici ve tüm standartlarla MassHunter Optimizer kullanarak çoklu reaksiyon izleme ayarları kullanarak kaynak parametrelerini optimize edin.
Daha sonra, inositol fosfat ekstraktları için bir çalışma yapın ve sonuçları kontrol edin. Daha fazla örnek olduğunda bir sıra ayarlayın. Ölçümden sonra, MS'in Bekleme modunda olmasına izin verin ve sıvı kromatografisi pompasını kapatmayın.
Kılıf sıvı beslemesi olmadığında CE-ESI-MS duasını bir LC-ESI-MS duası ile değiştirin. Veri analizi için Kantitatif Analiz yazılımını açın ve tüm numuneler için bir toplu iş oluşturun. Daha sonra, elde edilen çoklu reaksiyon izleme verilerinden yeni bir yöntem oluşturun ve Karbon-13 inositol fosfatlarını iç standartlar olarak ayarlayın.
Ardından, Çoklu Reaksiyon İzleme Bileşiği, Tutma Süresi, dahili standartlar, Konsantrasyon ve Niteleyici kurulumunu kontrol edin. Yöntemi geçerli toplu işleme uygulamak için Doğrulama ve Çıkış'ı geçin. Yöntemi kaydedin.
Ardından, partideki her tepe noktasının doğru şekilde entegre edilip edilmediğini kontrol edin. Aksi takdirde, tepe noktasını manuel olarak entegre edin. Sonuçları bir elektronik tabloya aktarın ve anolit tepe tepkisini, bilinen konsantrasyonlara sahip kararlı izotop etiketli iç standartların ilgili tepe tepkisiyle karşılaştırarak inositol pirofosfatları ölçün.
Son olarak, inositol fosfatta ölçülen konsantrasyonla, çözeltiyi ve hacmini ekstrakte edin, mutlak miktarları hesaplayın ve miktarı hücre sayımlarına veya protein içeriğine göre normalleştirin. HCT116 hücrelerinin hücre sayılarına ve ortalama hücre hacmine göre hücresel konsantrasyonu hesaplayın. İki mikromol konsantrasyonunda inositol pirofosfat standartlarının ekstrakte edilmiş iyon elektroferogramları burada gösterilmiştir.
Memelilerde inositol pirofosfatların basitleştirilmiş yapıları ile metabolizması eklenir. University College London veya UCL'den HCT116 hücrelerinin bir CE-ESI-MS çalışması burada gösterilmiştir. CE-MS, UCL'den HCT116 hücreleri ile NIH'den gelen hücreler arasındaki IP8 seviyelerindeki varyasyonu ölçmek için kullanıldı.
UCL'den HCT116 hücreleri, NIH'den gelenlerden yedi kat daha yüksek IP8 seviyeleri içerir. HCT116 UCL hücrelerinde 1, 5-IP8'in önemli ölçüde birikmesi, 1-IP7'deki önemli bir artışla paraleldir. NIH'den sodyum florür ile muamele edilmiş HCT116 hücrelerinin CE-ESI-MS analizi, IP6'da bir azalma ve 5-PPIP4 görünümü ile birlikte 5-IP7'lik bir yükselme göstermiştir.
1-IP7 seviyeleri bir dereceye kadar azalmış olsa da, sodyum florürle muamele edilmiş hücrelerde tamamen bulunmamakla birlikte, çoğunlukla tespit sınırının altındadır. Kararlı bir CE-ESI-MS derecesi oluşturmak önemlidir. Ölçümlerden önce sistemin tekrarlanabilirliğini ve hassasiyetini kontrol etmenizi öneririz.
Bu teknik, inositol fosfat metabolizmasının, implantların ve dokuların sağlanmasına izin verir ve ayrıca biyolojik olarak ilgili inositol pirofosfatı yakından incelemek için bir fırsat sağlar.
Genel Bakış
Bu makale, memeli hücre ekstrelerinden inozitol pirofosfatları kantitize etmek için kılcal elektroforez elektrosprey iyonizasyon kütle spektrometrisi (CE-ESI-MS) prosedürünü açıklar. Yöntem, hızı, hassasiyeti ve inozitol fosfat bileşimleri hakkında yapısal bilgi sağlama kabiliyeti ile bilinir.
Çalışmanın Temel Bileşenleri
Bilim Alanı
- Kütle Spektrometrisi
- Biyokimya
- Hücre Biyolojisi
Arka Plan
- Inozitol pirofosfatlar hücresel sinyallemede önemli bir rol oynar.
- Metabolizmalarını anlamak, çeşitli biyolojik süreçler hakkında bilgi sağlayabilir.
- CE-ESI-MS hızlı ve hassas bir analiz yöntemi sunar.
- Önceki yöntemler, CE-ESI-MS tarafından sağlanan verimlilik ve ayrıntıya sahip değildi.
Çalışmanın Amacı
- İnozitol pirofosfatları kantitize etmek için güvenilir bir yöntem kurmak.
- Memeli hücrelerde inozitol fosfat metabolizmasını analiz etmek.
- Farklı hücre hatları arasında inozitol pirofosfat seviyelerindeki değişimleri keşfetmek.
Kullanılan Yöntemler
- Spesifik ekipman konfigürasyonları ile bir CE-ESI-MS sistemi kurmak.
- CE çalışma tamponu ve kılıf sıvısı hazırlamak.
- Optimal performans için kılcal damarın yıkanması ve aktive edilmesi.
- MassHunter yazılımı kullanılarak veri toplama ve analizi.
Ana Sonuçlar
- CE-ESI-MS, HCT116 hücrelerinde inozitol pirofosfat seviyelerini başarıyla kantitize etti.
- Farklı kaynaklardan elde edilen HCT116 hücreleri arasında IP8 seviyelerinde önemli farklılıklar gözlendi.
- Sodyum florür tedavisi ile inozitol fosfat metabolizmasında değişiklikler kaydedildi.
- Yöntem, yüksek tekrarlanabilirlik ve hassasiyet gösterdi.
Sonuçlar
- CE-ESI-MS, inozitol fosfat metabolizmasını incelemek için değerli bir araçtır.
- Teknik, hücresel biyosentetik yolları anlamamızı artırabilir.
- Gelecekteki uygulamalar, çeşitli biyolojik bağlamlarda inozitol fosfatlar üzerinde daha geniş çalışmalar içerebilir.
Sıkça Sorulan Sorular
Executive Industry Relevance
Accurate quantitation of inositol pyrophosphates (PP-InsPs) enables mechanistic de-risking in target validation by providing quantitative readouts of phosphate homeostasis and cellular energy charge. This CE-ESI-MS method supports assay development for intracellular signaling pathways, offering baseline separation of regioisomers and absolute concentration data. The approach enhances predictive confidence in early discovery by enabling temporal monitoring of PP-InsPs under experimental conditions, informing go/no-go decisions in preclinical model selection.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses linking PP-InsPs to metabolic signaling and insulin sensitivity pathways.
- Operational Value: Provides high-throughput, sensitive quantification of low-abundance PP-InsPs without radioactive tracers, reducing assay complexity and cost.
- Predictive Value: Supports biological de-risking by delivering absolute cellular concentrations of PP-InsPs, including minor isomers, for target confidence assessment.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Delivers baseline separation of PP-InsP regioisomers, enabling specific detection of biologically relevant species in mammalian cells.
- Operational Value: Offers reproducible, quantitative outputs via stable isotope-labeled internal standards, ensuring assay standardization across runs.
- Scalability: Facilitates platform reuse for screening compound effects on inositol phosphate metabolism in disease-relevant systems.
Translational & Preclinical Research
- Translational Continuity: Connects discovery-phase PP-InsP dynamics to preclinical validation by monitoring temporal changes in HCT116 cells under experimental conditions like sodium fluoride treatment.
- Mechanistic De-risking: Reveals alterations in IP7/IP8 levels and PPIP4 appearance, supporting pathway-specific biomarker alignment and risk-adjusted advancement decisions.
- Disease-Relevant System: Applicable to studying phosphate homeostasis and cellular energy charge in oncology and metabolic disease models.
Pipeline & Workflow Integration
The method integrates into the discovery continuum from target validation through lead identification to preclinical evaluation by supplying quantitative, structurally resolved PP-InsP data that inform mechanistic understanding and assay readiness.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway clarification by quantifying PP-InsPs as metabolic messengers surveying phosphate homeostasis and insulin sensitivity.
- Screening: Enables assay readiness through sensitive detection and baseline separation of PP-InsPs, allowing reliable compound evaluation in metabolic signaling assays.
- Analytics: Delivers quantitative dependent variable measurements (absolute concentrations, temporal changes) via MRM, enabling statistical comparison across conditions and cell lines.
- Translational Research: Connects to preclinical continuity by monitoring PP-InsP modulation in disease-relevant systems, supporting biomarker alignment and risk-adjusted decisions.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable CE-ESI-MS capability for longitudinal studies of inositol phosphate metabolism across multiple projects and therapeutic areas.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Predictive confidence through absolute quantitation of PP-InsPs, reduction of mechanistic ambiguity in inositol phosphate signaling.
- Operational Value: Standardization, reproducibility, and sensitivity achieved via CE-ESI-MS with internal standard normalization and optimized source parameters.
- Strategic Value: Better go/no-go decisions via quantitative PP-InsP readouts, capital efficiency by avoiding radioactive methods, and reduced late-stage biological risk through early pathway de-risking.
- Portfolio Impact: Risk-adjusted prioritization based on PP-InsP modulation data, enabling informed advancement of compounds affecting phosphate homeostasis and energy signaling.
Implementation Considerations
- Requires expertise in capillary electrophoresis, mass spectrometry optimization, and metabolite quantification using stable isotope-labeled standards.
- Needs instrumentation including a commercial CE system, triple quadrupole MS with Agilent Jet Stream ESI source, and MassHunter software for data acquisition and analysis.
- Demands cross-team standardization of CE running buffer preparation, sheath liquid flow rates (1 mL/min), and capillary installation procedures to ensure ESI spray stability (<5% TIC fluctuation).
- Involves adaptation considerations for different sample types (cells, tissues) requiring normalization to cell counts or protein content and appropriate internal standard selection.
- Includes practical limitations such as the need for system repeatability and sensitivity checks before measurements, and potential interference from high-abundance inositol phosphates during method development.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:04
Introduction
0:45
Setting Up the Capillary Electrophoresis Electrospray Ionization Mass Spectrometry (CE-ESI-MS) System
1:38
Preparation of Buffer, Capillary, and CE-MS System
3:28
Performing the CE-ESI-MS Runs
5:10
Data Analysis
6:50
Results: Quantitation of Inositol Pyrophosphates from Mammalian Cell Extracts by Capillary Electrophoresis Electrospray Ionization Mass Spectrometry
8:35
Conclusion
