Name: RNA Aptamerleri ve Riboswitchleri kodlayan DNA Plazmidleri ile Yüklü Çok Fonksiyonlu İpek Bazlı Mikrokapsüllerin Hazırlanması (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-10-08T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 7 s
Description: Keşfedin ipek fibroin mikrokapsüllerinde DNA plazmid immobilizasyonu ile çok fonksiyonlu biyosensörlerin hazırlanmasını. Bu yöntem, gen aktivasyonu kinetiğini in vitro ortamda çalışmak için araştırmacılara olanak tanır.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Bu çalışma, Hava Kuvvetleri Bilimsel Araştırma Ofisi'nden LRIR 16RH3003J hibesi ve ABD Savunma Bakanlığı Araştırma ve Mühendislik Müsteşarlığı Ofisi'nin S&T Önceliklerinin Geliştirilmesi için Askeri Ortamlar için Sentetik Biyoloji Uygulamalı Araştırma (ARAP) programı ile desteklenmiştir.
ThyRS için plazmid vektör dizisi (pSALv-RS-GFPa1, 3.4 kb) Dr. J. Gallivan tarafından cömertçe sağlanmıştır. Bombyx mori'den ipekböceği kozaları, Tufts Üniversitesi, MA'dan Dr. D.L. Kaplan tarafından cömertçe bağışlandı.

<ol><li>Slomovic, S., Pardee, K., Collins, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synthetic+biology+devices+for+in+vitro+and+in+vivo+diagnostics%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Synthetic biology devices for in vitro and in vivo diagnostics.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (47), 14429-14435 (2015).</li>
<li>Harbaugh, S. V., Goodson, M. S., Dillon, K., Zabarnick, S., Kelley-Loughnane, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Riboswitch-based+reversible+dual-color+sensor%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Synthetic+Biology%22%5BJournal%5D)">Riboswitch-based reversible dual-color sensor.</a> ACS Synthetic Biology. 6 (5), 766-781 (2017).</li>
<li>König, H., Frank, D., Heil, R., Coenen, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synthetic+genomics+and+synthetic+biology+applications+between+hopes+and+concerns%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Genomics%22%5BJournal%5D)">Synthetic genomics and synthetic biology applications between hopes and concerns.</a> Current Genomics. 14 (1), 11-24 (2013).</li>
<li>Silverman, A. D., Karim, A. S., Jewett, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell-free+gene+expression%3A+An+expanded+repertoire+of+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Genetics%22%5BJournal%5D)">Cell-free gene expression: An expanded repertoire of applications.</a> Nature Reviews Genetics. 21, 151-170 (2020).</li>
<li>Chushak, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+synthetic+riboswitch+in+cell-free+protein+expression+systems%5BTitle%5D)+AND+%22RNA+Biology%22%5BJournal%5D)">Characterization of synthetic riboswitch in cell-free protein expression systems.</a> RNA Biology. , 1-12 (2021).</li>
<li>Cole, S. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantification+of+interlaboratory+cell-free+protein+synthesis+variability%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Synthetic+Biology%22%5BJournal%5D)">Quantification of interlaboratory cell-free protein synthesis variability.</a> ACS Synthetic Biology. 8 (9), 2080-2091 (2019).</li>
<li>Thavarajah, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Point-of-use+detection+of+environmental+fluoride+via+a+cell-free+riboswitch-based+biosensor%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Synthetic+Biology%22%5BJournal%5D)">Point-of-use detection of environmental fluoride via a cell-free riboswitch-based biosensor.</a> ACS Synthetic Biology. 9 (1), 10-18 (2020).</li>
<li>Grӓwe, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+paper-based%2C+cell-free+biosensor+system+for+the+detection+of+heavy+metals+and+date+rape+drugs%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">A paper-based, cell-free biosensor system for the detection of heavy metals and date rape drugs.</a> PLoS One. 14 (3), 0210940(2019).</li>
<li>Lin, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Portable+environment-signal+detection+biosensors+with+cell-free+synthetic+biosystems%5BTitle%5D)+AND+%22RSC+Advances%22%5BJournal%5D)">Portable environment-signal detection biosensors with cell-free synthetic biosystems.</a> RSC Advances. 10 (64), 39261-39265 (2020).</li>
<li>Caschera, F., Lee, J. W., Ho, K. K. Y., Liu, A. P., Jewett, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell-free+compartmentalized+protein+synthesis+inside+double+emulsion+templated+liposomes+with+in+vitro+synthesized+and+assembled+ribosomes%5BTitle%5D)+AND+%22Chemical+Communications%22%5BJournal%5D)">Cell-free compartmentalized protein synthesis inside double emulsion templated liposomes with in vitro synthesized and assembled ribosomes.</a> Chemical Communications. 52 (31), 5467-5469 (2016).</li>
<li>Niederholtmeyer, H., Chaggan, C., Devaraj, N. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Communication+and+quorum+sensing+in+non-living+mimics+of+eukaryotic+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Communication and quorum sensing in non-living mimics of eukaryotic cells.</a> Nature Communications. 9, 5027(2018).</li>
<li>Timin, A. S., Gould, D. J., Sukkhorukov, G. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multi-layer+microcapsules%3A+Fresh+insights+and+new+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Expert+Opinion+on+Drug+Delivery%22%5BJournal%5D)">Multi-layer microcapsules: Fresh insights and new applications.</a> Expert Opinion on Drug Delivery. 14 (5), 583-587 (2017).</li>
<li>Bomati, E. K., Haley, J. E., Noel, J. P., Deheyn, D. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spectral+and+structural+comparison+between+bright+and+dim+green+fluorescent+proteins+in+Amphioxus%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Spectral and structural comparison between bright and dim green fluorescent proteins in Amphioxus.</a> Scientific Reports. 4, 5469(2014).</li>
<li>Frey, B. Amplification of Genomic DNA by PCR. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aFrey%2C+B+%22Molecular+Diagnosis+of+Infectious+Diseases.+Methods+in+Molecular+Medicine%22">Molecular Diagnosis of Infectious Diseases. Methods in Molecular Medicine</a>. Reischl, U. 13, Humana Press. Totowa, NJ. 143-156 (1998).</li>
<li>Lee, P. Y., Costumbrado, J., Hsu, C. -Y., Kim, Y. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Agarose+gel+electrophoresis+for+the+separation+of+DNA+fragments%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Agarose gel electrophoresis for the separation of DNA fragments.</a> Journal of Visualized Experiments. (62), e3923(2012).</li>
<li>Zhou, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+regeneration+and+reuse+of+silica+columns+from+PCR+purification+and+gel+extraction+kits%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Rapid regeneration and reuse of silica columns from PCR purification and gel extraction kits.</a> Scientific Reports. 8, 12870(2018).</li>
<li>Kostylev, M., Otwell, A. E., Richardson, R. E., Suzuki, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cloning+should+be+simple%3A+Escherichia+coli+DH5%CE%B1-mediated+assembly+of+multiple+DNA+fragments+with+short+end+homologies%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Cloning should be simple: Escherichia coli DH5α-mediated assembly of multiple DNA fragments with short end homologies.</a> PLoS One. 10 (9), 0137466(2015).</li>
<li>Rockwood, D. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Materials+fabrication+from+Bombyx+mori+silk+fibroin%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Materials fabrication from Bombyx mori silk fibroin.</a> Nature Protocols. 6 (10), 1612-1631 (2011).</li>
<li>Drachuk, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Silk+macromolecules+with+amino+acid-Poly%28Ethylene+Glycol%29+grafts+for+controlling+layer-by-layer+encapsulation+and+aggregation+of+recombinant+bacterial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Nano%22%5BJournal%5D)">Silk macromolecules with amino acid-Poly(Ethylene Glycol) grafts for controlling layer-by-layer encapsulation and aggregation of recombinant bacterial cells.</a> ACS Nano. 9 (2), 1219-1235 (2015).</li>
<li>Antipov, A. A., Sukhorukov, G. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Polyelectrolyte+multilayer+capsules+as+vehicles+with+tunable+permeability%5BTitle%5D)+AND+%22Advances+in+Colloid+and+Interface+Science%22%5BJournal%5D)">Polyelectrolyte multilayer capsules as vehicles with tunable permeability.</a> Advances in Colloid and Interface Science. 111 (1-2), 49-61 (2004).</li>
<li>Drachuk, I., Harbaugh, S., Chávez, J. L., Kelley-Loughnane, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improving+the+activity+of+DNA-encoded+sensing+elements+through+confinement+in+silk+microcapsules%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Applied+Materials+%26+Interfaces%22%5BJournal%5D)">Improving the activity of DNA-encoded sensing elements through confinement in silk microcapsules.</a> ACS Applied Materials & Interfaces. 12 (43), 48329-48339 (2020).</li>
<li>Melnikov, S., Ben-Shem, A., Garreau de Loubresse, N., Jenner, L., Yusupova, G., Yusupov, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+basis+for+the+inhibition+of+the+eukaryotic+ribosome%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Structural+%26+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Structural basis for the inhibition of the eukaryotic ribosome.</a> Nature Structural & Molecular Biology. 19 (6), 560-567 (2012).</li>
<li>Zhao, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+future+of+layer-by-layer+assembly%3A+A+tribute+to+ACS+Nano+associate+editor+Helmuth+M%C3%B6hwald%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Nano%22%5BJournal%5D)">The future of layer-by-layer assembly: A tribute to ACS Nano associate editor Helmuth Möhwald.</a> ACS Nano. 13 (6), 6151-6169 (2019).</li>
<li>Main, K. H. S., Provan, J. I., Haynes, P. J., Wells, G., Hartley, J. A., Pyne, A. L. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Atomic+force+microscopy-A+tool+for+structural+and+translational+DNA+research%5BTitle%5D)+AND+%22APL+Bioengineering%22%5BJournal%5D)">Atomic force microscopy-A tool for structural and translational DNA research.</a> APL Bioengineering. 5, 031504(2021).</li>
<li>Riera, R., Feiner-Gracia, N., Fornaguera, C., Cascante, A., Borrós, S., Albertazzi, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tracking+the+DNA+complexation+state+of+pBAE+polyplexes+in+cells+with+super+resolution+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Nanoscale%22%5BJournal%5D)">Tracking the DNA complexation state of pBAE polyplexes in cells with super resolution microscopy.</a> Nanoscale. 11 (38), 17869-17877 (2019).</li>
<li>Bilokapic, S., Strauss, M., Halic, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cryo-EM+of+nucleosome+core+particle+interactions+in+trans%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Cryo-EM of nucleosome core particle interactions in trans.</a> Scientific Reports. 8, 7046(2018).</li>
<li>Pritchard, E. M., Dennis, P. B., Omenetto, F., Naik, R. R., Kaplan, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Physical+and+chemical+aspects+of+stabilization+of+compounds+in+silk%5BTitle%5D)+AND+%22Biopolymers%22%5BJournal%5D)">Physical and chemical aspects of stabilization of compounds in silk.</a> Biopolymers. 97 (6), 479-498 (2012).</li>
<li>Fritz, B. R., Jamil, O. K., Jewett, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Implications+of+macromolecular+crowding+and+reducing+conditions+for+in+vitro+ribosome+construction%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">Implications of macromolecular crowding and reducing conditions for in vitro ribosome construction.</a> Nucleic Acids Research. 43 (9), 4774-4784 (2015).</li>
<li>Ge, X., Luo, D., Xu, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell-free+protein+expression+under+macromolecular+crowding+conditions%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Cell-free protein expression under macromolecular crowding conditions.</a> PLoS One. 6 (12), 28707(2011).</li>
<li>Cawte, A. D., Unrau, P. J., Rueda, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Live+cell+imaging+of+single+RNA+molecules+with+fluorogenic+mango+II+arrays%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Live cell imaging of single RNA molecules with fluorogenic mango II arrays.</a> Nature Communications. 11, 1283(2020).</li>
<li>Chen, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualizing+RNA+dynamics+in+live+cells+with+bright+and+stable+fluorescent+RNAs%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Visualizing RNA dynamics in live cells with bright and stable fluorescent RNAs.</a> Nature Biotechnology. 37 (11), 1287-1293 (2019).</li>
</ol>

Burada sunulan görüş ve düşünceler yazarların görüşleridir ve mutlaka DoD'nin veya Bileşenlerinin görüşlerini temsil etmez

Bu protokolü takiben çeşitli DNA kodlu sensör tasarımları ile yüklenen seçici geçirgen hidrojel mikrokapsüller hazırlanabilir. LbL yaklaşımının ayırt edici özelliklerinden biri, genellikle moleküler türlerin kurban şablonları üzerinde adsorpsiyonuyla başlayan aşağıdan yukarıya montaj sırasında mikrokapsüllerin karmaşıklığını uyarlama yeteneğidir. İlk bileşenlerin konsantrasyonlarını, pH koşullarını ve katman sayısını dikkatlice ayarlayarak, farklı DNA yükleme parametrelerine, işlevselliğine ve ayarlanabilir geçirgenliğin...

Sentetik biyoloji alanı, çevrelerini ve potansiyel tehditlerini izlemek için mikroorganizmalar tarafından geliştirilen doğal mekanizmalardan yararlanarak algılama yeteneklerini geliştirmek için eşsiz fırsatlar sunmaktadır. Önemli olarak, bu algılama mekanizmaları tipik olarak bu mikroorganizmaları zararlı maruziyetten koruyan, olumsuz etkileri hafifletmek veya toksik maddelerin alımını önlemek için gen ekspresyonunu düzenleyen bir yanıtla bağlantılıdır. Bu mikroorganizmaları, bu doğal tepkilerden yararlanarak tüm hücre sensörleri oluşturmak üzere tasarlamak, ancak yeni hedefleri tanımak ve / veya nicelleştirme amacıyla (tipik olarak floresan) ölçülebilen ölçülebilir bir sinyal üretmek için yeniden yönlendirmek için önemli çabalar sarf edilmiştir1,2. Şu anda, genetiği değiştirilmiş mikroorganizmaların (GDO'lar) kullanımıyla ilgili endişeler, özellikle çevrede veya insan vücudunda salınırken, tüm hücrelerin veya genetik materyallerinin bir kısmının sızması nedeniyle, bir polimer matrisinde kapsüllenmiş olsa bile, bu algılama yaklaşımlarından yararlanmak için alternatif yollara ihtiyaç duyulduğunu göstermektedir3.
GDO'ların konuşlandırılması endişesi olmadan mikroorganizma bazlı algılamanın faydalarından yararlanmak için güçlü bir yaklaşım, in vitro transkripsiyon / translasyon (IVTT) sistemlerinin kullanılmasıdır. Pratik bir bakış açısıyla, IVTT sistemleri, hücre bileşenlerinin çoğunu, sonikasyon, boncuk dövme veya diğerleri de dahil olmak üzere hücrelerden farklı yollarla "ekstrakte edilmiş" aktif bir durumda içeren bir karışımdan oluşur4. Bu işlemin nihai ürünü, tüm hücrelerin kullanımıyla ilişkili kısıtlamalar (membran difüzyonu, transformasyon verimliliği, hücre toksisitesi, vb.) olmaksızın, farklı sensörleri "açık kap" formatında test etmek için kullanılabilecek transkripsiyon ve translasyon gerçekleştirmek için zaten optimize edilmiş bir biyokimyasal reaksiyon karışımıdır. Önemli olarak, farklı sensör bileşenleri nicel olarak eklenebilir ve etkileri, gösterdiğimiz gibi farklı optik ve spektrometrik tekniklerle incelenebilir5. IVTT sistemlerinin performansının tutarsız olabileceği fark edilmiştir; Bununla birlikte, son zamanlarda yapılan çalışmalar, sensör tasarımı6'daki performanslarını incelerken çok yardımcı olan hazırlık ve karakterizasyonlarını standartlaştırmak için yaklaşımlar göstermiştir. Son zamanlarda, kağıt matrislerindeki bileşenlerinin liyofilizasyonu yoluyla kağıt bazlı tahliller oluşturmak için kullanılan IVTT sistemlerinin birçok örneği, ağır metal iyonlarının, ilaçların, çekirdek algılama elemanlarının ve diğerlerinin tespiti de dahil olmak üzere gösterilmiştir 7,8,9. IVTT tabanlı sensörler için heyecan verici bir uygulama alanı, toprak, su ve insan vücudu dahil olmak üzere farklı ortam türlerinde algılama uygulamalarında kullanılmasıdır. Bu IVTT sistemlerini bu zorlu ortamlara dağıtmak için, IVTT bileşenlerini içermek ve bozulmaya karşı korumak için bir kapsülleme yaklaşımının uygulanması gerekir.
IVTT sistemleri için en yaygın kapsülleme yaklaşımları, lipit kapsüllerin, misellerin, polimerzomların ve diğer sıkıca kapatılmış mikro kapların kullanımını içerir10,11,12. Bu yaklaşımın bir dezavantajı, dış çevre ile iletişime izin vermek ve algılama yetenekleri sağlamak için malzemeleri konteynerlerin içine ve dışına taşımak için pasif veya aktif mekanizmaların dahil edilmesi ihtiyacıdır. Bu sorunların bazılarının üstesinden gelmek için, buradaki çalışma, IVTT sistemlerinde ifade edilecek farklı sensör tasarımları için kodlama malzemelerini kapsüllemek için basit ama etkili bir yaklaşım sağlayan bir yöntem bildirmektedir. Bu yaklaşım, korunan genetik materyalin tercih edilen IVTT'nin farklı bileşenleri ile etkileşime girmesini sağlayan, yüksek gözenekliliğe sahip içi boş mikrokapsüller oluşturmak için ilgili plazmidlerin varlığında bir biyopolimerin Katman Katman (LbL) birikiminin kullanılmasına dayanmaktadır. Çalışma, kapsüllenmiş plazmidlerin, plazmid kodlu bir aptamer ve bir riboswitch'in karşılık gelen hedeflerine tepkisiyle gösterildiği gibi, bu polimerik matris içinde aktive edildiğinde transkripsiyon ve translasyonu yönlendirebileceğini göstermiştir. Ek olarak, bu LbL kaplama, plazmidleri herhangi bir özel depolama koşulu olmadan aylarca korur.

<table><tbody><tr><td>(Z)-4-(3,5-difloro-4-hidroksibenziliden)-2-metil-1-(2,2,2-trifloroetil)-1H-imidazol-5(4 H)-on (DFHBI-1T)</td><td>Lucerna</td><td>DFHBI-1T</td><td></td></tr><tr><td>5x T4 DNA Ligaz Tamponu</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>46300-018</td><td></td></tr><tr><td>6x Mavi Jel Yükleme Boyası</td><td>New England BioLabs</td><td>B7021S</td><td></td></tr><tr><td>96 oyuklu plakalar, siyah dairesel</td><td>Corning</td><td>3601</td><td></td></tr><tr><td>Agarose</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9539</td><td>BioReagent, moleküler biyoloji için, düşük EEO</td></tr><tr><td>Ampisilin sodyum tuzu</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A0166</td><td>tozu veya kristalleri, BioReagent, hücre kültürü için uygun</td></tr><tr><td>BlpI kısıtlama enzimleri</td><td>New England BioLabs</td><td>R0585S</td><td></td></tr><tr><td>Corning Tek Kullanımlık Vakum Filtresi / Depolama Sistemleri</td><td>FisherScientific</td><td>09-761-1</td><td></td></tr><tr><td>Dimetil sülfoksit, DMSO</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>472301</td><td>ACS reaktifi, vb; %99,9</td></tr> <tr><td>DNA Plazmid, pET28c-F30-2x Brokoli (5.4 kb), BrocApt.</td><td>Addgene</td><td>Plasmid # 66788</td><td></td></tr><tr><td>DyLightTM550 Antikor Etiketleme kiti (Invitrogen)</td> <td>ThermoFisher Scientific</td><td>84530</td><td></td></tr><tr><td>E. coli S30 dairesel DNA için ekstrakt sistemi</td><td>Promega</td><td>L1020</td><td></td></tr><tr><td>Falcon Konik santrifüj tüpleri, 15 mL</td><td>FisherScientific</td><td>14-959-53A</td><td></td></tr><tr><td>Falcon Konik santrifüj tüpleri, 50 mL</td><td></td><td>14-432-22</td><td></td></tr><tr><td>Fisherbrand Mikrosantrifüj tüpleri, 1.5 mL</td><td>FisherScientific</td><td>05-408-129</td><td></td></tr><tr><td>Hidroflorik asit, HF</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>695068</td><td>ACS reaktifi, %48</td></tr> <tr><td>Kanamisin sülfat</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>60615</td><td>Kanamisin A (ana bileşen) ve Kanamisin B ve C</td></tr><tr><td>KpnI kısıtlama enzimleri</td> karışımı <td>New England BioLabs</td><td>R0142S</td><td></td></tr><tr><td>100 & mikro ile desteklenmiş LB agar plakası; g / mL ampisilin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L5667</td><td>100 & mikro ile önceden dökülmüş agar plakaları; g/mL ampisilin</td></tr><tr><td>LB agar plakası 50 & mikro ile desteklenmiş; g / mL kanamisin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L0543</td><td>50 & mikro ile önceden dökülmüş agar plakaları; g/mL kanamisin</td></tr><tr><td>LB suyu (Lennox sınıfı)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L3022</td><td></td></tr><tr><td>Lityum bromür, LiBr</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>213225</td><td>ReagentPlus, & ge; %99</td></tr> <tr><td>Maksimum Verimlilik DH5-&alfa; yetkili E. coli suşu</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>18258012</td><td></td></tr><tr><td>Metanol</td><td>MilliporeSigma</td><td>322415</td><td>susuz, %99,8</td></tr> <tr><td>MilliQ-su</td><td>EMD MilliPore</td><td></td><td>Milli-Q Referans Su Arıtma Sistemi</td></tr><tr><td>MinElute PCR Arıtma Kiti</td><td>Qiagen</td><td>28004</td><td></td></tr><tr><td>N-(3-Dimetilaminopropil)-N&asal;-etilkarbodiimid hidroklorür, EDC</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E1769</td><td></td></tr><tr><td>PBS (fosfat tamponlu tuzlu su)</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>10010023</td><td>1x PBS, pH 7.4</td></tr><tr><td>Phusion Yüksek Kaliteli DNA Polimeraz</td><td>New England Biolabs</td><td>M0530S</td><td></td></tr><tr><td>Polietilenimin, dallı</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>408727</td><td>ortalama Mw ~ 25.000</td></tr><tr><td>PURExpress In Vitro Protein Sentez Kiti</td><td>New England BioLabs</td><td>E6800S</td><td></td></tr><tr><td>QIAEX II Jel Ekstraksiyon Kiti</td><td>Qiagen</td><td>20021</td><td></td></tr><tr><td>QIAprep Spin Miniprep Kiti</td><td>Qiagen</td><td>&nbsp; 27104</td><td></td></tr><tr><td>Hızlı Yüklemeli 2 Günlük DNA Merdiveni (0.1-10.0 kb)</td><td>New England BioLabs</td><td>N0469S</td><td></td></tr><tr><td>SiO? silika mikroküreler, 4.0 ve mikro; m</td><td>Polibilimler A.Ş.</td><td>24331-15</td><td>%10 sulu çözelti</td></tr><tr><td>Slide-A-Lyzer G2 Diyaliz Kasetleri, 3.5K MWCO, 15 mL</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>87724</td><td></td></tr><tr><td>Sodyum karbonat, Na?CO?</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>222321</td><td>ACS reaktifi, susuz vb; %99,5, toz</td></tr><tr><td>Spektrum Spektrumu/Por Float-A-Lyzer G2 Diyaliz Cihazları</td><td>FisherScientific</td><td>08-607-008</td><td>Spektrum G235058</td></tr><tr><td>SYBR Güvenli DNA jel lekesi</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>S33102</td><td></td></tr><tr><td>T4 DNA Ligaz (5 U/&mikro; L)</td> <td>ThermoFisher Scientific</td><td>EL0011</td><td></td></tr><tr><td>Theophylline</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T1633</td><td>susuz, & % 99, toz</td></tr><tr><td>Tris Asetat-EDTA tamponu (TAE tamponu)</td> <td>Sigma-Aldrich</td><td>T6025</td><td>, 40 mM Tris-asetat ve 1 mM EDTA, pH 8.3 içerir.</td></tr><tr><td>UltraPure DNase/RNaz İçermeyen Damıtılmış Su</td><td>FisherScientific</td><td>10-977-023</td><td></td></tr><tr><td>ZymoPURE II Plazmid MaxiPrep kiti</td><td>ZymoResearch</td><td>D4202</td><td></td></tr></tbody></table>

rna aptamerleri ve riboswitch'leri kodlayan dna plazmidleri ile yüklü Çok fonksiyonlu İpek bazlı mikrokapsüllerin hazırlanması

Preparation of Multifunctional Silk-Based Microcapsules Loaded with DNA Plasmids Encoding RNA Aptamers and Riboswitches

DNA yüklü ipek fibroin mikrokapsüllerinin, kurban küresel çekirdekler üzerinde Katman Katman (LbL) montaj yöntemiyle hazırlanması için bir protokol sunuyoruz. Bir asal tabakanın ve DNA plazmidlerinin adsorpsiyonunu takiben, tek bir ipek tabakasının akut dehidrasyonu sırasında ipek sekonder yapıda β-tabakaların indüklenmesiyle sağlam mikrokapsüllerin oluşumu kolaylaştırılmıştır. Bu nedenle, katmanlama çoklu hidrojen bağı ve hidrofobik etkileşimler yoluyla gerçekleşti. Çok katmanlı kabukların adsorpsiyonu üzerine, çekirdek-kabuk yapıları, uzaktan algılama ve / veya hedeflenen teslimat için kullanılacak altın nanopartiküller (AuNP'ler) ve / veya antikorlar (IgG) ile daha da işlevselleştirilebilir. Bir polimer astarının varlığı, DNA ve ipek proteininin konsantrasyonu ve bir dizi adsorbe edilmiş katmanın yanı sıra bir dizi adsorbe edilmiş katman gibi anahtar makromoleküllerin silika çekirdekleri üzerinde sıralı birikimi sırasında birkaç anahtar parametrenin ayarlanması, değişken geçirgenlik ve DNA yüklemelerine sahip biyouyumlu, DNA yüklü mikrokapsüllerle sonuçlandı. Silika çekirdeklerinin çözünmesi üzerine, protokol, kapsül zarının iç yüzeyine hareketsiz hale getirilmiş DNA plazmidleri ile içi boş ve sağlam mikrokapsüllerin oluşumunu gösterdi. DNA plazmidleri ve dış ortam arasında seçici olarak geçirgen biyouyumlu bir zar oluşturmak, uzun süreli depolama sırasında DNA'yı korudu ve mekansal olarak sınırlandırılmış plazmidlerden gelen gelişmiş çıktı tepkisinde önemli bir rol oynadı. DNA şablonlarının aktivitesi ve erişilebilirliği, in vitro transkripsiyon ve translasyon reaksiyonları (hücresiz sistemler) sırasında test edildi. RNA ışıklandırma aptamerlerini ve riboswitchlerini kodlayan DNA plazmidleri, floresan olarak etiketlenmiş RNA transkriptlerinin veya GFPa1 proteininin kabuk zarlarında lokalizasyonu sırasında görselleştirildiği gibi, karşılık gelen analitlerle başarıyla aktive edildi.

Burada, çalışma, ipek protein kapsüllerinde kapsüllemeden sonra farklı sensör tasarımlarını (iki tip RNA tarafından düzenlenmiş transkripsiyon / translasyon elemanı) kodlayan DNA şablonlarının işlevselliğini ele almaktadır. Mikrokapsüller, anahtar bileşenlerin şablonlu Katman Katman (LbL) montajı ile hazırlandı: Bir asal katman, sensör tasarımlarını kodlayan DNA plazmidleri ve ipek fibroin biyopolimeri (Şekil 2). Makromoleküllerin katmanlı bir şekilde birikmesi, emilen tabakalar ile kabuğun ...

Protokol, sağlam ve biyouyumlu DNA yüklü mikrokapsüllerin oluşumunu, birkaç ligandı izleyebilen çoklanmış in vitro biyosensörler olarak tanımlar.

RNA Aptamerleri ve Riboswitch'leri kodlayan DNA Plazmidleri ile Yüklü Çok Fonksiyonlu İpek Bazlı Mikrokapsüllerin Hazırlanması

We introduce a protocol for the preparation of DNA-laden silk fibroin microcapsules via the Layer-by-Layer (LbL) assembly method on sacrificial spherical ...

Bu protokolün önemi, DNA plazmit şablonlarını yarı geçirgen biyouyumlu mikrokapsüllere hareketsiz hale getirerek DNA kodlu sensörleri işlevsel tutmak için bir araç sağlamasıdır. Önerilen DNA immobilizasyon tekniği çok yönlüdür. Farklı in vitro aktivasyon mekanizmalarına sahip çok işlevli biyosensörlerin üretilmesine izin verir.Bu mikrokapsüllerin, uygun algılama elemanları ile birleştiğinde, biyofilmler ve organlar gibi farklı ortamlarda sinyal moleküllerinin salınması da dahil olmak üzere farklı biyolojik süreçleri incelemek için kullanılabileceğini öngörüyoruz. Bu teknik, mikro ölçekte biyolojik sistemlere, özellikle DNA'nın hareketsiz hale getirilmesinin ve moleküler kalabalıklaşmanın gen aktivasyonunun kinetiğini ve mekanizmasını nasıl etkileyebileceğine dair içgörüler sağlayabilir. İki mililitrelik bir mikrosantrifüj tüpündeki 300 mikrolitrelik mikropartiküllere bir mililitre polietilenimin çözeltisi ekleyerek polietilenimin ana tabakasının kurban silika veya SiO2 mikropartikülleri üzerine biriktirilmesiyle başlayın.Karışımı, ortam koşullarında dakikada 800 devirde bir ThermoMixer üzerinde çalkalayın. Mikropartikülleri oda sıcaklığında bir dakika boyunca 0.2 g'da santrifüjleme ile toplayın ve süpernatanı dikkatlice çıkarın. 15 dakika sonra, mikropartikülleri bir mililitre DNaz ve RNaz içermeyen deiyonize su ile dört kez oda sıcaklığında bir dakika boyunca 0.2 g'da santrifüjleme ile yıkayın ve her santrifüjlemeden sonra süpernatanı atın.Daha sonra, DNA plazmitlerinin konsantrasyonunu DNaz ve RNaz içermeyen damıtılmış su ile mikrolitre başına 50 ila 200 nanogram arasında ayarlayın ve DNA'yı polietilenimin astarlı mikropartiküller üzerinde biriktirmek için hazırlanan çözeltilerin bir mililitresini kullanın. Mikropartikül karışımını bir ThermoMixer üzerinde dört santigrat derece ve 800 rpm'de 15 dakika boyunca nazikçe çalkalayın ve ardından mikropartikülleri bir dakika boyunca 0,2 g'da santrifüjleme ile toplayın. ThyRS-GFPa1 olarak GFPa1 ile birleştirilmiş teofilin riboswitch'i kodlayan DNA plazmitleri ve BrocColi aptamerini BrocApt olarak kodlayan DNA plazmitleri için tüpleri işaretleyin.Süpernatanı dikkatlice çıkarın ve mikropartikülleri daha önce gösterildiği gibi bir mililitre DNaz ve RNaz içermeyen damıtılmış su ile dört kez yıkayın ve her santrifüjlemeden sonra süpernatanı atın. İpek fibroin tabakasını biriktirmek için, DNA tarafından emilen mikropartiküllere sulandırılmış sulu ipek fibroin çözeltisinden bir mililitre ekleyin ve karışımı ThermoMixer üzerinde 750 rpm'de 10 santigrat derecede 15 dakika boyunca hafifçe çalkalayın. Mikropartikülleri santrifüjleme ile toplayın ve daha önce açıklandığı gibi bir mililitre DNaz ve RNaz içermeyen damıtılmış su ile bir kez yıkayın.Santrifüjlemeyi tekrarlayın ve süpernatanı atın. 0.5 mililitre DNase ve RNase damıtılmış su ekleyin ve mikropartikülleri girdap yaparak karıştırın. Ardından, mikropartikülleri bir ThermoMixer üzerinde beş dakika boyunca 10 santigrat derecede 0,5 mililitre %100 metanol ile işlemden geçirin.Mikropartikülleri santrifüjleme ile topladıktan sonra, partikülleri ThermoMixer üzerinde dakikada 750 dönüşte 10 dakika boyunca beta tabakası oluşumu için 10 santigrat derecede %100 metanol ile muamele edin. Mikropartikülleri toplamak için karışımı dört santigrat derecede bir dakika boyunca 0.2 g'da santrifüjleyin, partikülleri daha önce gösterildiği gibi bir mililitre DNaz ve RNaz içermeyen damıtılmış su ile iki kez yıkayın. Peletlenmiş çekirdek kabuk mikropartiküllerine %8 hidroflorik asit çözeltisi ekleyerek mikropartiküllerin SiO2 çekirdeklerini çözün.Çözünmüş partikül çözeltilerini diyaliz cihazlarına aktarın ve bir beherde deiyonize suya karşı diyaliz edin. Ardından, ipek mikrokapsül süspansiyonunu diyaliz cihazlarından yeni iki mililitrelik mikrosantrifüj tüplerine toplamak için bir mililitrelik bir pipet kullanın. Mikrokapsül numunesinin 100 mikrolitresini sekiz kuyucuklu cam slaytlardan oluşan tek bir kuyucuğa aktarın ve kapsüllerin konfokal lazer tarama mikroskobu veya CLSM kullanarak görüntülemeden önce 20 ila 30 dakika çökelmesine izin verin.Kapsül süspansiyonunun 100 mikrolitresini odacıklı bir cam slaytın her bir oyuğuna pipetleyin. Her bir oyuğa sırayla 300 mikrolitre florofor çözeltisi ekleyin, en düşükten en yükseğe değişen moleküler ağırlıklarda. Karışımı yukarı ve aşağı pipetleyerek karıştırın ve karışımın, florofor çözeltilerinin difüzyonu dengeye ulaşana kadar oda sıcaklığında bir saat inkübe etmesine izin verin.Daha sonra, 488 nanometrelik bir uyarma dalga boyunda 100x yağa daldırma hedefi kullanarak her bir kuyucuğu görüntülemek için slaydı bir CLSM'ye aktarın. Odak düzlemini ayarlayarak ilgilenilen alanı belirleyin ve en büyük çaplı daireler şeklinde görünen kapsüllere odaklanın. Hücresiz bileşenleri bir mikrokapsül örneğine sırayla ekleyerek ve tüpü dört saat boyunca 30 santigrat derecede inkübe ederek in vitro transkripsiyon / translasyon reaksiyonu gerçekleştirin.488 nanometrede uyarma dalga boyunu ve yaklaşık 510 nanometrede GFP / FITC filtresi için emisyonu kullanarak bir plaka okuyucudaki floresansı kontrol edin. Son olarak, 488 ve 561 nanometrelerde lazerler kullanarak CLSM sistemindeki ipek mikrokapsülleri görüntüleyin. Çalışmada, homojen boyutu yaklaşık 4,5 mikrometre ve kabuk kalınlığı yaklaşık 500 nanometre olan sağlam ipek fibroin mikrokapaklar üretilmiştir.İçi boş ipek fibroin kapsül kabuklarının geçirgenliği, moleküler ağırlık kesme yöntemi izlenerek analiz edildi. Bir polietilenimin ana tabakasının konsantrasyonundaki bir artış, daha geçirgen kabuklara sahip mikrokapsüllerin kolloidal stabilitesinin artmasına yol açarken, ana tabakanın ortadan kaldırılması, daha az geçirgen kabuk zarlarına sahip kapsüllerin toplanmasına neden olur. ThyRS aktivasyonu sırasında GFPa1 ekspresyon kinetiği, ipek mikrokapsüllerine yüklenen DNA plazmitlerinden, kapsüllenmemiş DNA'yı kontrol etmekten daha yüksek GFPa1 gen aktivasyonu ortaya çıkardı.Temsili analizde, in vitro transkripsiyon, translasyon sisteminde inkübasyon öncesi ve sonrası kapsül başına 32 DNA kopyası ile yüklenmiş ipek fibroin kapsüllerinin CLSM görüntüleri görüntülendi. İpek fibroin kapsüllerinin kesitsel yoğunluk profilleri GFPa1 ekspresyonunu gösterdi. Kapsül başına 30 DNA kopyası ile yüklenen 20 katmanlı ipek mikrokapsülün transkripsiyon kinetiği, kontrol kapsüllenmemiş DNA ile karşılaştırıldı.İpek mikrokapsüllerden gelen eşdeğer konsantrasyonlardaki kapsüllenmemiş DNA örneklerinden daha yüksek çıkış sinyali, ipek mikrokapsüllerin etkinliğini doğruladı. Bu protokolü takiben, immobilize durumda DNA dolaşıklığını ve in vitro olarak ayrıştırılmış gen aktivasyon sürecini görüntülemek için birkaç yüksek çözünürlüklü mikroskopi tekniği uygulanabilir. Bu teknik, minimal yapay hücrelerde moleküler düzeydeki dinamikleri yanıtlamak için uygulanabilir.Spesifik olarak, uygun gen elementleri ile birleştiğinde, mikrokapsüller hücreden hücreye iletişimi incelemek için kullanılabilir.

preparation-multifunctional-silk-based-microcapsules-loaded-with-dna

Research

JoVE Journal

Biology

Biyoloji

Hücrelerin hızlı mekanik deformasyon makromoleküller ve nanomalzemelerin hücre içi iletimi için gelecek vaat eden bir vektör içermeyen bir yöntem olarak ortaya çıkmıştır. Bu protokol, geniş bir uygulama yelpazesi için sistemin nasıl kullanılacağı hakkında ayrıntılı adımlar sağlar.

Sağlam, mikroakışkan Hücre içi Delivery Platform olarak hücre Sıkma

Teslimat küçük müdahale RNA (siRNA) terapötik uygulanması için ana sorundur. Bu protokol, arginin ve polietilenimin aşılanmış gözenekli silikon mikro oluşan, çok fonksiyonlu ve biyo-uyumlu bir siRNA taşıyıcı platformun kullanılmasını içerir.

SiRNA Therapeutics teslimi için Gözenekli Silikon Mikropartiküller

Saptanabilir hedef dışı etkiler olmaksızın gen susturulmasının daha verimli dağılma zamanı kontrolü için foto-tepki blok kopolimerleri kullanan yeni bir yöntem sunuyoruz. Ek olarak, gen ekspresyonundaki değişiklikler basit siRNA salım deneyleri ve basit kinetik modelleme kullanılarak tahmin edilebilir.

Fotoğrafa Duyarlı Polimerik Nanokarbonlardan SiRNA Salınımının Spatiotemporal Kontrolü ile Gen Silenceresinin Öngörülmesi

Burada biz bir protokol üzerinde kuru-film yöntemini temel alır ve güvenli için kullanılan katyonik nanoliposomes, nesil için tarif ve in vitro verimli bir şekilde teslim mesajcı RNA transkripsiyonu.

Vitro verimli bir şekilde teslim için katyonik Nanoliposomes nesil mesajcı RNA transkripsiyonu

Bu çalışma, geri dönüşümlü ek-parçalanma zinciri transferi (RAFT) yöntemi ile metiyonin functionalized biyouyumlu blok kopolimerler (mBG) hazırlanması sunar. Elde edilen mBG 'nin plazmid DNA 'Sı karmaşıklığı ve transfeksiyon verimliliği de incelenmiştir. Raft yöntemi, özel fonksiyonel gruplar içeren polimerleştirici monomerlerin için çok yararlıdır.

Hedeflenen Plasmid DNA teslim için metiyonin functionalized biyouyumlu blok kopolimerler

Burada, DNA origami nanoyapıların doğal katyonik polisakkarit chitosan ve sentetik doğrusal polyethyleneimine (LPEI) kaplama kullanarak Mg tükenmiş ve nükleaz-zengin medya korunması için bir protokol sunulmuştur.

Gen terapisi Polycation kaplama DNA Origami nanoyapıların korunması için ilham.

Fusogenic gözenekli Silisyum nano tanecikleri etkili tüp bebek ve içinde vivo Oligonükleotid tesliminde sentezi göstermektedir. Gözenekli Silisyum nano tanecikleri tarafından fusogenic lipidler kabuk oluşturmak için ekstrüzyon ile kaplı çekirdek oluşturmak üzere siRNA ile yüklenir. Hedefleme yan functionalization ve parçacık karakterizasyonu yer almaktadır.

Functionalization, malzemelerin ve Fusogenic gözenekli Silisyum nano tanecikleri'Oligonükleotid dır

In vitro transkripsiyon reaksiyonlarını düzenlemek için yeni bir DNA bağlı T7 RNA polimerazının mühendisliğini anlatıyoruz. Protein sentezi ve karakterizasyonu için adımları tartışıyoruz, kavram kanıtı transkripsiyonel düzenlemeyi doğrulıyoruz ve moleküler bilgi işlem, teşhis ve moleküler bilgi işlemedeki uygulamalarını tartışıyoruz.

Programlanabilir In vitro Transkripsiyon ve Moleküler Hesaplama için DNA-Bağlı RNA Polimeraz

Burada, poli (beta aminoester) polimerlere dayalı mRNA nanopartikülleri üretmek için basit bir protokol sunulmaktadır, kapsüllenmiş mRNA değiştirilerek uyarlanabilir. Polimerleri, nanopartikülleri ve in vitro temel karakterizasyonlarını sentezlemek için iş akışı da açıklanmıştır. Bağışıklama ile ilgili bir kavram kanıtı da ekleniyor.

Aşı Amacıyla mRNA Yüklü Poli (Beta Aminoesterler) Nanopartiküllerinin Sentezi ve Karakterizasyonu

Kurucu DNA oligonükleotidlerinden başlayarak amfifilik DNA nanoyıldızlarından oluşan sentetik biyomoleküler kondensatların hazırlanması için bir protokol sunuyoruz. Kondensatlar, tek bir nanostar bileşeninden veya iki bileşenden üretilir ve gömülü bir DNA şablonundan RNA'nın in vitro transkripsiyonunu sürdürmek için modifiye edilir.

Amfifilik DNA Nanoyapılarından Sentetik Kondensatlar ve Hücre Benzeri Mimariler

Burada sunulan, ipekböceği Bombyx mori larvalarında yutma yoluyla gen susturmayı indüklemek için kitosan/dsRNA nanopartikül dağıtımı için bir protokoldür.

İpekböceği Bombyx mori'de Chitosan/dsRNA Nanopartikül Dağıtımı ile Larva RNA Girişimi

Keşfedin ipek fibroin mikrokapsüllerinde DNA plazmid immobilizasyonu ile çok fonksiyonlu biyosensörlerin hazırlanmasını. Bu yöntem, gen aktivasyonu kinetiğini in vitro ortamda çalışmak için araştırmacılara olanak tanır.

RNA Aptamerleri ve Riboswitch'leri kodlayan DNA Plazmidleri ile Yüklü Çok Fonksiyonlu İpek Bazlı Mikrokapsüllerin Hazırlanması

Daha fazla video keşfet