RNA Aptamerleri ve Riboswitch'leri kodlayan DNA Plazmidleri ile Yüklü Çok Fonksiyonlu İpek Bazlı Mikrokapsüllerin Hazırlanması
8 Ekim 2021
Protokol, sağlam ve biyouyumlu DNA yüklü mikrokapsüllerin oluşumunu, birkaç ligandı izleyebilen çoklanmış in vitro biyosensörler olarak tanımlar.
Bu protokolün önemi, DNA plazmit şablonlarını yarı geçirgen biyouyumlu mikrokapsüllere hareketsiz hale getirerek DNA kodlu sensörleri işlevsel tutmak için bir araç sağlamasıdır. Önerilen DNA immobilizasyon tekniği çok yönlüdür. Farklı in vitro aktivasyon mekanizmalarına sahip çok işlevli biyosensörlerin üretilmesine izin verir.
Bu mikrokapsüllerin, uygun algılama elemanları ile birleştiğinde, biyofilmler ve organlar gibi farklı ortamlarda sinyal moleküllerinin salınması da dahil olmak üzere farklı biyolojik süreçleri incelemek için kullanılabileceğini öngörüyoruz. Bu teknik, mikro ölçekte biyolojik sistemlere, özellikle DNA'nın hareketsiz hale getirilmesinin ve moleküler kalabalıklaşmanın gen aktivasyonunun kinetiğini ve mekanizmasını nasıl etkileyebileceğine dair içgörüler sağlayabilir. İki mililitrelik bir mikrosantrifüj tüpündeki 300 mikrolitrelik mikropartiküllere bir mililitre polietilenimin çözeltisi ekleyerek polietilenimin ana tabakasının kurban silika veya SiO2 mikropartikülleri üzerine biriktirilmesiyle başlayın.
Karışımı, ortam koşullarında dakikada 800 devirde bir ThermoMixer üzerinde çalkalayın. Mikropartikülleri oda sıcaklığında bir dakika boyunca 0.2 g'da santrifüjleme ile toplayın ve süpernatanı dikkatlice çıkarın. 15 dakika sonra, mikropartikülleri bir mililitre DNaz ve RNaz içermeyen deiyonize su ile dört kez oda sıcaklığında bir dakika boyunca 0.2 g'da santrifüjleme ile yıkayın ve her santrifüjlemeden sonra süpernatanı atın.
Daha sonra, DNA plazmitlerinin konsantrasyonunu DNaz ve RNaz içermeyen damıtılmış su ile mikrolitre başına 50 ila 200 nanogram arasında ayarlayın ve DNA'yı polietilenimin astarlı mikropartiküller üzerinde biriktirmek için hazırlanan çözeltilerin bir mililitresini kullanın. Mikropartikül karışımını bir ThermoMixer üzerinde dört santigrat derece ve 800 rpm'de 15 dakika boyunca nazikçe çalkalayın ve ardından mikropartikülleri bir dakika boyunca 0,2 g'da santrifüjleme ile toplayın. ThyRS-GFPa1 olarak GFPa1 ile birleştirilmiş teofilin riboswitch'i kodlayan DNA plazmitleri ve BrocColi aptamerini BrocApt olarak kodlayan DNA plazmitleri için tüpleri işaretleyin.
Süpernatanı dikkatlice çıkarın ve mikropartikülleri daha önce gösterildiği gibi bir mililitre DNaz ve RNaz içermeyen damıtılmış su ile dört kez yıkayın ve her santrifüjlemeden sonra süpernatanı atın. İpek fibroin tabakasını biriktirmek için, DNA tarafından emilen mikropartiküllere sulandırılmış sulu ipek fibroin çözeltisinden bir mililitre ekleyin ve karışımı ThermoMixer üzerinde 750 rpm'de 10 santigrat derecede 15 dakika boyunca hafifçe çalkalayın. Mikropartikülleri santrifüjleme ile toplayın ve daha önce açıklandığı gibi bir mililitre DNaz ve RNaz içermeyen damıtılmış su ile bir kez yıkayın.
Santrifüjlemeyi tekrarlayın ve süpernatanı atın. 0.5 mililitre DNase ve RNase damıtılmış su ekleyin ve mikropartikülleri girdap yaparak karıştırın. Ardından, mikropartikülleri bir ThermoMixer üzerinde beş dakika boyunca 10 santigrat derecede 0,5 mililitre %100 metanol ile işlemden geçirin.
Mikropartikülleri santrifüjleme ile topladıktan sonra, partikülleri ThermoMixer üzerinde dakikada 750 dönüşte 10 dakika boyunca beta tabakası oluşumu için 10 santigrat derecede %100 metanol ile muamele edin. Mikropartikülleri toplamak için karışımı dört santigrat derecede bir dakika boyunca 0.2 g'da santrifüjleyin, partikülleri daha önce gösterildiği gibi bir mililitre DNaz ve RNaz içermeyen damıtılmış su ile iki kez yıkayın. Peletlenmiş çekirdek kabuk mikropartiküllerine %8 hidroflorik asit çözeltisi ekleyerek mikropartiküllerin SiO2 çekirdeklerini çözün.
Çözünmüş partikül çözeltilerini diyaliz cihazlarına aktarın ve bir beherde deiyonize suya karşı diyaliz edin. Ardından, ipek mikrokapsül süspansiyonunu diyaliz cihazlarından yeni iki mililitrelik mikrosantrifüj tüplerine toplamak için bir mililitrelik bir pipet kullanın. Mikrokapsül numunesinin 100 mikrolitresini sekiz kuyucuklu cam slaytlardan oluşan tek bir kuyucuğa aktarın ve kapsüllerin konfokal lazer tarama mikroskobu veya CLSM kullanarak görüntülemeden önce 20 ila 30 dakika çökelmesine izin verin.
Kapsül süspansiyonunun 100 mikrolitresini odacıklı bir cam slaytın her bir oyuğuna pipetleyin. Her bir oyuğa sırayla 300 mikrolitre florofor çözeltisi ekleyin, en düşükten en yükseğe değişen moleküler ağırlıklarda. Karışımı yukarı ve aşağı pipetleyerek karıştırın ve karışımın, florofor çözeltilerinin difüzyonu dengeye ulaşana kadar oda sıcaklığında bir saat inkübe etmesine izin verin.
Daha sonra, 488 nanometrelik bir uyarma dalga boyunda 100x yağa daldırma hedefi kullanarak her bir kuyucuğu görüntülemek için slaydı bir CLSM'ye aktarın. Odak düzlemini ayarlayarak ilgilenilen alanı belirleyin ve en büyük çaplı daireler şeklinde görünen kapsüllere odaklanın. Hücresiz bileşenleri bir mikrokapsül örneğine sırayla ekleyerek ve tüpü dört saat boyunca 30 santigrat derecede inkübe ederek in vitro transkripsiyon / translasyon reaksiyonu gerçekleştirin.
488 nanometrede uyarma dalga boyunu ve yaklaşık 510 nanometrede GFP / FITC filtresi için emisyonu kullanarak bir plaka okuyucudaki floresansı kontrol edin. Son olarak, 488 ve 561 nanometrelerde lazerler kullanarak CLSM sistemindeki ipek mikrokapsülleri görüntüleyin. Çalışmada, homojen boyutu yaklaşık 4,5 mikrometre ve kabuk kalınlığı yaklaşık 500 nanometre olan sağlam ipek fibroin mikrokapaklar üretilmiştir.
İçi boş ipek fibroin kapsül kabuklarının geçirgenliği, moleküler ağırlık kesme yöntemi izlenerek analiz edildi. Bir polietilenimin ana tabakasının konsantrasyonundaki bir artış, daha geçirgen kabuklara sahip mikrokapsüllerin kolloidal stabilitesinin artmasına yol açarken, ana tabakanın ortadan kaldırılması, daha az geçirgen kabuk zarlarına sahip kapsüllerin toplanmasına neden olur. ThyRS aktivasyonu sırasında GFPa1 ekspresyon kinetiği, ipek mikrokapsüllerine yüklenen DNA plazmitlerinden, kapsüllenmemiş DNA'yı kontrol etmekten daha yüksek GFPa1 gen aktivasyonu ortaya çıkardı.
Temsili analizde, in vitro transkripsiyon, translasyon sisteminde inkübasyon öncesi ve sonrası kapsül başına 32 DNA kopyası ile yüklenmiş ipek fibroin kapsüllerinin CLSM görüntüleri görüntülendi. İpek fibroin kapsüllerinin kesitsel yoğunluk profilleri GFPa1 ekspresyonunu gösterdi. Kapsül başına 30 DNA kopyası ile yüklenen 20 katmanlı ipek mikrokapsülün transkripsiyon kinetiği, kontrol kapsüllenmemiş DNA ile karşılaştırıldı.
İpek mikrokapsüllerden gelen eşdeğer konsantrasyonlardaki kapsüllenmemiş DNA örneklerinden daha yüksek çıkış sinyali, ipek mikrokapsüllerin etkinliğini doğruladı. Bu protokolü takiben, immobilize durumda DNA dolaşıklığını ve in vitro olarak ayrıştırılmış gen aktivasyon sürecini görüntülemek için birkaç yüksek çözünürlüklü mikroskopi tekniği uygulanabilir. Bu teknik, minimal yapay hücrelerde moleküler düzeydeki dinamikleri yanıtlamak için uygulanabilir.
Spesifik olarak, uygun gen elementleri ile birleştiğinde, mikrokapsüller hücreden hücreye iletişimi incelemek için kullanılabilir.
Tam transkripti görüntüleyin ve binlerce bilimsel videoya erişin
Genel Bakış
Bu çalışma, multiplexed in vitro biyosensörler olarak işlev gören biyokompatibilite DNA yüklü mikrokapsüllerin oluşturulması için bir protokol sunmaktadır. Bu mikrokapsüller yalnızca DNA sensörlerinin işlevselliğini korumakla kalmaz, aynı zamanda biyolojik ortamlarda çeşitli ligandların izlenmesini de kolaylaştırır.
Çalışmanın Temel Bileşenleri
Araştırma Alanı
- Biyokompatibilite malzemeler
- DNA sensör teknolojisi
- In vitro biyosensörlük
Arka Plan
- Sensör işlevselliği için DNA plazmid şablonlarının immobilizasyonunun önemi
- Biyolojik süreçlerin incelenmesinde uygulamalar
- Moleküler sıkışmanın gen aktivasyonu kinetiği üzerindeki etkisi
Kullanılan Yöntemler
- İpek fibroin mikrokapsüllerin oluşturulması
- Immobilizasyon için polietilenimimin kullanımı
- Görüntüleme için konfokal lazer taramalı mikroskopi
Ana Sonuçlar
- Yaklaşık 4.5 mikrometre homojen boyutta mikrokapsüllerin geliştirilmesi
- Kapsüllenmiş DNA'dan GFPa1 geninin kapsüllenmemiş kontrollere göre gelişmiş ifadesi
- Mikrokapsül geçirgenliğinin stabilite ve işlevselliğini doğrulayan değerlendirme
Sonuçlar
- Çalışma, DNA sensör işlevselliğini korumak için ipek fibroin mikrokapsüllerinin kullanımının faydasını etkili bir şekilde göstermektedir.
- Bulgular, bu teknolojinin moleküler biyoloji araştırmalarında, özellikle gen aktivasyon süreçlerinin izlenmesindeki alaka düzeyini vurgulamaktadır.
Sıkça Sorulan Sorular
Executive Industry Relevance
This protocol enables the immobilization of DNA plasmid templates within biocompatible silk microcapsules, preserving sensor functionality for in vitro biosensing applications. By maintaining DNA accessibility and protecting against degradation, the approach supports reliable gene activation readouts in cell-free systems. This capability enhances predictive confidence in early-stage target validation and assay development for nucleic acid-based biosensors.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of DNA-encoded sensor function by immobilizing plasmids in a semipermeable membrane.
- Operational Value: Supports functional testing of RNA aptamers and riboswitches under controlled in vitro conditions.
- Predictive Value: Demonstrates enhanced gene activation output from encapsulated DNA versus non-encapsulated controls, improving assay signal-to-noise.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Provides a tunable permeability platform via layer-by-layer assembly to modulate DNA accessibility and molecular diffusion.
- Operational Value: Allows standardization of DNA loading and capsule size (∼4.5 μm) for reproducible biosensor performance.
- Scalability Value: Facilitates functionalization with AuNPs or antibodies for multiplexed sensing and targeted delivery applications.
Translational & Preclinical Research
- Translational Value: Maintains DNA functionality during long-term storage, enabling delayed use in preclinical workflows.
- Mechanistic De-risking: Permits study of molecular crowding effects on gene activation kinetics in minimal artificial cell models.
- Continuity Value: Connects discovery-stage sensor validation to downstream applications in biofilm and organ-level signaling studies.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the early discovery continuum, supporting hypothesis testing of DNA-based sensors before progression to assay optimization and lead identification stages.
- Discovery Biology: Tests transcriptional and translational activity of DNA plasmids encoding aptamers and riboswitches in cell-free systems.
- Screening: Enables quantitative output measurement via fluorescence (GFP/FITC) and confocal imaging to compare activation kinetics.
- Analytics: Uses molecular weight cutoff analysis to assess shell permeability and its impact on diffusion-controlled gene expression.
- Translational Research: Supports study of signaling molecule release in microscale environments, relevant to intercellular communication models.
- Enterprise Reuse: Establishes a modular platform for immobilizing diverse DNA constructs, adaptable to various sensing elements.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Preserves DNA template integrity and accessibility, reducing false-negative results in biosensor assays.
- Operational Value: Yields homogeneous microcapsules with controllable shell thickness and permeability for standardized workflows.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions by providing enhanced signal output from encapsulated DNA sensors.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of nucleic acid-based diagnostic candidates through improved predictive confidence.
Implementation Considerations
- Requires expertise in layer-by-layer assembly, silk fibroin processing, and nucleic acid handling.
- Depends on access to ThermoMixer, centrifuge, dialysis devices, and confocal laser scanning microscopy.
- Necessitates DNase- and RNase-free conditions throughout to preserve DNA functionality.
- Involves optimization of prime layer concentration, DNA concentration, and layer number to tune permeability and loading.
- Limited to in vitro applications based on source material; in vivo use requires further validation.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:04
Introduction
0:56
Perform Layer‐by‐Layer Deposition of a Prime Layer, DNA Plasmids, and Silk Layers
4:44
Dissolution of SiO2Cores and Imaging of Silk Fibroin Microcapsules
5:42
Estimation of the Permeability of Hollow Microcapsules Using Molecular Weight Cut‐Off (MWCO) Method
6:42
In Vitro Activation of Synthetic Theophylline Riboswitch in Silk Microcapsules
7:28
Results: Microscopy Studies, Membrane Permeability, and Gene Expression Kinetics of Silk Fibroin Microcapsules
9:25
Conclusion
