Name: Fare Beyinlerinin Serbest Yüzen İmmünasyon (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-10-07T13:30:00.000+00:00
Duration: 7 min 58 s
Description: Keşfedin fare beyinlerinde serbest yüzen immünohistokimyasal boyama yöntemini. Bu protokol, C57BL/6J fareleri kullanarak tekrarlanabilir ve yüksek kaliteli nöroanatomik görüntüleme sağlar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Araştırmacılar NIH'den (K01DK119471'den CW'ye; P01DK113954, R01DK115761, R01DK117281, R01DK125480 ve R01DK120858'den YX'e), USDA/CRIS (51000-064-01S'den YX'e) ve Amerikan Kalp Derneği Doktora Sonrası Bursu (#829565) LT'ye.

Bu çalışmada her iki cinsiyette (8-16 haftalık) C57BL/6J fareler kullanılmıştır. Tüm hayvanların bakımı ve tüm prosedürler Baylor College of Medicine'ın Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Komiteleri tarafından onaylandı.
1. Perfüzyon
NOT: Adım 1.1 - 1.6 duman kaputunda gerçekleştirilir.
<ol><li>Anestezi<ol>
<li>Bir kurutucunun altına yerleştirilmiş bir kağıt havluya 5 mL izofluran ( Bkz. Malzeme Masası) dökün. Fareyi kurutucunun içindeki delikli bariyere sokun ve solunum belirtileri kaybolana kadar bekleyin. NOT: Solunum olmadan, fare hala kısa bir süre için kalp atışına sahiptir ve kalp atışı kaybolmadan önce perfüzyona maruz kalacaktır.</li>
		<li>Devam etmeden önce, bir parmak sıkışması refleksi olmadığını onaylayın.</li>
		<li>Her ayağın içinden bir pim sürerek fareyi bir köpük tahtaya sabitle. Sıvı dökülmesini toplamak için köpük tahtanın bir tepsiye yerleştirildiklarından emin olun.</li>
	</ol></li>
	<li>Kalbi açığa çıkarmak<ol>
<li>Toraks ve karın üzerinde orta hat boyunca uzunlamasına yüzeysel bir kesi yapın, ardından toraks ve karın kas duvarını ortaya çıkarmak için cildi bir kenara hareket ettinin. Daha sonra, karaciğeri ve bağırsağı ortaya çıkarmak için kas tabakasında bir kesi yapın. Son olarak, göğüs kafesini makasla keserek toraksı açın ve kalbi ve akciğerleri açığa çıkarın. Çalışma alanını genişletmek için göğüs kafesini kenara çekmek için hemostatik toparlama kullanın.</li>
	</ol></li>
	<li>Terminal kanının toplanması (isteğe bağlı)<ol>
<li>Ucu tamamen gömülene kadar kalbin sağ kulakçıklarına 1 mL şırınna ( Bkz. Malzeme Masası) dikkatlice yerleştirin. Şırınnayı sabit tutun ve istenen hacme ulaşılana kadar yavaşça kan çekin. NOT: Doğru atriyumdan geçmemeye özen göster; Yetişkin fare başına 300-400 μL kan toplanması elde edilebilir. Kan alma amacına bağlı olarak pıhtı hızlandırıcı veya antikoagülan gibi katkı maddeleri kullanılabilir.</li>
	</ol></li>
	<li>Perfüzyon kanüllerinin yerleştirilmesi<ol>
<li>Yeni başlayanlar için, kalbin sol karıncığından makasla küçük bir delik (<1 mm) kesin ve sol ventrikülden yükselen aorta künt bir kanül (genç fareler için 18 G iğne ve yaşlı fareler için 21 G iğne) yerleştirin. Alternatif olarak, deneyimli deneyciler için, sol kalp ventrikülüne doğrudan kör bir kanonülle nüfuz edin ve yükselen aorta dikkatlice yerleştirin.</li>
		<li>Perfüzyon sırasında hareketi önlemek için kanül ve bağlı boruların birleşiminin etrafına pimler yerleştirin. Alternatif olarak, hemostatik tokaları kullanarak henulayı yerinde sabitleyebilirsiniz. Kan akışının dolaşımdan çıkmasına izin vermek için sağ atriyumu kesmeye devam edin. NOT: Perfüzyon kanülü ve bağlantılı boru perfüzyon pompasına bağlanır.</li>
	</ol></li>
	<li>Tuzlu su ile perfüzyon<ol>
<li>Salin basınç anahtarını açın ve fareyi transkardiyöz olarak 40-60 mL salin (%0,9 NaCl: 25 °C, pH 7,4) ile kullanın. Sağ kulakçıktan çıkışı ve karaciğerin rengini yakından gözlemleyin. NOT: Kanı 1-2 dakika içinde yıkamak için otomatik bir perfüzyon pompası ( Bkz. Malzeme Masası) kullanılır. Pompanın basınç aralığı 1-300 mmHg olduğundan, hız buna göre ayarlanabilir. Burundan salin sızıyorsa ve/veya akciğer şişirilmişse, basıncı azaltın ve kanamayı ayarlayın. Çıkış artık kan içermediği zaman, beyin yeterince tuzlu su ile yıkanır. Bu arada, karaciğer kandan yoksundur ve kahverengimsi gri renge dönüşür.</li>
	</ol></li>
	<li>Formalin ile perfüzyon<ol>
<li>Salin basınç anahtarını kapatın ve fareyi % 10 nötr tamponlu formalin 40 mL ile boğmak için formalin basınç anahtarını açın (%10 NBF: 25 °C, pH 6.8-7.2, Malzeme Tablosuna bakın). Titreme kanıtı için hayvanın uzuvlarını gözlemleyin. NOT: %10 NBF infüzyondan sonra kuyruk hareketi de gözlenebilir. DİkKAT: NBF tehlikeli olduğundan, araştırmacıların prosedür boyunca kişisel koruyucu ekipman (örneğin, uygun solunum cihazı, yüz kalkanı) giymeleri önerilir.</li>
	</ol></li>
	<li>Beyin izolasyonu9<ol>
<li>Başı çıkarmak için makas kullanın. Kafatasını ortaya çıkarmak için tümgüme boyunca bir orta çizgi kesiği yapın. Deri ve kas bağlanmasını makasla kesin.</li>
		<li>Yörüngesel sırtta bir kesik yapın ve sonra iris makasının keskin ucunun foramen magnum'una yerleştirin. Makası kafatasının iç yüzeyi boyunca ilerletin, beyne zarar vermemek için yukarı doğru basıncı koruyun. Parietal/frontal kemikleri ve menenjitleri dikkatlice çıkarın. Son olarak, beyni açılan kafatasından nazikçe çıkarın.</li>
	</ol></li>
	<li>Sabitleme sonrası<ol>
<li>Beyni 4 °C'de gece fiksasyonu için 10 mL 5 NBF ve% 15 sakkaroz ile dolu 15 mL'lik bir tüpe yerleştirin. NOT: %5 NBF ve %15 sakkarozun 10 mL'sini hazırlamak için% 10 NBF'nin 5 mL'sini ve % 30 sakkarozun 5 mL'sini birleştirin (w/v, fosfat tamponlu saline (PBS) çözünmüş), Malzeme Tablosuna bakın. Sabitleyici arabelleğin hacminin numunenin kendisinden en az 10 kat daha büyük olduğundan emin olun. Başlangıçta, beyin tamponda yüzecek ve gece sabitlemeden sonra dibe batacaktır.</li>
	</ol></li>
	<li>Dehidratasyon<ol>
<li>Beyin örneğini batana kadar 4 °C'de dehidrasyon için %30 sakkarozun 10 mL'si ile dolu 15 mL'lik bir tüpe aktarın.</li>
	</ol></li>
</ol>2. Kriyoseksiyon (koronal bölümler)
<ol><li>Hazırlık<ol>
<li>Kayan bir mikrotomun yükseklik ayarlama plakasının üzerine kuru buz yerleştirin ve beyaz don görünene kadar bekleyin. Sakkaroz çözeltisi tamamen dondurulduktan sonra sağlam bir tabanın tabakasını oluşturmak için plakanın üzerine 5 mL% 30 sakkaroz dikkatlice yayın. Tüm beyin örneklerini (bir partide 5 beyin örneğine kadar) sakkarozun üstündeki bir çizgiye yatay olarak yerleştirin ve ardından her beynin dibine% 30 sakkarozun 0,5 mL'sini ekleyin. NOT: Beyin hemen donmuş sakkaroz tabanına yapışır ve yavaş yavaş aşağıdan yukarıya donar. Kesmek için daha sağlam bir taban oluşturmak için beynin monte edilmiş kısmının etrafına ek sakkaroz yerleştirin.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Bölümleme<ol>
<li>5-10 dakikalık donmadan sonra, beyin sert ve beyaz hale geldiğinde, istenen katmana / bölgeye ulaşılana kadar beyni kırpın. NOT: Sıcaklığı kontrol etmek için plakadaki kuru buz miktarını ayarlayın. Beynin yüzeyinde buz kristalleri göründüğünde sıcaklık çok düşüktür. Beyin yumuşadığında ve artık beyaz olmadığında sıcaklık çok yüksektir.</li>
		<li>Kırpma modundan Besleme moduna ve bölüm beyin dokusundan 25 μm kalınlıklara geçin. 1x PBS ile dolu 48 kuyulu bir plaka hazırlayın ve bir fare beyni için beş kuyu işaretleyin. Her bölümü bir fareden toplamak ve bir kuyuya yerleştirmek için bir boya fırçası kullanın. Aynı farenin sonraki bölümünü toplayın ve 2.</li>
		<li>5. kuyuya ulaşılana kadar 2.2.2'yi tekrarlayın, bölümleri 1.-5. Aynı prosedürü beynin geri kalanı için aynı anda tekrarlayın. Bir fareden tüm bölümler anatomik sırayla 5 kuyuya toplanana kadar tekrarlayın. NOT: Bu işlemi takiben, her fareden beyin bölümleri, 5 farklı histolojik çalışma için kullanılabilecek 5 seriye aliquoted edilir.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Depolama<ol>
<li>Bölümleri her kuyudan kriyoprotektan tampon (%20 gliserol, %30 etilen glikol ve %50 PBS) dolu 1,5 mL mikrotüpe aktarmak için bir boya fırçası kullanın ve numuneleri -20 °C'de saklayın. NOT: Küçük tüplerde (1,5 mL) depolanan bu bölümler dondurucuda fiziksel alandan tasarruf edebilir ve bölümlerin bütünlüğü birkaç ay boyunca korunabilir.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. Serbest yüzen WFA boyama ve anti-AVP immünostaining
<ol><li>PBS ile dolu 6 kuyulu bir hücre kültür plakasının kuyusuna bir hücre süzgeci yerleştirin ve bir dizi beyin bölümünü hücre süzgecine aktarmak için bir boya fırçası kullanın. Hücre süzgecini PBS ile dolu başka bir kuyuya aktararak PBS'deki bölümleri durulayın. Kriyoprotektan tamponda depolanan bölümler için bir çalkalayıcı üzerinde 6 x 10 dakika ve taze kesilmiş bölümler için 3 x 10 dakika durulayın. NOT: Tüm yıkama işlemleri, her kuyunun içinde bir hücre süzgeci bulunan 6 kuyulu bir hücre kültürü plakasında gerçekleştirilir ( Bkz. Malzeme Tablosu). Her süzgeç, her farenin ilgi alanlarını tutar. Reaktifleri kurtarmak için, aşağıda açıklanan tüm inkübasyon prosedürleri 1,5 mL mikrosantrifüj tüpünde gerçekleştirilir. Yıkama ve kuluçka prosedürleri arasında, beyin bölümlerini her hücre süzgeci ve her tüp arasında aktarmak için bir boya fırçası kullanın. PBS ile yıkamak için her kuyu için 12 mL yeterlidir.</li>
	<li>PBT'de 1 mL biyotin etiketli WFA (1:1.000) çözeltisi (1.5 mL PBS'de çözünmüş 2,5 mL Triton X-100) tamponu 1,5 mL tüpte hazırlayın. Beyin bölümlerini hücre süzgecinden tüpe aktarın ve bir gecede ~50 rpm sallanan bir platformda oda sıcaklığında kuluçkaya yatırın.</li>
	<li>Beyin bölümlerini PBS ile 3 x 10 dakika boyunca durulayın.</li>
	<li>PBT'de 1,5 mL'lik bir tüpte 1 mL streptavidin-Dylight 488 (1:500) çözeltisi hazırlayın. Beyin bölümlerini tüpe aktarın ve ~50 rpm'de sallanan bir platformda 2 saat boyunca oda sıcaklığında kuluçkaya yaslanın. NOT: Bu adımdan itibaren ışığa maruz kalmamak için plakayı folyo ile örtün.</li>
	<li>Beyin bölümlerini PBS ile 3 x 10 dakika durulayın. Oda sıcaklığında 2 saat boyunca bloke tamponunda beyin bölümlerini (%3 normal eşek serumu PBT ile seyreltilmiş) kuluçkaya yatırın. NOT: Bloke serum seçimi, ikincil antikorun üretildiği türler tarafından belirlenir. örneğin, ikincil antikor keçiden geliyorsa, normal keçi serumu kullanılmalıdır.</li>
	<li>Birincil antikordaki beyin bölümlerini (tavşan anti-AVP, 1:500) bir gecede ~50 rpm'de sallanan bir platformda oda sıcaklığında kuluçkaya yatırın. NOT: Blokaj tamponunda hem birincil hem de ikincil antikorları hazırlayın. Pilot çalışmalarda inkübasyon konsantrasyonu, kuluçka süresi ve inkübasyon sıcaklığı optimize edilmelidir.</li>
	<li>Beyin bölümlerini PBS ile 3 x 10 dakika durulayın. İkincil antikordaki beyin bölümlerini (Alexa Flour 594 eşek anti-tavşan IgG (H+L), 1:500) oda sıcaklığında ~50 rpm'de sallanan bir platformda 2 saat kuluçkaya yaslayın. Beyin bölümlerini PBS ile 3 x 10 dakika durulayın.</li>
</ol>4. Montaj
<ol><li>her biri 1x PBS'den oluşan 100 mL ile iki Petri kabı (150 mm çapında) doldurun. Tüm beyin bölümlerini bir süzgeçten ilk yemeğe aktarın ve beyin bölümlerini nöroanatomik sırayla kaudalden rostral'a hizalayın. NOT: Farklı hayvanlardan bölümlerin karıştırılmasını önlemek için, aynı anda bir hayvandan bir dizi beyin bölümü monte edin.</li>
	<li>Tüm beyin bölümleri ilk tabakta hizalandıktan sonra, bir slaytı ikinci tabağa bir ucu bir standla hafifçe eğik olarak batırın (bkz. Şekil 1 ve Şekil 2). Hava tamponu arayüzünün hemen altındaki bir beyin bölümünü eğik kaydırağa hafifçe yerleştirmek için ince bir boya fırçası kullanın. Aynı işlemi başka bir beyin bölümü ile tekrarlayın ve ilk bölümle yan yana monte edin.</li>
	<li>Her iki beyin bölümü de hava tamponu arayüzünün tamamen üzerinde olana kadar seviyesini düşürmek için tamponu yavaşça ve nazikçe çıkarmak için bir transfer pipeti kullanın. NOT: Tampon yüzeyin bozulmasını en aza indirmeye özen edin, aksi veya beyin bölümleri yüzebilir. Kuru olduğunda, bu beyin bölümleri sırası slayda sıkıca yapışır. Gerekirse, bölümler hala ıslakken dokuda kırışıklık veya kıvrım olmadığından emin olmak için slayttaki bölümleri hafifçe ayarlayın.</li>
	<li>Slaydın altına ulaşılana kadar bu işlemi yineleyin. Tüm bölümler slaytlara takılana kadar yinelemeye devam edin.</li>
</ol>5. Kapak kaplaması
<ol><li>Tüm bölümler kuruduktan sonra (oda sıcaklığında 1-24 saat), slayta DAPI ile 80-100 μL solmaya karşı montaj ortamı yerleştirin (Malzeme Tablosuna bakın) ve numuneleri örtmek için hafifçe bir cam kapakçık uygulayın. NOT: Kabarcıkları önlemek için cam kapak kapağını dikkatli ve yavaş bir şekilde uygulayın.</li>
	<li>Slaytları bir mikroskop slayt kutusuna yerleştirin (Malzeme Tablosuna bakın) ve 4 °C'de saklayın. NOT: Floresan solmasını ve otofluoresans gelişimini önlemek için tüm bölümleri 1-3 gün içinde görüntüleyin.</li>
</ol>6. Görüntüleme
<ol><li>Tarayıcıyı ve bilgisayarı açın (bkz. Malzeme Tablosu). Slaytları yükleme cihazıyla slayt tutucusuna yerleştirin ve tutucuyu tarayıcıya yerleştirin. NOT: Tarayıcı, aynı anda birden fazla kanalın (örneğin, 4′, 6-diamidino-2-fenilindole (DAPI), yeşil ve kırmızı kanallar) taranmasını sağlar. Tarayıcı slaytları yalnızca 20x büyütme ile tarar ve daha yüksek bir büyütmeye (örneğin, 40x) ihtiyaç duyulduğunda geleneksel bir floresan mikroskop (bkz. Malzeme Tablosu) kullanılabilir.</li>
	<li>Tarayıcının yazılımını açın ( Bkz. Malzeme Tablosu). Uygun depolama konumunu ve tarama profilini seçin.</li>
	<li>Önizleme Taramasını Başlat düğmesine tıklayarak önizleme taramasını başlatın . Önizleme taramasından sonra doku algılama sihirbazını açın ve görüntüleme için ilgi çekici bölgeleri daire içine alıp daire içine alıp verin.</li>
	<li>Görüntüleme bölgelerini seçtikten sonra Taramayı Başlat düğmesine tıklayın. Makinenin taramayı bitirmesini bekleyin. Sonuç dosyasını denetleyin ve görüntüleri dışa aktarın. NOT: Profil slayt için uygun değilse, profili dokulara uyarlamak için pozlama süresini veya ışık gücünü yeniden odaklayarak ve değiştirerek ayarlayın. Daha fazla teknik ayrıntı için tarayıcının yönergelerine bakın (Malzeme Tablosu).</li>
</ol>

<ol><li>Must, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Disease+burden+associated+with+overweight+and+obesity%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Medical+Association%22%5BJournal%5D)">The Disease burden associated with overweight and obesity.</a> Journal of the American Medical Association. 282 (16), 1523-1529 (1999).</li>
<li>Apovian, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Obesity%3A+definition%2C+comorbidities%2C+causes%2C+and+burden%5BTitle%5D)+AND+%22The+American+Journal+of+Managed+Care%22%5BJournal%5D)">Obesity: definition, comorbidities, causes, and burden.</a> The American Journal of Managed Care. 22 (7), Suppl 176-185 (2016).</li>
<li>Wong, S. K., Chin, K. Y., Suhaimi, F. H., Fairus, A., Ima-Nirwana, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Animal+models+of+metabolic+syndrome%3A+a+review%5BTitle%5D)+AND+%22Nutrition+%26+Metabolism%22%5BJournal%5D)">Animal models of metabolic syndrome: a review.</a> Nutrition & Metabolism. 13 (1), 1-12 (2016).</li>
<li>Kennedy, A. J., Ellacott, K. L., King, V. L., Hasty, A. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mouse+models+of+the+metabolic+syndrome%5BTitle%5D)+AND+%22Disease+Models+%26+Mechanisms%22%5BJournal%5D)">Mouse models of the metabolic syndrome.</a> Disease Models & Mechanisms. 3 (3-4), 156-166 (2010).</li>
<li>Schacht, V., Kern, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Basics+of+immunohistochemistry%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Investigative+Dermatology%22%5BJournal%5D)">Basics of immunohistochemistry.</a> The Journal of Investigative Dermatology. 135 (3), 1-4 (2015).</li>
<li>Mepham, B. L., Britten, K. J. M. Immunostaining methods for frozen and paraffin sections. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aMepham%2C+BL+%22Lymphoproliferative+Diseases%22">Lymphoproliferative Diseases</a>. Jones, D. B., Wright, D. H. 15, Springer. Dordrecht. 187-211 (1990).</li>
<li>Liu, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TPH2+in+the+dorsal+raphe+nuclei+regulates+energy+balance+in+a+sex-dependent+manner%5BTitle%5D)+AND+%22Endocrinology%22%5BJournal%5D)">TPH2 in the dorsal raphe nuclei regulates energy balance in a sex-dependent manner.</a> Endocrinology. 162 (1), 1-16 (2021).</li>
<li>Liu, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Defining+vitamin+D+receptor+expression+in+the+brain+using+a+novel+VDR%28Cre%29+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Comparative+Neurology%22%5BJournal%5D)">Defining vitamin D receptor expression in the brain using a novel VDR(Cre) mouse.</a> Journal of Comparative Neurology. 529 (9), 2362-2375 (2020).</li>
<li>Gage, G. J., Kipke, D. R., Shain, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Whole+animal+perfusion+fixation+for+rodents%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">Whole animal perfusion fixation for rodents.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (65), e3564(2012).</li>
<li>Whittington, N. C., Wray, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Suppression+of+red+blood+cell+autofluorescence+for+immunocytochemistry+on+fixed+embryonic+mouse+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Protocols+in+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Suppression of red blood cell autofluorescence for immunocytochemistry on fixed embryonic mouse tissue.</a> Current Protocols in Neuroscience. 81 (1), 2-28 (2017).</li>
<li>Zeller, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fixation%2C+embedding%2C+and+sectioning+of+tissues%2C+embryos%2C+and+single+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Protocols+in+Pharmacology%22%5BJournal%5D)">Fixation, embedding, and sectioning of tissues, embryos, and single cells.</a> Current Protocols in Pharmacology. , Appendix 3 (2001).</li>
<li>Potts, E. M., Coppotelli, G., Ross, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Histological-based+stainings+using+free-floating+tissue+sections%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">Histological-based stainings using free-floating tissue sections.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (162), e61622(2020).</li>
<li>He, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+small+potassium+current+in+AgRP%2FNPY+neurons+regulates+feeding+behavior+and+energy+metabolism%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">A small potassium current in AgRP/NPY neurons regulates feeding behavior and energy metabolism.</a> Cell Reports. 17 (7), 1807-1818 (2016).</li>
<li>Xu, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activation+of+serotonin+2C+receptors+in+dopamine+neurons+inhibits+binge-like+eating+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Biololgical+Psychiatry%22%5BJournal%5D)">Activation of serotonin 2C receptors in dopamine neurons inhibits binge-like eating in mice.</a> Biololgical Psychiatry. 81 (9), 737-747 (2017).</li>
</ol>

Yazarların açıklayacak çıkar çatışmaları yoktur.

Bu protokol, fare beyninin perfüzyon, doku kesiti, serbest yüzen immünostaining, doku montajı ve görüntüleme dahil olmak üzere nöroanatomik çalışmaları için yerleşik bir yöntem sağlar. Ancak, tutarlı ve güvenilir sonuçlar için gerekli olan birkaç temel ayrıntı optimize edilmelidir.
Perfüzyon kalitesi başarılı boyama için kritik öneme sahiptir. Kan hücrelerinin (örneğin, kırmızı kan hücreleri) yapay bir 'pozitif' boyama üretebileceği göz önüne alındığında, beyinde kan kalırsa boyama sonuçları <...

Obezite ve buna bağlı komorbiditelerin yaygınlığı salgın boyutlara ulaşmış ve muazzam bir sosyoekonomik yüke neden olmuştur1,2. Obeziteden sorumlu biyolojik süreçleri daha iyi anlamak için çeşitli fare modelleri geliştirilmiştir3,4. Bu hayvan modellerinde enerji homeostazının düzenlenmesi için merkezi mekanizmalar önemli olduğundan, fare beyinlerinin nöroanatomik çalışmaları bu alanda gerekli bir teknik haline gelmiştir. Bununla birlikte, beyin histolojisi tekniklerinin kalitesi, güvenilirliği ve tekrarlanabilirliği, çeşitli nedenlerle (örneğin antikorlar, dokular, tedaviler, türler, araştırma hedefleri) aynı laboratuvardaki laboratuvarlar ve hatta araştırmacılar arasında önemli ölçüde değişmektedir. Bu nedenle, fare beyninin histolojik çalışmaları için perfüzyon, beyin kesiği, serbest yüzen immünostaining, doku montajı ve görüntüleme dahil olmak üzere genel bir protokol oluşturmak gerekir. Bu arada, yeni başlayanlar bu protokolü bireysel ihtiyaçlarını karşılamak için hızlı bir şekilde öğrenebilir, ustalaşabilir ve ayarlayabilir.
İmmünistokimyasal boyama, çeşitli dokularda (örneğin beyin ve periferik dokular) belirli hücre tiplerini, mRNA'ları ve proteinleri görselleştirmek için yaygın olarak kullanılan yerleşik bir yöntemdir 5,6. Daha spesifik olarak, ilgi çekici bir antijen, belirli bir birincil antikor ve bir enzime (örneğin, kromojenik immünhistokimya) veya floresan bir boyaya (floresan izotiyosiyanat) bağlı ikincil bir antikor ile etiketlenebilir 6. Bu tekniklerin faydasına örnek olarak, β-endorfin [pro-opiomelanocortin (POMC) ile kodlanmış bir peptit] ve c-fos (nöronal aktivitenin bir belirteci) arcuate çekirdeğinde lekelendi. Dorsal raphe çekirdeğinde triptofan hidroksilaz 2'nin (serotonin sentezine entegre bir enzim) silinmesinin, arcuate çekirdeğindeki POMC nöronlarında c-fos ekspresyonunun azaldığı gösterilmiştir7. Ek olarak, D vitamini reseptör mRNA'nın dağılımı in situ hibridizasyon (RNAscope)8 ile fare beyninde haritalandı. Bu makale, fare beyninin histolojik çalışmalarının kalitesini ve tekrarlanabilirliğini artırmayı amaçlayan, serbest yüzen immünostaining için adım adım bir iş akışı ile güvenilir ve verimli bir yöntem sunun.

<table><tbody><tr><td>Alexa Flour 594 eşek anti-tavşan IgG (H + L)</td> <td>Invitrogen</td><td>A21207</td><td></td></tr><tr><td>&nbsp; % 30 Sükroz</td><td>VWR</td><td>470302</td><td>30 g Sükroz 100 mL PBS'ye ayrıştırılır</td></tr><tr><td>. Nötr Tamponlu Formalin</td><td>VWR</td><td>16004-128</td><td>%10, 25 & derece; C, pH 6.8-7.2</td></tr><tr><td>1 mL Sub-Q Şırınga</td><td>BD</td><td>309597</td><td></td></tr><tr><td>48 Kuyulu Hücre Kültürü Plakası</td><td>Corning</td><td>3548</td><td></td></tr><tr><td>6 Kuyulu Hücre Kültürü Plakası</td><td>Corning</td><td>3516</td><td></td></tr><tr>DAPI <td>Vektör Laboratuvarları</td><td>ile solma önleyici montaj ortamı</td><td>H-1200</td><td></td></tr><tr><td>Otoklavlanabilir plastik kurutucu</td><td>Thermo Scientific Nalgene</td><td>5315-0150</td><td></td></tr><tr><td>AVP antikoru</td><td>Phoenix Pharmaceuticals</td><td>H-065-07</td><td></td></tr><tr><td>Hücre Süzgeci</td><td>Corning</td><td>431752</td><td></td></tr><tr><td>Kriyoprotektan tamponu</td><td>Kullanıcı tercihi</td><td>Uygulanamaz</td><td>%20 gliserol, %30 etilen glikol ve %50 PBS</td></tr><tr><td>İzofluran</td><td>Covetrus</td><td>11695-6777-2</td><td></td></tr><tr><td>Leica DFC310FX mikroskobu</td><td>Leica</td><td>Uygulanamaz</td><td></td></tr><tr><td>Mikroskop Slayt Kutuları (50 yerli)</td><td>VWR</td><td>Uygulanamaz</td><td></td></tr><tr><td>PBT</td><td>Kullanıcı tercihi</td><td>Uygulanamaz</td><td>1000 mL PBS Perfüzyon içinde çözülmüş 2,5 mL Triton X-100</td></tr><tr><td>iki otomatik Perfüzyon Sistemi</td><td>Leica</td><td>39471005</td><td></td></tr><tr><td>Fosfat tamponlu salin (PBS) 20x</td><td>VWR</td><td>VWRVE703-1L</td><td>25 & derece; C, pH 7.3-7.5, 1x bileşim: 137 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 9.8 mM Fosfat tamponu</td></tr><tr><td>Kayar Mikrotom Mikrom HM450</td><td>ThermoFisher</td><td>Microm HM450</td><td></td></tr><tr><td>Sodyum Klorür</td><td>RICCA Chemical</td><td>7220-32</td><td>%0.9, 25 derece; C, pH 7.4</td></tr><tr><td>Streptavidin Proteini, DyLight 488</td><td>ThermoFisher</td> <td># 21832</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>089k01921</td><td></td></tr><tr><td>WFA antikoru</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L1516</td><td></td></tr><tr><td>Zeiss Axio Z1 Tarayıcı</td><td>Zeiss</td><td>Uygulanamaz</td><td></td></tr><tr><td>Zen 3.1 yazılımı</td><td></td><td></td><td>tarayıcı yazılımı</td></tr></tbody></table>

fare beyinlerinin serbest yüzen İmmünasyon

Free-floating Immunostaining of Mouse Brains

Fare beyinlerinin immünohistokimyasal lekelenimi, enerji metabolizmasının ve diğer nörobiyolojik süreçlerin düzenlenmesinin altında kalan merkezi mekanizmaları araştırmak için sinirbilimde yaygın olarak kullanılan rutin bir tekniktir. Bununla birlikte, beyin histolojisi sonuçlarının kalitesi, güvenilirliği ve tekrarlanabilirliği laboratuvarlar arasında değişebilir. Her boyama deneyi için, türler, dokular, hedeflenen proteinler ve reaktiflerin çalışma koşullarındaki farklılıklara göre temel prosedürleri optimize etmek gerekir. Bu makale, bu alandaki araştırmacılar tarafından kolayca takip edilebilen aort içi perfüzyon, beyin kesiti, serbest yüzen immünostaining, doku montajı ve görüntüleme dahil olmak üzere güvenilir bir iş akışını ayrıntılı olarak göstermektedir.
Ayrıca, araştırmacıların bireysel ihtiyaçlarını karşılamak için bu prosedürlerin nasıl değiştirilacağı tartışılmaktadır. Bu protokolün güvenilirliğini ve verimliliğini göstermek için perineuronal ağlar, fare beyninde bir anti-AVP antikoru ile biyotin etiketli Wisteria florbunda agglutinin (WFA) ve arginin vazopressin (AVP) ile boyandı. Son olarak, tüm prosedür için kritik ayrıntılar ve bu protokolün diğer protokollere kıyasla avantajları ele alınmıştır. Birlikte ele alındığında, bu makale fare beyin dokusunun serbest yüzen immünostaining için optimize edilmiş bir protokol sunar. Bu protokolün ardından, hem genç hem de üst düzey bilim adamlarının immünostaining çalışmalarının kalitesini, güvenilirliğini ve tekrarlanabilirliğini artırmaları için bu süreci kolaylaştırır.

Bu iletişim kuralının akış şeması Şekil 1'de kısaca gösterilmiştir. Bu laboratuvarın kriyoseksiyon prosedürü, 5 beyin örneğinin aynı anda bölümlerek alındığı Şekil 2A'da gösterilmiştir. Beyin bölümlerinin montajı Şekil 2B'de gösterilmiştir ve beyin bölümleri ile tamamen monte edilmiş bir slayt Şekil 2C'de gösterilmiştir. Şekil 3'te Bregma-0.82 mm'de WFA ve AVP'nin daha düşü...

Bu protokol, perfüzyon, beyin kesiti, serbest yüzen immünostaining, doku montajı ve görüntüleme dahil olmak üzere fare beyni histolojik çalışmaları için verimli ve tekrarlanabilir bir yaklaşımı açıklar.

Fare Beyinlerinin Serbest Yüzen İmmünasyon

Immunohistochemical staining of mouse brains is a routine technique commonly used in neuroscience to investigate central mechanisms underlying the ...

Fare beyinlerinin immün-histokimyasal lekelenişi nörobilim araştırmalarında yaygın olarak kullanılan bir tekniktir. Bununla birlikte, beyin histolojisi sonuçlarının kalitesi, güvenilirliği ve tekrarlanabilirliği farklı araştırmacılar ve laboratuvarlar arasında değişebilir. Fare beyinlerinin histolojik çalışmaları için tekrarlanabilir, güvenilir ve verimli olduğu kanıtlanmış yerleşik bir metodoloji sunuyoruz.Prosedürün sergilenmesine yardımcı olacak Dr.Chunmei Wang, laboratuvarımdan yardımcı doçent Sekiz ila 16 haftalık bir C57 siyah / 6J farede başarılı anesteziyi doğruladıktan sonra, fareyi bir köpük tahtaya sabitleyin ve toraks ve karın üzerindeki orta hat boyunca uzunlamasına yüzeysel bir kesi yapın, ardından toraks ve karın kas duvarını ortaya çıkarmak için cildi bir kenara hareket ettirin. Daha sonra, karaciğeri ve bağırsağı ortaya çıkarmak için kas tabakasında bir kesi yapın. Daha sonra makas kullanarak göğüs kafesini keserek toraksı açın ve kalbi ve akciğerleri açığa çıkarın.Hemostatik kümesleri kullanarak, çalışma alanını genişletmek için göğüs kafesini bir kenara çekin. Önümüzdeki. bir perfüzyon kanül yerleştirmek için, doğrudan sol kalp ventrikülüne künt bir kanülle nüfuz edin ve yükselen aort içine dikkatlice yerleştirin. Kanül ve bağlı borunun birleşiminin etrafına pimleri perfüzyon sırasında kanülleri yerinde sabitlemek için köpük tahtaya yerleştirin ve kan dolaşımından kan akışını sağlamak için sağ kulakçık kesmeye devam edin.Salin ile perfüzyon için, tuzlu su basınç anahtarını açın ve fareyi transkardiyatif olarak 40 ila 60 mililitre salin ile perfüzyon. Sağ kulakçıktan çıkışı ve karaciğerin rengini yakından gözlemleyin. Daha sonra, formalin ile boğmak için, salin basınç anahtarını kapatın ve fareyi% 10 nötr tamponlu formalin 40 mililitre ile boğmak için formalin basınç anahtarını açın.Titreme kanıtı için hayvanın uzuvlarını gözlemleyin. Beyin izolasyonu için, başı çıkarmak için makas kullanın ve kafatasını ortaya çıkarmak için bütünleme boyunca bir orta çizgi kesisi yapın, ardından cilt ve kas bağlanmasını kesin. Daha sonra, yörüngesel sırtta bir kesim yapın ve iris makasının keskin ucunun foramen magnum'a yerleştirilmesi.Beynin zarar görmesini önlemek için yukarı doğru basıncı koruyarak kafatasının iç yüzeyi boyunca makası ilerletin. Daha sonra, beyni açık kafatasından çıkarmadan önce parietal ve frontal kemikleri ve menenjitleri dikkatlice çıkarın. Kayan bir mikrotomun yükseklik ayarlama plakasının üzerine kuru buz yerleştirin ve beyaz don görünene kadar bekleyin, ardından sakkaroz donduktan sonra sağlam bir taban tabakası oluşturmak için plakanın üzerine% 30 sakkarozun beş mililitresini dikkatlice yayın.Daha sonra, tüm beyin örneklerini yatay olarak sakkaroz tabanının üzerine% 30 sakkarozun 500 mikrolitresi ile bir çizgiye yerleştirin. Beş ila 10 dakikalık donmadan sonra, beyin sert ve beyaz hale geldiğinde, istenen katmana veya bölgeye ulaşılana kadar beyni kırpın, ardından 25 mikrometre kalınlığında bölümler oluşturmak için trim modundan besleme moduna ve bölüm beyin dokusuna geçin. Ardından, PBS ile dolu 48 kuyulu bir plaka hazırlayın ve bir fare beyni için beş kuyu işaretleyin.Bir boya fırçası kullanarak, bir bölüm toplayın ve bir kuyuya yerleştirin, ardından aynı farenin sonraki bölümünü toplayın ve ikinci kuyuya yerleştirin. Beşinci kuyuya ulaşılana kadar prosedürü tekrarlayın, birinci ila beşinci kuyuya altı ila 10 bölüm yerleştirin, vb. Pbs ile dolu altı kuyulu bir hücre kültür plakasının bir kuyusuna bir hücre süzgeci yerleştirin ve bir boya fırçası kullanarak bir dizi beyin bölümünü hücre süzgecine aktarın.Hücre süzgecini çalkalayıcıda PBS ile dolu başka bir kuyuya aktararak bu bölümleri PBS'de durulayın. Daha sonra, beyin bölümlerini hücre süzgecinden bir mililitrelik biyotin etiketli WFA içeren 1,5 mililitrelik bir tüpe aktarın ve bir gecede 50 RPM'de sallanan bir platformda kuluçkaya yatırın. Ertesi gün, beyin bölümlerini daha önce gösterildiği gibi PBS ile durulayın, ardından bölümleri bir mililitre streptavidin-gün ışığı 488 çözeltisi içeren bir tüpe aktarın ve sallanan bir platformda iki saat boyunca kuluçkaya yatırın.Beyin bölümlerini PBS ile tekrar duruladıktan sonra, iki saat boyunca bloke tamponunda kuluçkaya yatırın, ardından bir gecede birincil antikorda inkübasyon sallanan bir platformda. Ertesi gün, PBS durulamalarını takiben, ikincil antikordaki bölümleri iki saat boyunca kuluçkaya yatırın. İki Petri kabını 100 mililitre PBS ile doldurun ve tüm beyin bölümlerini bir süzgeçten ilk yemeğe aktarın.Beyin bölümlerini kaudalden rostrale nöroanatomik sırayla hizalayın. Daha sonra, bir kaydırağı bir ucu bir standla hafifçe eğik olarak ikinci tabağa batırın ve ince bir boya fırçası kullanarak, hava tampon arayüzünün hemen altındaki bir beyin bölümünü eğik kaydırağa hafifçe yerleştirin. Daha sonra, bir transfer pipeti kullanarak, beyin bölümü tamamen hava tampon arayüzünün üzerinde olana kadar seviyesini düşürmek için tamponu yavaşça ve nazikçe çıkarın.Slaydın altına ulaşılana ve tüm bölümler slayda takılana kadar bu işlemi yinelemeye devam edin. Görüntüleme için tarayıcıyı ve bilgisayarı açın, ardından slaytları yükleme aygıtıyla slayt tutucusuna yerleştirin ve tutucuyu tarayıcıya yerleştirin. Tarayıcının yazılımını açın ve uygun depolama konumunu ve tarama profilini seçin.Önizleme Taramasını Başlat düğmesine tıklayarak önizleme taramasını başlatın. Taramadan sonra doku algılama sihirbazını açın ve görüntüleme için ilgi alanlarını daire içine alıp daire içine alıp verin. Görüntüleme bölgelerini seçtikten sonra Taramayı Başlat düğmesine tıklayın ve makinenin taramayı bitirmesini bekleyin.Sonuç dosyasını denetleyin ve görüntüleri dışa aktarın. Burada gösterilen bregma negatif 0.82 milimetre koronal fare beyin bölümlerinin temsili floresan immün-histokimya görüntüleri, wisteria floribunda aglutinin, arginin vazopressin ve DAPI dağılımını gösteren. Ön hipotalamus ve retiküler çekirdeğin perifornik bölgesinde Wisteria floribunda agglutinin sinyalleri gözlenirken, paraventriküler çekirdekte arginin vazopressin sinyalleri görülür.Bu protokolü ilk kez denerken, deneyimli bir araştırmacının gözetiminde gerçekleştirmeyi öneriyoruz. Protokol, farklı araştırmacılar ve laboratuvarlar arasında optimal ve tutarlı histolojik sonuçlar elde etmeye yardımcı olacak ve bu tekniği öğrenen yeni başlayanlar için bir referans görevi görecektir.

free-floating-immunostaining-of-mouse-brains

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Sinirbilim

Tüm primat beyin genelinde hedef proteinlere büyük ölçekli İmmuno gömerek yeni doku istihdam ve belirli bir zamanda birden fazla serbest bölümleri toplu boyama için yaratıcı cihazların kullanımı ile kombine yöntemler kesit mümkündür.

Tüm Maymun Beyin Büyük Ölçekli Protein Algılama için Toplu immün

Bu video, birincil ve ikincil antikorlar kullanılarak floresan olarak işaretlenmiş astrositlerle sabit bir fare beyin dokusu bölümünün immün boyama prosedürünü gösterir ve konfokal mikroskopi yoluyla lekeli astrositlerin görüntülerini yakalar.

Bir Fare Beyin Dokusu Bölümünde Floresan Etiketli Astrositlerin İmmün Boyanması

Kaynak: Schönherr, S., et. al. Fare Amigdalasındaki Glutamat Reseptörlerinin Girişe Özgü Düzenlemesini İncelemek için Kombine Optogenetik ve Donma Kırığı Replika İmmün Etiketleme. J. Vis. Uzm. (2016)Bu video, elektron mikroskobu için fare beyin dokusunun donarak kırılmış kopyalarının immüno-etiketlemesini göstermektedir. Kırılmış ve kaplanmış kopyalar, reseptörleri açığa çıkarmak için sindirilir. Primer ve altın etiketli sekonder antikorlar, spesifik nöronal membran reseptörlerini etiketlemek...

Fare Beyin Dokusunun Donarak Kırılmış Bir Örneğinde Nöronal Membran Proteinlerinin İmmünoetiketlenmesi

Kaynak: Baleriola, J., et. al., Yüksek Çözünürlüklü In Situ Hibridizasyon Kullanılarak Beyin Bölümlerinde Aksonal Lokalize mRNA'ların Tespiti.  J. Vis. Uzm. (2015)Bu video, floresan in situ hibridizasyon ve antikor boyama kullanılarak sabit fare hipokampal dilimlerinde kolinerjik aksonlar içinde mRNA'nın tespitini göstermektedir. Floresan mikroskobu, kolinerjik nöronlarda prob etiketli mRNA'ların ve kolin asetiltransferazın mekansal lokalizasyonunu ortaya çıkarır.

Floresan In Situ Hibridizasyonun Ardından Fare Beyin Dilimlerinde Nöronların İmmün Boyanması

Bu giriş seviyesi protokolü, örnek olarak mikroglia ve nöronal elementler için belirteçler kullanarak, kemirgen beyinlerinin immünohistokimyasal boyamasını tamamlamak için gereken reaktifleri, ekipmanı ve teknikleri açıklar.

Mikroglia ve nöronlar için örnek Boyama: Cryosectioned Rat Beyin Dokusu Üzerine İmmünohistokimya için Astar

Burada, bir sinaptik protein ayirt boyama kullanarak işaret protein, confocal mikroskobu ve bilgisayar tabanlı analiz göre dağılımını belirlemek için nicel bir yaklaşım açıklar.

Türdeş olmayan dağıtım ayirt kullanarak fare beynindeki bir sinaptik protein miktarının

Konveksiyon-geliştirilmiş teslimat (CED) büyük doku hacimleri doğrudan perfüzyon ile beyin içine terapötik etkili teslim sağlayan bir yöntemdir. Prosedür kateterler ve optimize enjeksiyon prosedürü kullanımı gerektirir. Bu protokol, bir antikor, bir fare beyninde CED için bir metodoloji açıklanmaktadır.

Konveksiyon ile Murine beyin içine antikorların teslimi-gelişmiş teslimat

Bu protokol, mikroglial yoğunluk, dağılım ve morfolojinin yanı sıra fare beyin dokusunda periferik miyeloid hücre infiltrasyonunun analizine ek olarak, IBA1 ve TMEM119'un immünororesan costaining'i için adım adım iş akışını tanımlar.

Fare Beyninde Mikroglial Yoğunluk, Morfoloji ve Periferik Miyeloid Hücre Infiltrasyonu Analizi için IBA1 ve TMEM119 Kullanılarak İmmünofloresanS Boyama

Serbest yüzen teknik, araştırmacıların biyolojik yapıları, hücre tipini ve protein ekspresyonunu ve lokalizasyonunu görselleştirmek için sabit doku kesitlerinde immünohistokimya da dahil olmak üzere histolojik tabanlı boyamalar yapmalarını sağlar. Bu, beyin, kalp ve karaciğer gibi çok sayıda dokuyu araştırmak için yararlı olabilecek etkili ve güvenilir bir histokimyasal tekniktir.

Serbest Yüzen Doku Kesitleri Kullanılarak Histolojik Tabanlı Boyamalar

Bu protokol, çok etiketli FISH ve floresan IHC sinyali elde etmek amacıyla hem taze dondurulmuş hem de sabit fare beyin bölümlerinde floresan in situ hibridizasyon (FISH) ve floresan immünohistokimyasını (IHC) birleştirmek için bir yöntemi açıklar. IHC, sitoplazmik ve membrana bağlı proteinleri hedefledi.

Multipleks Floresan In Situ Hibridizasyonun Floresan İmmünohistokimya ile Taze Dondurulmuş veya Sabit Fare Beyin Kesitlerinde Birleştirilmesi

İndüklenebilir bir transgenik soy izleme fare çizgisi kullanarak kök hücreleri ve soylarını bir florofor ile kalıcı olarak işaretleme yeteneği, in vivo aktivasyon, proliferasyon, göç ve / veya farklılaşmanın mekansal ve zamansal analizine izin verir. Soy izleme, soy bağlılığı, müdahaleye yanıt ve çok potansiyelli hakkında yeni bilgiler ortaya çıkarabilir.

Yetişkin Fare Beynindeki İndüklenebilir Floresan Etiketli Kök Hücrelerin Soy İzi

Keşfedin fare beyinlerinde serbest yüzen immünohistokimyasal boyama yöntemini. Bu protokol, C57BL/6J fareleri kullanarak tekrarlanabilir ve yüksek kaliteli nöroanatomik görüntüleme sağlar.

Fare Beyinlerinin Serbest Yüzen İmmünasyon

Daha fazla video keşfet