Radyoaktif Sinyalin Hücresel Kökenini Belirlemek için Floresan Aktive Hücre Sıralama-Radyoligand ile Tedavi Edilmiş Doku (FACS-RTT)

Bu protokol in vivo görüntülemeyi tamamlayıcı niteliktedir. İn vivo elde edilenden farklı bir ölçek olan radyotracerlerin hücre tipi ve hücresel düzeyde nicelleştirilmesine izin verir. Bu tekniğin temel avantajı, radyoligandların kullanımı ve hücre sıralaması ile verilen hassasiyeti ve hücresel çözünürlüğüdür.

Fotoğraf makinesini açın ve işletim yazılımını yükleyin. Yönlendirme gerçekleştirmek için Ana Sayfa XYZ sahne alanı düğmesine tıklayın. 10 dakikalık bir tarama alımından oluşan denemeyi ayarlayın.

Tüm emisyon spektrumunu kaydetmek için Adım modunu iyi ve Edinme modunu Listmode olarak ayarlayın. Yatağı kurun ve ısıtma sisteminin, solunum sensörünün ve anestezinin işlevsel ve güvenli olduğundan emin olun. Ardından, hayvanın başının yerleştirileceği yere bir hayalet yerleştirin.

Ekranın alt kısmındaki üç görüntünün yardımıyla üç boyut için imleçleri kaydırarak tarama alanını ayarlayın. Fantomun ve hayvanın tarama hacminin aynı olduğundan emin olun. Daha önce belirlenmiş parametrelerle sonraki kalibrasyon için fantom taramasını başlatın.

Radyoaktivite içeren deneyler için yetkilendirilmiş uygun bir ortamda çalıştığından emin olun. Bir torpido gözüne yerleştirilmiş bir termosiklerde, 100 mikrolitre asetik asit içinde 100 mikrogram tributylin öncüsünü sodyum iyodür ve beş mikrolitre% 37 parasetik asit 70 santigrat derecede 20 dakika boyunca inkübe edin. 500 mikrolitrelik bir hacme ulaşmak için reaksiyonu suda% 50 asetonitril kullanarak seyreltin.

Seyreltilmiş reaksiyonun 500 mikrolitresini ters fazlı bir kolona enjekte edin. CLINDE'yi 10 dakika boyunca yedi milimolar fosforik asit içinde% 5 ila% 95 ACN arasında çalışan doğrusal gradyan HPLC ile izole edin. 10 mililitrelik bir son hacme ulaşmak için izolatı suda seyreltin ve ardından seyreltilmiş reaksiyonu bir konsantrasyon kolonuna enjekte edin.

CLINDE'yi kolondan 300 mikrolitre mutlak etanol ile süzün ve daha sonra etanol'ü oda sıcaklığında vakum santrifüjünde 40 dakika boyunca inkübe ederek buharlaştırın. Bir stok çözeltisi oluşturmak için CLINDE içeren kalıntıyı 300 mikrolitre salin içinde seyreltin. Radyoaktivitesini ölçtükten sonra, 500 mikrolitrede 0.037 megabecquerel çözeltisi elde etmek için stok çözeltisini tuzlu su içinde seyreltin.

Soğuk referans bileşikleri ile kalibrasyon eğrilerini oluşturun ve doğrusal regresyon denklemini çözün: A ve B katsayılarını elde etmek için AX artı B'ye eşit Y. X, soğuk bileşiğin kütlesini temsil eder ve Y, eğrilerin altındaki alanı temsil eder. Radyoligand eğrisinin altındaki alanı kontrol edin, kalibrasyon eğrisine ve radyoligand eğrisinin altındaki alana bağlı olarak 450 nanometrede ultraviyole absorbansını ölçün.

Kütleyi tahmin edin ve radyoligandın aktivitesini ölçün. Spesifik aktivitenin mikromol başına 1.000 gigabecquerel'den büyük olduğundan emin olun. Hayvan konumunu güncellemek için Resmi güncelle düğmesine tıklayın.

Üç boyut için ekranın alt kısmındaki üç görüntünün yardımıyla imleçleri kaydırarak tarama alanını ayarlayın. Denemeyi, bir dakikanın 60 karesini oluşturan 60 dakikalık bir taramada ayarlayın. Başlangıçta ayarlanan diğer tüm parametreleri yeniden kullanın.

500 mikrolitre radyoaktif radyotracer enjekte edin ve ardından tüpü 300 mikrolitre steril% 0.9 sodyum klorür ile yıkayın. Aynı zamanda, taramayı başlatmak için Edinimi başlat'a tıklayın. Tarama yeniden yapılandırma yazılımını açın ve ardından tarama klasöründe oluşturulan dosya adı parametreleri dosyasını arayarak veri kümesini açın.

İlgilendiğiniz izotopu seçin. List mode parametresinin bu adımda çoklu izotop seçimine izin verdiğini unutmayın. Voksel boyutu, alt kümelerin sayısı ve yinelemeler gibi farklı rekonstrüksiyon parametrelerini makalede açıklandığı gibi ayarlayın.

Çıktı formatını NIFTI olarak seçin ve ardından SPECT rekonstrüksiyonunu başlat'ı seçin. Beynin ilgi alanlarını incelemek için düz bir metal spatula ve bir tıraş bıçağı kullanın. Dokuları iki mililitrelik bir santrifüj tüpüne yerleştirin ve elde edilen dokuyu tartın.

Numuneleri bir mililitre kalsiyum ve magnezyum içermeyen HBSS içeren iki mililitrelik bir santrifüj tüpüne koyun ve daha sonra oda sıcaklığında iki dakika boyunca 300 kez G'de santrifüj yapın ve peleti rahatsız etmeden süpernatantı çıkarın. 1.900 mikrolitre enzim karışımı ekleyin ve tüpleri her beş dakikada bir ters çevirerek çalkalarken 37 santigrat derecede 15 dakika boyunca inkübe edin. İki adet 30 mikrolitre enzim karışımı ekleyin.

1.000 mikrolitrelik pipetle 30 kez ileri geri hafifçe çalkalayın. Daha sonra, karışımı 37 santigrat derecede 15 dakika boyunca inkübe ederken, tüpleri her beş dakikada bir ters çevirerek çalkalayın. Dokuları ayırmak için karışımı 37 santigrat derecede 10 dakika inkübe etmeden önce 200 mikrolitrelik bir pipet ve ardından 10 mikrolitrelik bir pipetle hafifçe ileri geri karıştırın.

Hücreleri 70 mikrometrelik bir hücre süzgeci ile filtreleyin ve 10 mililitre kalsiyum ve magnezyum içermeyen HBSS ekleyin. Oda sıcaklığında 10 dakika boyunca 300 kez G'de santrifüj yapın ve peleti rahatsız etmeden süpernatantı çıkarın. Miyelin tükenmesi için, peleti 400 mikrolitre miyelin giderme tamponu ile yeniden askıya alın ve daha sonra dört santigrat derecede 15 dakika kuluçkaya yatmadan önce 100 mikrolitre miyelin giderme boncukları ekleyin.

Beş mililitre miyelin giderme tamponu ekleyin ve oda sıcaklığında 10 dakika boyunca 300 kez G santrifüj yapın. 500 mikrolitre miyelin giderme tamponu ekleyin ve asılı peletleri manyetik alan kolonuna yerleştirin. Kolonu dört kez bir mililitre miyelin giderme tamponu ile yıkayın.

Oda sıcaklığında iki dakika boyunca 300 kez G'de santrifüj yapın ve peleti rahatsız etmeden süpernatantı çıkarın. Vorteks, hücreleri ayırmak ve beş mikrolitre Fc Blok CD32 eklemek için kısaca. İlgilenilen birincil antikorların karışımından 100 mikrolitre ekleyin ve dört santigrat derecede 20 dakika boyunca inkübe edin.

Dört santigrat derecede beş dakika boyunca 350 kez G'de santrifüj yapın ve peleti rahatsız etmeden süpernatantı çıkarın. Tüpleri yumuşak kağıda baş aşağı boyayın. Tüpü kısaca vorteksleyin, ardından 100 mikrolitre ikincil antikor karışımı ekleyin ve dört santigrat derecede 15 dakika boyunca inkübe edin.

Bir mililitre miyelin giderme tamponu ekleyin ve santrifüjlemeyi tekrarlayın. Süpernatantı atın ve tüpleri yumuşak kağıda baş aşağı bürün. Hücreleri 250 mikrolitre steril PBS'de yeniden askıya alın ve doğrudan hücre sıralamasına geçin.

Vahşi tip sıçanların in vivo SPECT taraması, lipopolisakkarit enjeksiyon bölgesinde CLINDE'nin beynin kontra-lateral bölgesinden daha yüksek bağlandığını göstermiştir. Floresan aktive edilmiş hücre sıralama radyoligandı ile tedavi edilen doku veya FACS-RTT uygulanan ex vivo örnekler, sadece mikroglia'da daha fazla sayıda CLINDE bağlanma bölgesinin varlığını ortaya koydu ve beynin ipsilateral tarafındaki CLINDE sinyalinin hücresel kökeninin mikroglia olduğunu gösterdi. TgF344-AD sıçanlarında 12 ayda translokatör proteinindeki veya TSPO bağlanmasındaki artış astrositlerle sınırlıydı.

24 aylık sıçanlarda, hem astrositik hem de mikroglial değişiklikler nedeniyle TSPO bağlanmasındaki artış gözlenmiştir. Daha eski TgF344-AD sıçanlarında, striatal astrositler, vahşi tiple karşılaştırıldığında azalmış bir 5HT2AR yoğunluğu göstermiştir. İnsan AD postmortem örneklerinde FACS-RTT yapıldığında, AD deneklerinin hem astrositlerinde hem de mikroglialarında TSPO'nun kortikal bir aşırı ekspresyonu gözlendi.

Radyoaktivite ile çalışırken, radyo koruma talimatlarını izleyin ve uygun kişisel koruma ekipmanı giyin. Ardından, işlemden sonra, çalışma ortamını dekontamine ettiğinizden emin olun. Bu işlemden sonra izole hücre popülasyonlarında protein nicelleştirme ve gen ekspresyon analizi kolaylıkla yapılabilir.