Caenorhabditis elegans'ta Dopaminerjik Nöron Morfolojik Değişim ve Dejenerasyon Seviyelerinin Ölçülmesi
20 Kasım 2021
Bu yazıda, C. elegans'tadopaminerjik nöron dendrit morfolojislerindeki değişiklikleri tutarlı bir şekilde ölçmek için yedi puanlık bir puanlama sisteminin nasıl kullanılacağını sergiliyoruz. Bu sistem, nörodejeneratif bozuklukların genetik, kimyasal ve yaşa dayalı modellerini kullanan dopaminerjik nörodejenerasyon testlerinin analizleri için tasarlanmıştır.
Bu videoda, C.elegans'ta dopaminerjik nöron dendrit morfolojislerindeki değişiklikleri ölçmek için yedi puanlık bir puanlama sisteminin nasıl kullanılacağını gösteriyoruz. Şu anda solucanlarda nörodejenerasyonun ölçülmesinde analitik yöntemlerde büyük bir değişiklik var. Ayrıca, bazı mevcut beceriler yalnızca hücre gövdelerine odaklanır ve belirli hasar türlerine ve seviyelerine duyarlı değildir.
Bu puanlama sisteminin tanıtılmasının amacı, her hasar seviyesinde nörodejenerasyonun kapsamlı bir resmini yakalama ve C.elegans dopaminerjik nörodejenerasyon araştırmalarında tutarlılığı destekleyecek evrensel bir sistem sağlamaktır. Burada, nöronların floresan altında nasıl görüntüleneceğini, bu nöronun dendritlerine puanların nasıl atanacağını ve sonuçların nasıl görüntüleneceğini ve yorumlanacağını önizleyeceğiz. Her deney grubu için pipet veya görüntüleme mikroskobu ile uyumlu bir görüntüleme platformuna 20 ila 30 solucan seçin.
En yaygın platformlar arasında kapak kayması olan cam slaytlara monte edilmiş%2 agarose pedleri ve 100 mikrolitreden daha az sıvı ortamda kuyu hacimleri içeren 96 kuyu plakaları bulunur. Solucanların tamamen felç etmesine izin verin. Bu birkaç dakika sürebilir.
Hazırlanan görüntüleme platformunu z-stack yakalama yapabilen bir görüntüleme mikroskobuna yükleyin. Görüntüleme mikroskobu kullanarak solucanın kafa bölgesini önce parlak alanda, ardından tek renkli GFP floresan altında bulun. Solucan burada 400x büyütme ile gösterilir.
Dendritlerin açık olduğu üst ve alt sınırları bulmak için odak boyunca ilerleyin. Z yığını görüntü yakalama için bunları üst ve alt sınırlar olarak ayarlayın. İstediğiniz perdeyi seçin.
Burada bir mikrometre kullanıyoruz. GFP floresan kanalında z yığını görüntülerini yakalamak için tıklatın. Her z yığını için, mikroskop yazılımını veya harici bir görüntü analiz yazılımını kullanarak görüntü dosyasını açın.
Yığını yazılıma yükleyin ve yığını tek bir düzleştirilmiş görüntüye sıkıştırın. Görüntüleri tedavi grupları arasında ve içinde manuel olarak veya otomatik sargı yazılımı kullanarak hizalayın. Aynı anda bir nöron görüntüsüyle çalışın.
Bükülmeler, bükülmeler ve eğriler de dahil olmak üzere bip, mola ve düzensizlikleri değerlendirmek için dört CEP dendritinden birini seçin. Burun görüntünün üst kısmındayken soldan sağa puanlama, puanlamada tekrarlanabilirliği sağlamak için önerilir. Bu yönergeleri kullanarak, her dendrite bir puan değeri atayın.
Görünür hasarı olmayan dendritler için sıfır puan, düzensizlikleri olan ancak kabarcık veya kırılma olmayan dendritler için bir puan, beşten az blebs olan dendritler için iki puan, beş ila 10 bleb arasında üç puan, 10'dan fazla bleb için dört puan ve/ veya dendritin% 25'ine kadar kaldırma, dendritin% 25 ila 75'ini kaldıran kırılma için beş puan ve dendritin% 75'inden fazlası yoksa altı puan. Tek bir dendrit içinde birden çok ölçüt karşılanırsa, en yüksek puana karşılık gelen ölçütleri göz önünde bulundurun. Bu video ile ilişkili makalenin Şekil 1'inde bulunan bu temsili puanlama görüntüleri referans olarak kullanılabilir.
Puanlamayı göstermek için, birkaç örnek nöron görüntüsüne puan atama konusunda yürüyeceğiz. En üstteki dendritle başlayın, görünür bir bıkkınlık, kırılma veya düzensizlik yoktur. Sıfır puan atayın.
İkinci dendritte yaklaşık 14 bip vardır ve görünür kırılma yoktur. Dört puan atayın. Üçüncü dendrit, dendrit iki ile çakışma nedeniyle bütünüyle görülemez ve puanlanamaz.
En alttaki dendrit yaklaşık 11 blebs ve birkaç molaya sahiptir. Beş puan atayın. Bu görüntüde, bir dendrit z yığını yakalamada tam olarak yakalanmadığı için yalnızca üç dendrit küçümsenebilir.
Görünür üç dendritte leke yok. Yani bu yukarıdan aşağıya sıfır, sıfır ve buradaki bükülmeden dolayı bir puanlanacaktı. Son olarak, bu görüntüde, dört dendritin tümü% 75'ten fazla kayıptır.
Buradaki tüm dendritler altı puan alır. Tüm puanları kaydedin. Puanlar şu anda unblinded olabilir.
Burada kullanılan puan şablonu Ek Dosyalar'da bulunabilir. Nörodejenerasyon skorlarını tedavi grubunda alınan toplam dendrit sayısına bölün. Verileri her nörodejenerasyon skorunda tedavi grubundaki dendritlerin oranı olarak sunun.
Puanlama sistemimiz, rotenon maruziyeti sonrası L4 larva evresi BY200 C.elegans'ta nörodejenerasyonu değerlendirmek için kullanıldı. Veriler burada, her deneysel grup için her puan değerindeki toplam dendrit sayısının oranlarıyla birlikte görüntülenir. Her dendritin n 1 olarak puanlanmış olduğunu düşünüyoruz.
Bu şekilde, rotenon maruziyetine karşı doza bağımlı bir nörodejenerasyon yanıtı takdir edilebilir ve puan dağılımının spesifik kırılımı net bir şekilde görüntülenir. Bu deneysel gruplar, birden fazla karşılaştırma için Bonferroni düzeltmesi ile desteklenmiş bir bağımsızlık için Kikare testine göre istatistiksel olarak farklıydı. Bu videoda, C.elegans'ta dopaminerjik nöron morfolojik değişim ve dejenerasyon seviyelerini ölçmek için laboratuvarımızda geliştirilen yedi nokta ölçeğinin nasıl kullanılacağını gösterdik.
Puanlama yönteminin kullanılması analizde tutarlılığı teşvik eder ve solucanlarda nörodejenerasyon araştırma çalışmaları arasında karşılaştırmaya izin verir. Puanlama sistemimiz, dopaminerjik nöronların görselleştirilmesine izin veren dat-1 dopamin taşıyıcı geni gibi hücreye özgü floresan muhabirleri kullanan C.elegans deneylerinden elde edilen verileri analiz etmek için kullanılabilir. Şimdi, lütfen bu makalenin ek materyalinde bu yönteme yeni giren araştırmacıların puanlama tutarlılığını eğitmek, kalibre etmek ve değerlendirmek için kullanılabilecek yorum içeren bir uygulama seti bulun.
Genel Bakış
Bu makale, C. elegans dopaminerjik nöronlarındaki dendrit morfolojisi değişikliklerini nicelleştirmek için yedi puanlı bir puanlama sisteminin uygulanmasını göstermektedir. Amaç, çeşitli deneylerdeki nörodejenerasyon analizlerini standartlaştırarak nörodejeneratif hastalıkların incelenmesinde tutarlılığı artırmaktır.
Temel Çalışma Bileşenleri
Bilim Alanı
- Sinirbilim
- Nörodejenerasyon
- Morfolojik değerlendirme
Arka Plan
- C. elegans'ta nörodejenerasyonu değerlendirmek için kullanılan mevcut yöntemler önemli ölçüde farklılık göstermektedir.
- Mevcut teknikler genellikle dendritik hasardan ziyade hücre gövdelerine odaklanmaktadır.
- Nörodejeneratif etkilerin daha eksiksiz bir resmini sunabilmek için kapsamlı bir skorlama sistemine ihtiyaç duyulmaktadır.
- Bu sistem, hasarın şiddetini birden fazla düzeyde saptamaktadır.
Çalışmanın Amacı
- Dopaminerjik nöronlardaki dendrit değişikliklerini analiz etmek için evrensel bir puanlama sistemi oluşturmak.
- Farklı C. elegans çalışmalarında tutarlı nörodejenerasyon değerlendirmeleri yapılabilmesini sağlamak.
- Araştırmacıların çeşitli genetik ve kimyasal modeller genelinde sonuçları karşılaştırmasına olanak tanımak.
Kullanılan Yöntemler
- Çalışmada, nöron görüntülerinin z-stack çekimleri için bir görüntüleme mikroskobu kullanılmaktadır.
- Temel biyolojik model C. elegans olup, dopaminerjik nöron morfolojilerine odaklanılmıştır.
- Puanlar, dendrit hasarının çeşitli seviyelerini ele alacak şekilde sıfırdan altıya kadar değişmektedir.
- Metodoloji, tutarlılık sağlamak amacıyla dendritlerin görüntülenmesi, yakalanması ve puanlanmasını içeren kesin görüntüleme adımlarını kapsamaktadır.
- Veriler, her bir nörodejenerasyon puanındaki dendritlerin oranı olarak sunulmuştur.
Temel Sonuçlar
- Puanlama sistemi, dopaminerjik nöronlardaki nörodejeneratif değişikliklerin seviyelerini etkili bir şekilde ayırt etmektedir.
- Veriler, rotenon maruziyetine karşı doza bağımlı bir nörodejenerasyon yanıtı olduğunu göstermektedir.
- İstatistiksel analiz, deneysel gruplar arasında anlamlı farklar olduğunu ortaya koymaktadır.
- Genel olarak sistem, çalışmalar arasında net bir nicelendirme ve karşılaştırma yapılmasına olanak tanır.
Sonuçlar
- Bu çalışma, C. elegans modellerinde nörodejenerasyonun daha standardize edilmiş analizine olanak sağlar.
- Puanlama yöntemi tutarlılığı artırır ve araştırmalarda daha net karşılaştırmalar yapılmasına imkan tanır.
- Nörodejeneratif hastalıklarla ilgili nöronal dejenerasyon mekanizmalarının anlaşılmasına katkıda bulunur.
Sıkça Sorulan Sorular
Yönetici Sektörel Uygunluğu
C. elegans'ta dopaminerjik nöron morfolojisinin standartlaştırılmış kantifikasyonu, nörodejeneratif hastalık araştırmalarında hedef doğrulamayı ve mekanistik risk azaltmayı destekler. Evrensel bir puanlama sistemi, dendrit dejenerasyonunun tekrarlanabilir ve kantitatif değerlendirmesine olanak tanıyarak preklinik modellerdeki öngörü güvenilirliğini artırır. Bu durum, Parkinson hastalığı ve ilgili nörodejenerasyon programları için çalışmalar arası karşılaştırmayı ve portföy önceliklendirmesini kolaylaştırır.
Biyofarma Ar-Ge'sinde Stratejik Uygulamalar
Erken Keşif ve Hedef Doğrulama
- Bilimsel Değer: Dopaminerjik nöronlardaki dendrit düzeyindeki morfolojik değişiklikleri nicelleştirerek terapötik hipotezlerin sorgulanmasına olanak tanır.
- Operasyonel Değer: Hafiften şiddetliye kadar nörodejenerasyonu kaydeden standartlaştırılmış yedi puanlık bir ölçek aracılığıyla biyolojik risk azaltımını destekler.
- Öngörücü Değer: Etki mekanizması doğrulaması için rotenon maruziyeti etkileri gibi doza bağımlı yanıt verileri sağlayarak hedef güvenini artırır.
Tarama ve Analiz Geliştirme
- Bilimsel Değer: Analiz standardizasyonu ve yüksek içerikli tarama hazırlığına uygun kantitatif dendrit morfolojisi verileri üretir.
- Operasyonel Değer: z-yığını floresan yakalama ve otomatik veya manuel dendrit skorlaması kullanarak ölçeklenebilir, tekrarlanabilir görüntüleme iş akışları sağlar.
- Analiz Faydası: Bonferroni düzeltmeli Ki-kare testleri kullanılarak tedavi grupları arasında istatistiksel karşılaştırmaya olanak tanıyan orantılı skor dağılımları oluşturur.
Translasyonel ve Preklinik Araştırmalar
- Translasyonel Değer: Konserve morfometrik uç noktalar aracılığıyla C. elegans dopaminerjik nöron modellerini insan nörodejenerasyon yolaklarıyla ilişkilendirir.
- Preklinik Fayda: Genetik ve kimyasal modellerde dejenerasyon ilerlemesini nicelendirerek riskle uyumlu ilerleme kararlarını destekler.
- Mekanistik Risk Azaltma: Dendrit hasarını (baloncuklar, kırılmalar, bükülmeler) fonksiyonel nöronal kayıpla ilişkilendirerek yapı-fonksiyon ilişkilerini netleştirir.
İş Akışı ve Boru Hattı Entegrasyonu
Bu yöntem, C. elegans modellerinde kantitatif nörodejenerasyon fenotiplemesi aracılığıyla potansiyel ilaç adaylarının belirlenmesini destekleyerek erken keşif iş akışlarına entegre olur.
- Keşif Biyolojisi: dat-1::GFP eksprese eden nöronlarda dendrit bütünlüğünü skorlayarak nöroprotektif bileşiklerin hipotez testlerini gerçekleştirmeyi sağlar.
- Tarama: Bileşik kütüphanesi değerlendirmesi için z-stack görüntüleme ve dendrit skorlaması yoluyla analize hazır, standartlaştırılmış çıktılar üretir.
- Analitikler: İstatistiksel analizi ve laboratuvarlar arası tekrarlanabilirliği destekleyen kantitatif nörodejenerasyon skorları (0–6) sunar.
- Translasyonel Araştırma: Solucan nörit morfolojisini memeli dendrit patolojisiyle ilişkilendirerek biyobelirteçlerle uyumlu hedef doğrulamasına olanak tanır.
- Kurumsal Yeniden Kullanım: C. elegans tabanlı keşif platformları genelinde tutarlı nörodejenerasyon değerlendirmesi için ölçeklenebilir ve aktarılabilir bir skorlama çerçevesi oluşturur.
Operasyonel ve Kurumsal Etki
- Bilimsel Değer: Balonlaşmalardan tamamen kaybolmaya kadar dendrit değişimlerinin tüm yelpazesini yakalayarak mekanistik belirsizliği azaltır.
- Operasyonel Değer: Evrensel bir puanlama sistemi ve araştırmacı kalibrasyonu için uygulama görüntü seti aracılığıyla standardizasyonu ve tekrarlanabilirliği artırır.
- Stratejik Değer: Kantitatif nörodejenerasyon profillerine dayalı erken aşama devam/durdur kararlarına olanak tanıyarak sermaye verimliliğini artırır.
- Portföy Etkisi: Puanlanmış dendrit popülasyonlarından elde edilen doz-yanıt ve istatistiksel anlamlılık verilerini kullanarak hedeflerin riskten arındırılmış önceliklendirmesini destekler.
Uygulama Hususları
- C. elegans dopaminerjik nöronların floresan mikroskobisi ve nöroanatomisi konusunda uzmanlık gerektirir.
- Dendrit görselleştirmesi için z-yığın (z-stack) yakalama ve görüntü düzleştirme yapabilen görüntüleme altyapısına bağlıdır.
- Puanlama tutarlılığını sağlamak için açıklama eklenmiş görüntü setleriyle eğitim yoluyla ekipler arası standardizasyon gerektirir.
- Ölçeğin farklı nöronal alt tiplere veya hastalık modellerine uygulanmasında adaptasyon değerlendirmeleri içerir.
- Tam dendrit görselleştirmesi için sağlam z-yığın yakalamaya olan bağımlılık ve gözlemciler arası değişkenliği en aza indirmek için puanlayıcı eğitimi gibi pratik sınırlamaları kapsar.
