Rekombinant Perfringolysin O-Permeabilized Hücrelerde Mitokondriyal Substrat Akılarının Ölçülmesi

Çünkü farklı patolojiler veya tedavilerle etkilenebilen mitokondri substrat akısını test eder. Örneğin, bugün Metformin tedavisine kanser hücresi yanıtını ortaya çıkarmak için kullanacağız. Her ayrı malzeme için yeterli çoğaltma ve uygun kontrole sahipken minimum sayıda hücre gerektirir.

Analizör sadece araştırma amaçlıdır. Bu teknik mitokondriyal metabolizmadaki hataları tanımlayabilir ve mitokondrileri etkileyen savaşçı ilaçlarını değerlendirmek için kullanılabilir. Prosedürü gösteren karolina Vaneckova laboratuvarımdan bir lisans öğrencisi ve araştırma teknisyeni olacak.

Tohum A549 hücrelerine sütunlarda kuyu başına 20.000 hücre yoğunluğunda başlamak için, bir denizatı XF 96 hücre kültürü mikro plakasının iki ila 11'i. Sütun 1 ve 12'yi arka plan kuyuları olarak boş bırakma. Boş Kuyuları hücre kültürü ortamının eşit hacmiyle doldurun, ardından hücreleri hücre bağlanması için% 5 karbondioksit içeren nemli bir inkübatörde 37 santigrat derecede kuluçkaya yatırın.

Üç ila dört saat sonra, Wells'e 100 mikrolitre hücre kültürü ortamı ekleyin. Deneysel grup sütunlarını yedi ila 11 arasında bir milimolar Metformin ve kontrol grubunu eşit miktarda steril damıtılmış su ile tedavi edin, ardından plakayı inkübatöre geri verin. Sensörleri nemlendirmek için pipet, kuyu başına 200 mikrolitre steril su şebeke plakasına.

Ardından sensörü suya batırırken sensör kartuşunu dikkatlice geri verin. Kartuşu ertesi güne kadar 37 santigrat derecede karbondioksitsiz bir inkübatörde kuluçkaya yatırın. Analizörü ve kontrol ünitesini aç.

Cihaz kontrol ve veri toplama yazılımını başlatın ve tahlil protokolünü metin el yazmasında açıklandığı şekilde tasarlayın. Grup tanımları altında, A bağlantı noktasının enjekte edilen substrata göre farklılık gösterdiği dört enjeksiyon stratejisi oluşturun ve stratejileri alt tabakalardan veya kısaltmalardan sonra adlandırın. B limanına Oligomycin, C limanına FCCP ve D.Create limanına Rotenone Antimiycin A karışımı atayın ve plaka haritasının altında sekiz grubu adlandırın, ilgili Kuyulara gruplar atayın.

Ardından protokolü kullanıma hazır şablon olarak kaydedin. Sıcaklığın gece boyunca stabilize olmasını sağlamak için analizör açık bırakın. Ertesi gün, suyu şebeke plakasından atın ve şebeke plakasına kuyu başına önceden ısıtılmış kalibrörden 200 mikrolitre ekleyin.

Kartuşu test zamanına kadar karbondioksitsiz inkübatöre geri verin. Inkübatörün içinde bir nem kaynağı sağlayın ve kalibratörün hızlı buharlaşmasını önlemek için fan hızını kapatın veya minimuma küçümseyin. Metin el yazmasında açıklandığı gibi önceden ısıtılmış iki kez mitokondriyal test çözeltisi, %5 BSA ve steril su ile substratların ve inhibitörlerin çalışma çözeltisinin beş mililitresini hazırlayın.

Daha sonra, enjektör bağlantı noktalarını vergi el yazmasında açıklandığı gibi substrat ve inhibitörlerle yükleyin. Çalıştırma tahlil sekmesi altındaki kalibrasyon için, tahlilleri başlatmak için çalıştırmayı tıklayın. Yüklü sansür kartuşunu takın ve kalibrasyonun tamamlanmasını bekleyin.

50 mililitrelik bir tüpte iki kez mitokondriyal test çözeltisi, steril su ve% 5 BSA karıştırarak 20 mililitrelik bir test ortamı hazırlayın. Bir nanomolar konsantrasyon elde etmek için 10 mikromoler rekombinant perfringolysin O iki mikrolitre ekleyin. Ve karışımı hafif pipetleme ile yeniden askıya alın, titremeyi ve girdabı önleyin.

Tüpü kullanıma kadar 37 santigrat derecede kuluçkaya yatırın. Önceden ısıtılmış kalsiyum ve magnezyum içermeyen PBS çözeltisi kullanarak hücreleri ve boş Kuyuları iki kez yıkamak için çok kanallı bir pipet kullanın. PBS'yi atın ve hücre permeabilizasyonu için önceden ısıtılmış test ortamının 180 mikrolitresini ekleyin.

Permeabilizasyondan hemen sonra kalibre edilmiş sensör kartuşunun ana plakasını permeabilize hücreler içeren hücre plakası ile değiştirin ve ölçüme başlayın. Tedavi grubunda süksinit indüklenen solunum oranı daha yüksekti. A549 hücrelerinin Metformin tedavisine yanıtı Hep G2'den daha yüksekti. Pyruvate malat indüklenen solunum için, A549 hücreleri beş ila 15 dakika arasında Hep G2 hücrelerine kıyasla indüksiyonda artış gösterdi.

Glutamat malat kaynaklı solunum ve palmitoylcarnitine malat indüklenen solunum için de benzer sonuçlar elde edilmiştir. Doğru substrat ve inhibitör konsantrasyonuna sahip olmak. Doğru birim doğru bağlantı noktasına yüklenmelidir.

Belirli bir substratın metabolik yolunda bir değişiklik tespit edildiğinde, bu yolda yer alan enzimlerin ve taşıyıcıların işlevini değerlendirmek gerekecektir.