Name: Rekombinant Perfringolysin O-Permeabilized Hücrelerde Mitokondriyal Substrat Akılarının Ölçülmesi (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-08-13T14:30:00.000+00:00
Duration: 6 min 17 s
Description: Öğrenin, rekombinant perfringolysin O ile hücre geçirgenliği sağlanarak mikroplaka tabanlı respirometri kullanılarak mitokondriyal substrat akılarının nasıl ölçüldüğünü. A549 ve Hep G2 tümör hücre hatlarında metformin tedavisinin solunum üzerindeki etkilerini keşfedin.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Yazarlar, Hradec Králové Tıp Fakültesi Fizyoloji Bölümü ve Üçüncü Tıp Fakültesi Patofizyoloji Bölümü personeline kimyasallar ve numunelerin hazırlanması konusundaki yardımlarından dolayı teşekkür ediyor. Bu çalışma Charles Üniversitesi hibe programları PROGRES Q40/02 tarafından desteklenmiştir, Çek Sağlık Bakanlığı hibe NU21-01-00259, Çek bilim vakfı hibe 18-10144 ve INOMED projesi CZ.02.1.01/0.0/0.0/18_069/0010046 Çek Cumhuriyeti Eğitim, Gençlik ve Spor Bakanlığı ve Avrupa Birliği tarafından finanse edilmektedir.

1. Testden bir gün önce
<ol><li>Reaktiflerin ve substratların hazırlanması.<ol>
<li>Mitokondriyal test çözümü (MAS): Tablo 1'deaçıklandığı gibi tüm reaktiflerin stok çözümlerini hazırlayın. Mannitol ve sakkaroz stoklarını tamamen çözünmesi için 37 °C'ye ısıtın. 2x MAS hazırlamak için reaktifleri karıştırın, ardından karışımı 37 ° C'ye ısıtın. pH'ı 5N KOH ile 7,4 (~7 mL) olarak ayarlayın, ardından hacmi 1 L'ye kadar getirmek için su ekleyin.</li>
		<li>Sığır serum albümini (%5 BSA): 5 g BSA'yı 90 mL önceden ısıtılmış steril suda manyetik bir karıştırıcı üzerinde çözün ve titremekten kaçının. 5 N KOH ile pH'ı 7,4'e ayarlayın ve ardından hacmi 100 mL'ye çıkarmak için su ekleyin. Aliquotları ölçüm gününe kadar -20 °C'de filtreleyin ve saklayın.</li>
		<li>Mitokondriyal substratlar: Steril suda sodyum süksinat, sodyum piruvat ve sodyum glutamat 1 M stok çözeltileri hazırlayın. Steril suda 100 mM sodyum malat stok çözeltisi hazırlayın ve palmitoil karnitin 10 mM stok çözeltisi hazırlamak için önceden ısıtilmiş steril su kullanın. Her çözeltinin pH'ını 7,4'e 5 N KOH'a ayarlayın ve filtre sterilize edin. Substratları 2-8 °C'de saklayın. Kullanım sırasında, herhangi bir çökeltmeyi çözmek için 37 ° C'ye ılık palmitoil karnitin. Daha sonra kullanmak için, piruvat hariç tüm substratların aliquotlarını -20 °C'de saklayın.</li>
		<li>Mitokondriyal inhibitörler: 25 mM oligomisin, 50 mM karbonil siyanür 4-(trifluoromethoxy) fenilhidrozon (FCCP), 20 mM rotenon ve 20 mM antimisin A stok çözeltileri hazırlamak için dimetil sülfit (DMSO) kullanın.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Hücrelerin tohumlama ve tedavi: Şekil 2'degösterildiği gibi, hücreleri sütun 2-11'de tohumlama. Arka plan kuyuları olarak hizmet vermek için sütun 1 ve 12 boş bırakılmalıdır. Bu çalışmada HepG2 ve A549 hücreleri kullanılmıştır.<ol>
<li>Hücreleri kuyu başına 20.000 hücre yoğunluğunda tohumla. Tohumlama için 50-80 μL hücre kültürü ortamı kullanın.</li>
		<li>Boş kuyuları eşit hacimli hücre kültürü ortamıyla doldurun ve hücreleri% 5 CO2ile nemlendirilmiş bir inkübatörde 37 ° C'de kuluçkaya yatırın. Hücrelerin 3-4 saat boyunca bağlanmasına izin verin ve ardından tüm kuyulara 100 μL hücre kültürü ortamı ekleyin.</li>
		<li>Bu son orta ilave ile tedaviyi 7-11 kolonlarında uygulayın. Bu çalışmada deney grubuna 16 saat boyunca 1 mM metformin hidroklorür, kontrol grubuna ise araç kontrolü olarak eşit hacimde steril damıtılmış su arıtılmış.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Sensörlerin nemlendirilmesi: Pipet 200 μL kuyu başına steril su şebeke plakasına, ardından sensörleri suya batırırken sensör kartuşunu dikkatlice geri verin. Kartuşu ertesi güne kadar 37 °C'de CO2içermeyen bir inkübatörde kuluçkaya yatırın.</li>
	<li>Tahlil protokolü şablonu: Çözümleyiciyi (bkz. Malzeme Tablosu)ve denetleyici ünitesini açma. Cihaz kontrol ve veri toplama yazılımını başlatın ve tablo 2'deaçıklandığı gibi test protokolünü tasarlayın. Grup Tanımlarıaltında, A Bağlantı Noktasının enjekte edilen substrata göre farklılık gösterdiği dört enjeksiyon stratejisi oluşturun (Şekil 3). Stratejileri alt tabakalardan veya kısaltmalarından sonra adlandırın.</li>
	<li>B, C ve D bağlantı noktalarına sırasıyla oligomisinin, FCCP'nin ve rotenon/antimisinin A bileşiklerini atayın. Sekiz grup oluşturun ve şekil 4'tegösterildiği gibi adlandırın. Plaka Haritası altında grupları ilgili kuyulara atayın, ardından protokolü kullanıma hazır şablon olarak kaydedin. Sıcaklığın gece boyunca dengelenmesi için analizörü açık bırakın. Ani sıcaklık değişikliklerini önlemek için analizörü sabit bir sıcaklığa sahip bir yerde tutun.</li>
</ol>2. Tahlil günü
<ol><li>Suyun kalibrantla değiştirilmesi: Suyu şebeke plakasından ve pipetten 200 μL önceden uyarılmış kalibrantın kuyu başına yardımcı plakaya atın. Kartuşu test zamanına kadar CO2içermeyen inkübatöre geri verin. Kalibratörün hızlı buharlaşmasını önlemek için, inkübatörün içinde bir nem kaynağı sağlayın ve fan hızını kapatın veya minimuma küçümseyin.</li>
	<li>Çalışma çözümlerinin hazırlanması: 2x MAS, %5 BSA ve steril suyu 37 °C'ye ısıtarak başlayın. Bu arada, inhibitör stoklarının oda sıcaklığına ulaşmasına izin verin. Tablo 3'teaçıklandığı gibi substratların ve inhibitörlerin çalışma konsantrasyonunun 5 mL'sini hazırlamak için ılık 2x MAS ve steril damıtılmış su kullanın.</li>
	<li>Enjeksiyon portlarının yüklenmesi: Şekil 3'tegösterildiği gibi, substratların 20 μL'sini A limanına yükleyin. Tüm plaka için, 22 μL oligomicin preparatı ile B portu, 25 μL FCCP hazırlığı ile C limanı ve 27 μL rotenon / antimisicin A karışımı ile D bağlantı noktası yükleyin.</li>
	<li>Kalibrasyon adımını başlatma: Test Çalıştır sekmesi altında, tahlilleri başlatmak için Çalıştırmayı Başlat'a tıklayın. Yüklü sensör kartuşunu takın ve kalibrasyon adımını başlatın. Bir sonraki adıma geçmeden önce kalibrasyonun tamamlanmasını bekleyin.</li>
	<li>Tahlil ortamının hazırlanması (MAS-BSA-rPFO): Test ortamının 20 mL'sini hazırlamak için, 50 mL'lik bir tüpte 10 mL 2x MAS, 9,2 mL steril su ve %5 BSA'nın 0,8 mL'sini karıştırın. 1 nM konsantrasyon elde etmek için 2 μL 10 μM rPFO ekleyin ve karışımı hafif pipetleme ile yeniden dürt. Titremekten kaçının ve karıştırmak için bir girdap karıştırıcı kullanmayın. Tüpü kullanım zamanına kadar 37 °C'de kuluçkaya yatırın.</li>
	<li>Hücrelerin yıkanması: Hücreleri ve boş boş kuyuları çok kanallı pipet kullanarak önceden ısıtılmış kalsiyum ve magnezyum içermeyen fosfat tamponlu salin (PBS) ile iki kez yıkayın. Hücre kültürü ortamını atmak ve PBS eklemek için aynı ipuçlarını yeniden kullanmaktan kaçının. Hücrelerin hava akımı tarafından kurumasını korumak için laminar akışının dışında bu adımı gerçekleştirin.</li>
	<li>Test ortamında hücre permeabilizasyonu: Çok kanallı pipet kullanarak PBS'yi atın ve önceden ısınmış test ortamının (MAS-BSA-rPFO) 180 μL ile değiştirin.</li>
	<li>Ölçüme başlama: Permeabilizasyondan hemen sonra, kalibre edilmiş sensör kartuşunun ana plakasını hücre plakasıyla değiştirin ve ölçüme başlayın.</li>
</ol>

<ol><li>Gerencser, A. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+microplate-based+respirometry+with+correction+for+oxygen+diffusion%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Quantitative microplate-based respirometry with correction for oxygen diffusion.</a> Analytical Chemistry. 81 (16), 6868-6878 (2009).</li>
<li>Murphy, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+function%2C+biology%2C+and+role+in+disease%3A+A+scientific+statement+from+the+American+Heart+Association%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation+Research%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial function, biology, and role in disease: A scientific statement from the American Heart Association.</a> Circulation Research. 118 (12), 1960-1991 (2016).</li>
<li>Owen, O. E., Kalhan, S. C., Hanson, R. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+key+role+of+anaplerosis+and+cataplerosis+for+citric+acid+cycle+function%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">The key role of anaplerosis and cataplerosis for citric acid cycle function.</a> Journal of Biological Chemistry. 277 (34), 30409-30412 (2002).</li>
<li>Nicholls, D. G., Ferguson, S. J. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aNicholls%2C+DG+%22Bioenergetics+3%22">Bioenergetics 3</a>. , Academic press. London. (2002).</li>
<li>Brand, M. D., Nicholls, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assessing+mitochondrial+dysfunction+in+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemical+Journal%22%5BJournal%5D)">Assessing mitochondrial dysfunction in cells.</a> Biochemical Journal. 435 (2), 297-312 (2011).</li>
<li>Staňková, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adaptation+of+mitochondrial+substrate+flux+in+a+mouse+model+of+nonalcoholic+fatty+liver+disease%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Molecular+Sciences%22%5BJournal%5D)">Adaptation of mitochondrial substrate flux in a mouse model of nonalcoholic fatty liver disease.</a> International Journal of Molecular Sciences. 21 (3), 1101(2020).</li>
<li>Salabei, J. K., Gibb, A. A., Hill, B. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comprehensive+measurement+of+respiratory+activity+in+permeabilized+cells+using+extracellular+flux+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Comprehensive measurement of respiratory activity in permeabilized cells using extracellular flux analysis.</a> Nature Protocols. 9 (2), 421-438 (2014).</li>
<li>Divakaruni, A. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Thiazolidinediones+are+acute%2C+specific+inhibitors+of+the+mitochondrial+pyruvate+carrier%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Thiazolidinediones are acute, specific inhibitors of the mitochondrial pyruvate carrier.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (14), 5422-5427 (2011).</li>
<li>Divakaruni, A. S., Rogers, G. W., Murphy, A. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measuring+mitochondrial+function+in+permeabilized+cells+using+the+seahorse+XF+analyzer+or+a+Clark-type+oxygen+electrode%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Protocols+in+Toxicology%22%5BJournal%5D)">Measuring mitochondrial function in permeabilized cells using the seahorse XF analyzer or a Clark-type oxygen electrode.</a> Current Protocols in Toxicology. 60, 1-16 (2014).</li>
<li>Elkalaf, M., Tůma, P., Weiszenstein, M., Polák, J., Trnka, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+probe+Methyltriphenylphosphonium+%28TPMP%29+inhibits+the+Krebs+cycle+enzyme+2-Oxoglutarate+dehydrogenase%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial probe Methyltriphenylphosphonium (TPMP) inhibits the Krebs cycle enzyme 2-Oxoglutarate dehydrogenase.</a> PLoS One. 11 (8), 0161413(2016).</li>
<li>Rogers, G. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+throughput+microplate+respiratory+measurements+using+minimal+quantities+of+isolated+mitochondria%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">High throughput microplate respiratory measurements using minimal quantities of isolated mitochondria.</a> PLoS One. 6 (7), 21746(2011).</li>
</ol>

Yazarların beyan edecekleri bir çıkar çatışması yoktur.

Bu protokol, daha önce yayınlanan7,8,9,10 çalışmalarının ve ürün kullanım kılavuzunun bir modifikasyonudur. Üreticinin protokolünün aksine, 3x MAS yerine 2x MAS kullanılır, çünkü 2× MAS'ın çözülmesi daha kolaydır ve donma sonrasında yağış oluşturmaz. Dondurulmuş 2x MAS aliquots altı aya kadar saklanabilir ve tutarlı sonuçlar gösterebilir. Diğer bir fark, ADP'yi 2x MAS bileşenlerine dahil etmek ...

Mikro plaka bazlı respirometri, küçük bir örneklem boyutunun hücresel solunumunun incelenmesini sağlayarak mitokondriyal araştırmalarda devrim yaptı1. Hücresel solunum genellikle mitokondriyal fonksiyonun veya 'işlev bozukluğunun' bir göstergesi olarak kabul edilir, ancak mitokondriyal fonksiyon aralığı enerji üretiminin ötesine uzanır2. Aerobik koşullarda mitokondriler, bu substratları parçalayarak ve sitrik asit döngüsünü körükleyebilecek metabolik ara parçalara dönüştürerek farklı substratlarda depolanan enerjiyi çıkarır3 (Şekil 1). Substratların sürekli akışı, sitrik asit döngüsünün akışının, iç mitokondriyal membran boyunca proton gradyanı üreten elektron taşıma zincirine elektronlar sağlayan ve ATP-synthase'in ADP'yi ATP4'efosforilasyon yapmasını sağlayan yüksek enerjili 'elektron donörleri' üretmesi için gereklidir. Bu nedenle, mitokondriyal solunumu test etmek için deneysel bir tasarım, örnek doğayı (bozulmamış hücreler, permeabilize hücreler veya izole mitokondriler) ve mitokondriyal substratları içermelidir.
Hücreler yerli substratların bir deposu tutar5ve mitokondri aynı anda çeşitli substrat türlerini oksitler6, bu da sağlam hücreler üzerinde yapılan deneylerden elde edilen sonuçların yorumlanmasını zorlaştırır. Seçilen bir substratı oksitlemek için mitokondriyal yeteneği araştırmak için yaygın bir yaklaşım mitokondri izole etmek veya araştırılan hücrelerin dengesini sağlamaktır5. İzole mitokondri nicel çalışmalar için ideal olsa da izolasyon süreci zahmetlidir. Büyük numune boyutu ihtiyacı, verimin saflığı ve tekniğin tekrarlanabilirliği gibi teknik zorluklarla karşıkarşıyadır 5. Permeabilize hücreler mitokondriyal izolasyonun dezavantajları için bir çözüm sunar; bununla birlikte, deterjan doğasının rutin permeabilize edici ajanları spesifik değildir ve mitokondriyal membranlara zarar verebilir5.
Rekombinant perfringolysin O (rPFO) seçici plazma membran permeabilizasyon ajanı7olarak sunuldu ve çeşitli çalışmalarda hücre dışı bir akı analizörü ile birlikte başarıyla kullanıldı 7,8,9,10. XFe96 hücre dışı akı çözümleyicisi kullanarak mitokondriyal substrat akısını taramak için rPFO kullanarak bir protokol değiştirdik. Bu protokolde, iki hücresel fenotipte dört farklı substrat oksitleyici yol, test edilen her malzeme için yeterli çoğaltma ve uygun kontrole sahipken karşılaştırılır.

<table><tbody><tr><td>Adenozin 5 & asal; -difosfat monopotasyum tuzu dihidrat</td><td>Merck</td><td>A5285</td><td>-20 ° C'de saklayın; C</td></tr><tr><td>Antimisin A</td><td>Merck</td><td>A8674</td><td>mağazası -20 &°C'de; C</td></tr><tr><td>Sığır serum albümini</td><td>Merck</td><td>A3803</td><td>mağazası 2 - 8 &°C; C</td></tr><tr><td>Karbonil siyanür 4- (triflorometoksi) fenilhidrazon</td><td>Merck</td><td>C2920</td><td>-20 ° C'de saklanır; C</td></tr><tr><td>Dimetil sülfoksit</td><td>Merck</td><td>D8418</td><td>RT'de mağaza</td></tr><tr><td>D-Mannitol</td><td>Merck</td><td>63559</td> RT <td></td></tr><tr><td>Dulbecco'nun fosfat tamponlu tuzlu su</td><td>Gibco</td><td>14190-144'te</td><td>mağaza RT</td></tr><tr><td>Etilen glikol-bis (2-aminoetileter) -N, N, N ve prime;, N ve prime;-tetraasetik asit</td><td>Merck</td><td>03777</td> RT <td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Merck'te mağaza</td><td>H7523</td><td>RT</td></tr><tr><td>L(-)Malik asit disodyum tuzu</td><td>Merck'te</td> saklayın <td>M9138</td> RT L-Glutamik asit sodyum tuzu <td>hidrat'ta saklayın</td></tr><tr><td></td><td>Merck</td><td>G5889</td><td>RT'de saklayın</td></tr><tr><td>Magnezyum klorür hekzahidrat</td><td>Merck</td><td>M2670</td><td>RT</td></tr><tr><td>Oligomisin'de</td> saklayın <td>Merck</td><td>O4876</td><td>mağazası -20 derece; C</td></tr><tr><td>Palmitoil-DL-karnitin klorür</td><td>Merck</td><td>P4509</td><td>-20 ° C'de saklayın; C</td></tr><tr><td>Potasyum hidroksit</td><td>Merck</td><td>484016</td><td>RT'de mağaza</td></tr><tr><td>Potasyum fosfat monobazik</td><td>Merck</td><td>P5655</td> RT <td></td></tr><tr><td>Rotenone</td><td>Merck</td><td>R8875'te</td><td>mağaza -20 &° 'de; C</td></tr><tr><td>Denizatı Dalga Masaüstü Yazılımı</td><td>Agilent teknolojileri</td><td></td> www.agilent.com <td></td></tr><tr><td>Seahorse XFe96 Analizöründen</td> indirin <td>Agilent teknolojileri</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Denizatı XFe96 FluxPak</td><td>Agilent teknolojileri</td><td>102416-100</td><td>XFe96 sensör kartuşları ve XF96 hücre kültürü mikroplakaları</td></tr><tr><td>Sodyum piruvat</td><td>Merck</td><td>P2256</td><td>2 - 8 ° C'de saklayın; C</td></tr><tr><td>Sodyum süksinat dibazik hekzahidrat</td><td>Merck</td><td>S2378</td><td>RT'de mağaza</td></tr><tr><td>Sükroz</td><td>Merck</td><td>S7903</td><td>RT Water'da mağaza</td></tr><tr><td></td><td>Merck</td><td>W3500</td><td>RT'de mağaza</td></tr><tr><td>XF kalibrant</td><td>Agilent teknolojileri</td><td>100840-000</td><td>RT XF'de mağaza</td></tr><tr><td>Plazma membran geçirgenleştirici</td><td>Agilent teknolojileri</td><td>102504-100</td><td>Rekombinant perfringolizin O (rPFO) - Aliquot ve -20 ° C'de saklayın; Ç</td></tr></tbody></table>

rekombinant perfringolysin o-permeabilized hücrelerde mitokondriyal substrat akılarının Ölçülmesi

Measuring Mitochondrial Substrate Flux in Recombinant Perfringolysin O-Permeabilized Cells

Mitokondriyal substrat akısı her hücre tipinin ayırt edici bir özelliğidir ve taşıyıcılar, kanallar veya enzimler gibi bileşenlerindeki değişiklikler birkaç hastalığın patogenezinde rol oynar. Mitokondriyal substrat akısı bozulmamış hücreler, permeabilize hücreler veya izole mitokondri kullanılarak incelenebilir. Sağlam hücrelerin araştırılması, farklı substratların eşzamanlı oksidasyonu nedeniyle çeşitli sorunlarla karşılaşır. Ayrıca, birkaç hücre türü, sonuç yorumlamayı zorlaştıran farklı substratların iç depolarını içerir. Mitokondriyal izolasyon veya permeabilize edici ajanlar kullanma gibi yöntemler kolayca tekrarlanamaz. Saf mitokondrilerin küçük örneklerden yeterli miktarda bozulmamış zarlarla izole edilmesi sorunludur. Seçici olmayan permeabilizatörlerin kullanılması, çeşitli derecelerde kaçınılmaz mitokondriyal membran hasarına neden olur. Rekombinant perfringolysin O (rPFO), mitokondriyal bütünlüğü etkilemeden plazma membranını seçici olarak permeabilize etme yeteneği sayesinde daha uygun bir permeabilizatör olarak sunuldu. Mikro plaka respirometrisi ile birlikte kullanıldığında, birkaç mitokondriyal substratın akısının en az sayıda hücre kullanırken bir deneyde yeterli çoğaltma ile testine izin verir. Bu çalışmada, protokol iki farklı hücresel fenotip veya genotipin mitokondriyal substrat akısını karşılaştırmak için bir yöntem açıklar ve çeşitli mitokondriyal substratları veya inhibitörleri test etmek için özelleştirilebilir.

Değerleri oksijen tüketim oranı yüzdesi (OCR%) olarak göstermek için sonuçları ikinci taban çizgisi solunum ölçümüne normalleştirerek başlayın. Tahlil sonuçları Şekil 5, Şekil6 , Şekil 7ve Şekil 8 'de gösterilmiştir. Her grup için uygun arka plan kuyularını atamak ve diğer grupların arka plan kuyularını devre dışı bırakmak önemlidir. Şekil 5,</str...

Bu çalışmada, mikro plaka bazlı respirometri ile birlikte rekombinant perfringolysin O kullanarak mitokondriyal solunum substrat akısını test etmek için değiştirilmiş bir protokol açıklıyoruz. Bu protokol ile metforminin iki farklı tümör hücre hattının mitokondriyal solunumunu nasıl etkilediğini gösteriyoruz.

Rekombinant Perfringolysin O-Permeabilized Hücrelerde Mitokondriyal Substrat Akılarının Ölçülmesi

Mitochondrial substrate flux is a distinguishing characteristic of each cell type, and changes in its components such as transporters, channels, or ...

Çünkü farklı patolojiler veya tedavilerle etkilenebilen mitokondri substrat akısını test eder. Örneğin, bugün Metformin tedavisine kanser hücresi yanıtını ortaya çıkarmak için kullanacağız. Her ayrı malzeme için yeterli çoğaltma ve uygun kontrole sahipken minimum sayıda hücre gerektirir.Analizör sadece araştırma amaçlıdır. Bu teknik mitokondriyal metabolizmadaki hataları tanımlayabilir ve mitokondrileri etkileyen savaşçı ilaçlarını değerlendirmek için kullanılabilir. Prosedürü gösteren karolina Vaneckova laboratuvarımdan bir lisans öğrencisi ve araştırma teknisyeni olacak.Tohum A549 hücrelerine sütunlarda kuyu başına 20.000 hücre yoğunluğunda başlamak için, bir denizatı XF 96 hücre kültürü mikro plakasının iki ila 11'i. Sütun 1 ve 12'yi arka plan kuyuları olarak boş bırakma. Boş Kuyuları hücre kültürü ortamının eşit hacmiyle doldurun, ardından hücreleri hücre bağlanması için% 5 karbondioksit içeren nemli bir inkübatörde 37 santigrat derecede kuluçkaya yatırın.Üç ila dört saat sonra, Wells'e 100 mikrolitre hücre kültürü ortamı ekleyin. Deneysel grup sütunlarını yedi ila 11 arasında bir milimolar Metformin ve kontrol grubunu eşit miktarda steril damıtılmış su ile tedavi edin, ardından plakayı inkübatöre geri verin. Sensörleri nemlendirmek için pipet, kuyu başına 200 mikrolitre steril su şebeke plakasına.Ardından sensörü suya batırırken sensör kartuşunu dikkatlice geri verin. Kartuşu ertesi güne kadar 37 santigrat derecede karbondioksitsiz bir inkübatörde kuluçkaya yatırın. Analizörü ve kontrol ünitesini aç.Cihaz kontrol ve veri toplama yazılımını başlatın ve tahlil protokolünü metin el yazmasında açıklandığı şekilde tasarlayın. Grup tanımları altında, A bağlantı noktasının enjekte edilen substrata göre farklılık gösterdiği dört enjeksiyon stratejisi oluşturun ve stratejileri alt tabakalardan veya kısaltmalardan sonra adlandırın. B limanına Oligomycin, C limanına FCCP ve D.Create limanına Rotenone Antimiycin A karışımı atayın ve plaka haritasının altında sekiz grubu adlandırın, ilgili Kuyulara gruplar atayın.Ardından protokolü kullanıma hazır şablon olarak kaydedin. Sıcaklığın gece boyunca stabilize olmasını sağlamak için analizör açık bırakın. Ertesi gün, suyu şebeke plakasından atın ve şebeke plakasına kuyu başına önceden ısıtılmış kalibrörden 200 mikrolitre ekleyin.Kartuşu test zamanına kadar karbondioksitsiz inkübatöre geri verin. Inkübatörün içinde bir nem kaynağı sağlayın ve kalibratörün hızlı buharlaşmasını önlemek için fan hızını kapatın veya minimuma küçümseyin. Metin el yazmasında açıklandığı gibi önceden ısıtılmış iki kez mitokondriyal test çözeltisi, %5 BSA ve steril su ile substratların ve inhibitörlerin çalışma çözeltisinin beş mililitresini hazırlayın.Daha sonra, enjektör bağlantı noktalarını vergi el yazmasında açıklandığı gibi substrat ve inhibitörlerle yükleyin. Çalıştırma tahlil sekmesi altındaki kalibrasyon için, tahlilleri başlatmak için çalıştırmayı tıklayın. Yüklü sansür kartuşunu takın ve kalibrasyonun tamamlanmasını bekleyin.50 mililitrelik bir tüpte iki kez mitokondriyal test çözeltisi, steril su ve% 5 BSA karıştırarak 20 mililitrelik bir test ortamı hazırlayın. Bir nanomolar konsantrasyon elde etmek için 10 mikromoler rekombinant perfringolysin O iki mikrolitre ekleyin. Ve karışımı hafif pipetleme ile yeniden askıya alın, titremeyi ve girdabı önleyin.Tüpü kullanıma kadar 37 santigrat derecede kuluçkaya yatırın. Önceden ısıtılmış kalsiyum ve magnezyum içermeyen PBS çözeltisi kullanarak hücreleri ve boş Kuyuları iki kez yıkamak için çok kanallı bir pipet kullanın. PBS'yi atın ve hücre permeabilizasyonu için önceden ısıtılmış test ortamının 180 mikrolitresini ekleyin.Permeabilizasyondan hemen sonra kalibre edilmiş sensör kartuşunun ana plakasını permeabilize hücreler içeren hücre plakası ile değiştirin ve ölçüme başlayın. Tedavi grubunda süksinit indüklenen solunum oranı daha yüksekti. A549 hücrelerinin Metformin tedavisine yanıtı Hep G2'den daha yüksekti. Pyruvate malat indüklenen solunum için, A549 hücreleri beş ila 15 dakika arasında Hep G2 hücrelerine kıyasla indüksiyonda artış gösterdi.Glutamat malat kaynaklı solunum ve palmitoylcarnitine malat indüklenen solunum için de benzer sonuçlar elde edilmiştir. Doğru substrat ve inhibitör konsantrasyonuna sahip olmak. Doğru birim doğru bağlantı noktasına yüklenmelidir.Belirli bir substratın metabolik yolunda bir değişiklik tespit edildiğinde, bu yolda yer alan enzimlerin ve taşıyıcıların işlevini değerlendirmek gerekecektir.

measuring-mitochondrial-substrate-flux-recombinant-perfringolysin-o

Research

JoVE Journal

Biology

Biyoloji

Mitokondri izole fare kalbinde mitokondriyal permeabilite geçiş gözenek açılması ölçümü için bir spektrofluorometrik protokolü sunulmuştur. Tahlil mitokondri Ca eşzamanlı ölçüm...

Mitokondri İzole Fare Heart Geçirgenliği Geçiş Gözenek Açma Multi-parametre ölçümü

Kaynak:Elettra Leo1, Luiza H.D. Cardoso1, Sabine Schmitt1, Erich Gnaiger11Oroboros EnstrümanlarıBu video, canlı ve geçirgen memeli hücrelerinde mitokondriyal solunumu değerlendirmek için oksijen akışının nasıl kullanıldığını açıklamaktadır. Farklı solunum durumlarını karakterize etmek için digitonin, metabolik substratlar, ADP, bir ayırıcı ve bir inhibitörün sıralı kullanımını gösterir. Ortaya çıkan oksijen akışı profili, tanımlanmış koşullar altında mitokondriyal fonksiyonu ve enerji...

Canlı ve geçirgen hücrelerde mitokondriyal solunumu değerlendirmek için oksijen akısı ölçümleri

Sunulan yöntemler, minimum miktarlarda fare iskelet kasından izole mitokondri kullanılarak yapılan bir mikroplaka bazlı respirometrik tahliller koleksiyonunun performansı için adım adım talimatlar sağlar. Bu tahliller, yaygın olarak kullanılan bir hayvan modelinde mitokondriyal oksijen tüketimindeki mekanik değişiklikleri/adaptasyonları ölçebilir.

Yüksek verim Mikroplate Solunum Ölçümler Fare İskelet Kası Minimal Miktarları gelen kondriyayı İzole kullanma

Yüksek çözünürlüklü Solunum mitokondriyal oksijen tüketimini belirlemek için kullanılır. Bu mitokondriyal solunum zinciri kompleksleri '(I-IV) solunum hızları, maksimum mitokondriyal elektron transport sistem kapasitesi ve mitokondriyal dış membran bütünlüğü belirlemek için basit bir tekniktir.

Yüksek çözünürlüklü Solunum permeabilize ve bozulmamış Hücreleri Mitokondrial fonksiyonu değerlendirmek için

Bu yazıda, oksijen tüketimi yüksek çözünürlüklü basınçlırespirometri Drosophila permeabilized thoraxes içinde kullanarak ölçmek için bir yöntem açıklanır. Bu teknik doku klasik mitokondrial yalıtım tekniği için karşılaştırıldığında çok az bir miktar gerektirir ve elde edilen sonuçlar daha fizyolojik ilgilidir.

Doku çok az miktarda kullanarak Drosophila Permeabilized liflerinin mitokondrial oksijen harcama ölçme noktalar

Bu protokoller, kullanıcıların Denizatı hücre dışı akı analizini kullanarak 3D kanser hücre hattı kaynaklı sferoidlerde mitokondriyal enerji metabolizmasını araştırmalarına yardımcı olacaktır.

Hücre Dışı Akı Analizi Kullanarak Tek 3D Mikrodoku Sferoidlerinin Mitokondriyal Enerji Metabolizmasını Keşfetmek

Floresan sensörlerine bağlı yüksek çözünürlüklü respirometri, mitokondriyal oksijen tüketimini ve reaktif oksijen türlerinin (ROS) oluşumunu belirler. Bu protokol, geçirgenleştirilmiş siyatik sinirde mitokondriyal solunum hızlarını ve ROS üretimini değerlendirmek için bir teknik tanımlamaktadır.

Siyatik Sinirde Mitokondriyal Fonksiyonun Yüksek Rezolüsyonlu Respirometri ile Değerlendirilmesi

Metabolik hücre dışı akı analizörünü kullanarak fare ve insan nötrofillerinin ve HL60 hücrelerinin mitokondriyal solunumunu ölçen kademeli protokolleri açıklıyoruz.

Nötrofillerin mitokondriyal biyoenerjetik profilinin gerçek zamanlı ölçümü

Burada, memeli hücrelerinde moleküler oksijen tüketme yeteneklerinden bağımsız olarak mitokondriyal fonksiyonu doğrudan ölçmek için bir tahlil derlemesi sunuyoruz.

Memelilerde Mitokondriyal Fonksiyonu Ölçmek için Oksijenden Bağımsız Tahliller

Burada, insan veya fare kasından taze geçirgen iskelet kası liflerinde mitokondriyal oksidatif fosforilasyonu ölçmek için kapsamlı bir yöntem açıklıyoruz. Bu yöntem, mevcut mitokondriyal ağları ve membran bütünlüğünü korurken mitokondriyal solunumun gerçek zamanlı olarak ölçülmesine ve yakıt tercihinin ve metabolik esnekliğin değerlendirilmesine olanak tanır.

İnsan ve Fare İskelet Kası Liflerinde Mitokondriyal Solunumun Yüksek Çözünürlüklü Respirometri ile Ölçülmesi

Bağışıklık hücrelerinde fizyolojik olarak ilgili substrat konsantrasyonları altında mitokondriyal biyoenerjetik çalışma yöntemleri sınırlıdır. İnsan T hücrelerinde, monositlerde ve periferik mononükleer hücrelerde mitokondriyal membran potansiyelinin enerji talebine tepkisindeki değişiklikleri değerlendirmek için yüksek çözünürlüklü florespirometri kullanan ayrıntılı bir protokol sunuyoruz.

İnsan bağışıklık hücrelerinde mitokondriyal membran potansiyelindeki dinamik değişiklikleri değerlendirmek için yüksek çözünürlüklü florespirometri

Öğrenin, rekombinant perfringolysin O ile hücre geçirgenliği sağlanarak mikroplaka tabanlı respirometri kullanılarak mitokondriyal substrat akılarının nasıl ölçüldüğünü. A549 ve Hep G2 tümör hücre hatlarında metformin tedavisinin solunum üzerindeki etkilerini keşfedin.

Rekombinant Perfringolysin O-Permeabilized Hücrelerde Mitokondriyal Substrat Akılarının Ölçülmesi

Daha fazla video keşfet