Name: Fare Fibroblastlarının Melanositlere Doğrudan Yeniden Programlanması (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-08-27T14:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 38 s
Description: Öğrenin fare fibroblastlarının melanositlere doğrudan yeniden programlanması için optimize edilmiş yöntemi. Mitf, Sox10 ve PAX3 transkripsiyon faktörleri kullanılarak yüksek verimlilik ve stabilite sağlanmaktadır.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Bu çalışma kısmen Çin Ulusal Doğa Bilimleri Vakfı (82070638 ve 81770621) ve Jiangsu Eyaleti Doğa Bilimleri Vakfı (BK20180281) tarafından desteklenmiştir.

Bu çalışma, Jiangsu Üniversitesi Laboratuvar Hayvanları Yönetimi ve Kullanım Komitesi (UJS-IACUC-AP--20190305010) tarafından onaylanmıştır. Deneyler, Uluslararası Laboratuvar Hayvanları Bakımı Değerlendirme ve Akreditasyon Derneği (AAALAC International) tarafından belirlenen standartlara sıkı sıkıya bağlı kalınarak gerçekleştirilmiştir. İnsanları içeren hiçbir deney yoktu, bu yüzden bu çalışmanın insan araştırma etik komitesinden onay alması gerekmiyordu. Reaktifler hakkında ayrıntılar için Malzeme Tablosu'na bakın.
1. Transkripsiyon faktörleri için konsantre bir lentivirüs paketleme sisteminin yapımı
<ol><li>Konsantre virüsün üretimi (Şekil 1A, B)<ol>
<li>Plaka 1.5 × 106 HEK-293T hücrelerini 60 mm'lik bir kaba yerleştirin ve bu hücreleri normal ortamla (bakınız Tablo 1) 37 °C'de %5 CO 2 ile nemlendirilmiş bir inkübatörde kültürealın. NOT: Virüsün gruplar halinde paketlenmesi gerekiyorsa, 100 mm'lik bir hücre kültürü kabı kullanılabilir (ayrıntılar için Tablo 2'ye bakınız).</li>
		<li>24 saat sonra, HEK-293T hücrelerinin transdüksiyon gününde% 80-90 birleşime ulaştığından emin olun ve ortamı 3.5 mL DMEM (1cm2 başına 150 μL DMEM) ile değiştirin. Hücreleri 37 ° C'de nemlendirilmiş bir inkübatörde 2 saat boyunca% 5 CO2 ile bırakın. NOT: Değiştirme ortamı serumsuz olmalıdır, böylece hücreler daha iyi plazmid transfeksiyonu için "açlıktan ölebilir".</li>
		<li>Mitf, Sox10, Pax3, Sox2, Sox9 veya Snai2'nin hedef plazmidlerinin 3 μg'sini içeren plazmidlerin (karışım A) karışımını hazırlayın; 1 μg ambalaj plazmidi PMD2. G ve PSPAX2 ambalaj plazmidinin 2 μg'ı. Serumsuz DMEM ile A ila 150 μL karışımının hacmini oluşturun. Transfeksiyon reaktifinin 12 μL'sini ekleyerek transfeksiyon reaktifinin karışımını (B karışımı) hazırlayın (hacim, tüm plazmidlerin toplam kütlesinin iki katıdır) ve B karışımının hacmini serumsuz DMEM ile 150 μL'ye kadar yapın. NOT: Karışımları hazırlarken, hava kabarcıklarını önlemek için yavaşça sıvı eklemek önemlidir.</li>
		<li>A karışımını birleştirin ve oda sıcaklığında 5 dakika beklettikten sonra B'yi karıştırın. Transfeksiyon kompleksini oluşturmak için karışımı oda sıcaklığında 20-30 dakika inkübe edin.</li>
		<li>HEK-293T hücrelerini inkübatörden çıkarın, ortamı DMEM +% 2 FBS ile değiştirin, karışımı adım 1.1.4'ten damla damla ekleyin ve sıvıyı yavaşça karıştırın.</li>
		<li>8 saat sonra, ortamı 3,5 mL normal ortamla değiştirin. Ortamı değiştirdikten sonra, virüs süpernatantını her 24 saat ve 48 saatte bir toplayın.</li>
		<li>İki farklı zaman noktasında toplanan virüs süpernatantlarını karıştırın. 4 °C'de 5 dakika boyunca 200 × g'da santrifüj. Süpernatantı 0,45 μm filtrelerden geçirin ve 50 mL steril konik bir tüpte toplayın. NOT: 24 saatte toplanan virüs 4 °C'de saklanabilir ve 48 saatte toplanan virüsle karıştırılabilir.</li>
		<li>Virüs süpernatantını, gece boyunca 4 ° C'de (~ 16 saat) 6000 × g'de santrifüj yaparak konsantre edin. Santrifüjlemeden sonra virüs peletinin konik tüpün dibinde görülebildiğinden emin olun.</li>
		<li>Süpernatantı yavaşça dökün. Virüs peletini, virüs süpernatan hacminin 1 /100'ü olan normal bir ortam hacminde çözün. Bir P1000 mikropipet kullanarak, homojen bir karışım elde edilene kadar yavaşça yukarı ve aşağı pipetleyin. Konsantre virüsü gerektiğinde mikrosantrifüj tüplerine bölün. −80 °C'de saklayın. NOT: Virüs bu yöntemle 100x konsantre edilir. Konsantre virüs (100x) -80 ° C'de >1 yıl saklanabilir. Virüsün tekrar tekrar dondurulmasından ve çözülmesinden kaçının.</li>
	</ol></li>
	<li>Konsantre virüs titresinin tespiti (Şekil 1C)<ol>
<li>Plaka 1 × 105 HEK-293T hücrelerini 6 delikli bir plakanın bir kuyucuğuna yerleştirin. Negatif bir kontrolün yanı sıra bir tane eklemeyi unutmayın. Bu hücreleri% 5 CO 2 ile nemlendirilmiş bir inkübatörde 37 ° C'de normal ortamlakültürleyin.</li>
		<li>24 saat sonra her bir kuyucuğa 0.1 μL veya 0.2 μL floresan konsantre virüs (100x) ekleyin ve her bir kuyucuğa 4 ng / μL katyonik polimerik transfeksiyon reaktifi ekleyin. Enfeksiyondan yaklaşık 8-12 saat sonra, ortamı normal ortamla değiştirin. NOT: Floresan algılamanın doğruluğunu ve verimliliğini sağlamak için, enfeksiyon oranı% 10-30 olmalıdır. Floresan konsantre virüsün 0.1 μL veya 0.2 μL eklenmesi, enfeksiyon verimliliğini bu aralıkta koruyabilir. Konsantre virüs titresi en az 1 × 108 dönüştürücü üniteye (TU) / mL'ye ulaşabilir.</li>
		<li>Enfeksiyondan yaklaşık 48 saat sonra, ölü hücreleri çıkarmak için bulaşığı 1 mL steril fosfat tamponlu salin (PBS) ile yıkayın.</li>
		<li>Bu hücreleri, oda sıcaklığında 1 dakika boyunca 6 kuyucuklu bir plakada kuyucuk başına 250 μL% 0.05 tripsin-EDTA kullanarak tripsinize edin. 4 ° C'de 5 dakika boyunca 200 × g'da santrifüj yapın ve ardından süpernatanı çıkarın.</li>
		<li>Hücre peletini 1 mL PBS'de yeniden askıya alın, süspansiyonu 5 mL'lik polistiren yuvarlak tabanlı bir tüpe ekleyin ve akış sitometrisini kullanarak virüs floresansının (yeşil floresan proteini, GFP +) enfeksiyon etkinliğini tespit edin.</li>
		<li>Aşağıdaki formülü kullanarak konsantre virüs titresini hesaplayın: 105 (hücre hacmi) × enfeksiyon hızı (GFP +%)/eklenen virüs hacmi (0,1 μL veya 0,2 μL).</li>
	</ol></li>
</ol>2. Fibroblastların melanositlere doğrudan yeniden programlanması (Şekil 2A)
<ol><li>6 delikli bir hücre kültürü plakasının bir kuyuğunu oda sıcaklığında 15-30 dakika boyunca 1 mL% 0.1 jelatin çözeltisi ile kaplayın. Kuyunun% 0.1 jelatin çözeltisi ile tamamen kaplandığından emin olun. Kaplamadan sonra% 0.1 jelatin çözeltisini aspire edin. NOT: % 0.1 jelatin çözeltisini (100 mL) aşağıdaki gibi hazırlayın: 0.1 g jelatin tozu, otoklavlanmış bir cam şişede 100 mL ultra saf su içinde çözülür ve daha sonra 4 ° C'de 2 aydan fazla olmamak üzere saklanır.</li>
	<li>Plaka 5 × 104 MEF'i% 0.1 jelatin ile kaplanmış 6 delikli bir plakanın bir kuyucuğuna (adım 2.1'de olduğu gibi) yerleştirin ve bu hücreleri, gece boyunca% 5 CO2 ile nemlendirilmiş bir inkübatörde 37 ° C'de normal ortamla kültürleyin.</li>
	<li>24 saat sonra, MEF'lerin% 40-50 birleşme noktasına ulaştığını onaylayın. Ortamı normal ortamla değiştirin.</li>
	<li>0. Günde, konsantre virüsü dondurucudan çıkarın ve virüsü buz üzerinde eritin. Eklenecek virüsün hacmini eq. (1) kullanarak hesaplayın. Altı transkripsiyon faktörü olan Mitf, Pax3, Sox10, Sox9, Sox2 ve Snai2 için konsantre virüsü hesaplanan hacme göre her bir kuyucuğa ekleyin ve ardından katyonik polimerik transfeksiyon ajanının 4 μg / mL'sini ekleyin. Hücre sayısı (5 × 104) × 30 (enfeksiyon çokluğu, MOI)/virüs titresi (1)</li>
	<li>1. Günde, enfeksiyondan 8-12 saat sonra, virüsü içeren ortamı çıkarın ve stabil enfekte hücre hatlarını taramak için 0.5 μg / mL puromisin eklerken taze normal ortamla değiştirin.</li>
	<li>2. Günde, enfeksiyondan 48 saat sonra, süpernatant ortamı yavaş yavaş yeniden programlama ortamı ile değiştirin. İlk olarak, toplam orta hacmin 1/4'ünü değiştirin ve 3 μM CHIR99021 ekleyin.</li>
	<li>3. Gün'den 7. Gün'e kadar, hücrelerin durumuna bağlı olarak, daha yüksek oranda yeniden programlama ortamıyla değiştirerek ortamı değiştirin (bkz. Tablo 1) kademeli olarak ve 5 gün içinde tam yeniden programlama ortamına geçin. NOT: Bu süre zarfında, puromisin ve CHIR99021 her gün kullanılmalıdır. Yeniden programlama ortamının değiştirilmesinin ilk ve ikinci gününde birçok ölü hücre ortaya çıkacaktır. Hücreler yavaş yavaş dönüşüme adapte olduğu için bu normaldir. Bu nedenle, hücrelerin sağlıklı çoğalmasını sağlamak için ortamın kademeli olarak değiştirilmesi gerekir.</li>
	<li>Hücreleri geçmek için, hücreleri oda sıcaklığında 3 dakika boyunca sindirmek için 500 μL% 0.05 tripsin-EDTA ekleyin. Hücrelerin ~% 60'ı yüzdüğünde, sindirim enziminin hacminin 2 katı normal orta ekleyerek sindirimi durdurun. Hücre süspansiyonunu 15 mL steril konik bir tüpte toplayın, 4 ° C'de 5 dakika boyunca 200 × g'da santrifüj yapın, süpernatanı çıkarın, hücre peletini yeniden programlama ortamıyla yeniden askıya alın ve hücreleri 60 mm steril bir kapta 3 × 104 /cm2 yoğunlukta tabaklayın. Bu hücreleri nemlendirilmiş% 5 CO 2 inkübatöründe 37 °C'de kültürleyin . NOT: 8. günden 21. güne kadar, bu hücreler her 3-5 günde bir alt kültüre alınır ve genişlemek için 60 mm'lik steril kaplarda kültürlenir. En azından 5. pasaja ulaşmak için kültürlenebilirler.</li>
</ol>3. Doğrudan yeniden programlama ve tanımlama için optimizasyon
<ol><li>Optimize edilmiş transkripsiyon faktörlerinin taranması<ol>
<li>2.1-2.7 arasındaki adımları yineleyerek her seferinde altı transkripsiyon faktöründen birini azaltın. MEF'leri beş transkripsiyon faktörünün kombinasyonlarıyla virüsle enfekte edin.</li>
		<li>Enfeksiyondan yedi gün sonra, bu hücrelerin RNA'sını16 çıkarın ve melanositik genlerinin ekspresyon seviyelerini, melanositlere dönüşüm üzerinde en büyük etkiye sahip transkripsiyon faktörlerini tek tek çıkararak taramak için ters transkripsiyon PCR (RT-PCR)17 kullanarak analiz edin (Şekil 3A).</li>
		<li>MEF'leri enfekte etmek için melanositlere dönüşümü etkileyen ilk üç transkripsiyon faktörünü kullanın. 2.1-2.7 arasındaki adımları yineleyin. NOT: Enfeksiyondan yedi gün sonra, melanositik genler bu dönüştürülmüş hücrelerde tespit edilebilmelidir (Şekil 3B). iMels karakterizasyonu için astar bilgileri Tablo 3'te yer almaktadır.</li>
	</ol></li>
	<li>İndüklenmiş melanositlerin (iMels) tanımlanması<ol>
<li>iMel'lerin TYRP-1 ve DCT dahil melanositik proteinleri eksprese ettiğini doğrulamak için immünofloresan boyama18'i kullanın (Şekil 4A).</li>
		<li>Melanine özgü 3,4-dihidroksifenilalanin (DOPA) boyama (Şekil 4B)<ol>
<li>% 4 paraformaldehit (10 mL) hazırlayın: 10 mL PBS'de 0.4 g paraformaldehit tozu çözün. Çözünmeyi önlemek için çözeltiyi 56 ° C'de 2 saat boyunca bir fırına koyun. NOT: Çözelti 4 °C'de bir aydan fazla tutulamaz.</li>
			<li>iMel'leri 30 mm'lik bir tabakta kültürleyin ve önceden ısıtılmış PBS ile iki kez yıkayın. Hücreleri 20 dakika boyunca sabitlemek için 1 mL% 4 paraformaldehit ekleyin ve bulaşığı PBS ile 3 kez yıkayın.</li>
			<li>10 mL PBS içinde 0,01 g L-DOPA tozunu çözerek kullanımdan hemen önce% 0,1 DOPA leke çözeltisi (10 mL) hazırlayın. Çözeltiyi 30 dakika boyunca 37 ° C'de bir su banyosuna yerleştirin; çözülmeyi teşvik etmek için birkaç kez sallayın.</li>
			<li>1 mL taze hazırlanmış% 0.1 DOPA boyama çözeltisi ekleyin. 37 °C'de bir fırında 2-5 saat boyunca inkübe edin. Kahverengi-siyah parçacıklar yoksa, 37 ° C'de 2 saat daha inkübe etmeye devam edin, ancak >5 saat boyunca inkübe etmeye devam etmeyin. Numuneleri her 30 dakikada bir kontrol edin.</li>
			<li>Bulaşığı PBS ile her seferinde 1 dakika boyunca 3 kez yıkayın. Çekirdeği 2 dakika boyunca 1 mL hematoksilin boyama çözeltisi ile sabitleyin.</li>
			<li>Uzun süreli depolama için, numuneleri 3 dakika boyunca% 95 etanol ve daha sonra% 100 etanol kullanarak 5 dakika boyunca dehidre edin. Çanağı ksilen ve nötr balzam ile kapatın.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Melanine özgü Masson-Fontana boyama (Şekil 4B)<ol>
<li>Plaka iMels 30 mm'lik bir tabakta ve hücreleri 20 dakika boyunca% 4 paraformaldehit ile sabitleyin; bulaşığı PBS ile 3 kez yıkayın.</li>
			<li>Masson-Fontana boyama kitinden 1 mL çözelti A (amonyak gümüşü çözeltisi) ekleyin ( Malzeme Tablosuna bakınız), tabağı karanlık bir kutuya yerleştirin ve karanlık kutuyu 15-40 dakika boyunca 56 ° C'de bir fırına yerleştirin. NOT: Fırında 15 dakika sonra kahverengi-siyah parçacıklar görünmüyorsa, inkübe devam etmek için numuneleri 56 °C fırına iade edin, ancak >40 dakika boyunca değil. Kurumasını önlemek için karanlık kutuya biraz su eklenebilir.</li>
			<li>Çözelti A'yı aspire edin ve bulaşığı 5-6 kez damıtılmış suyla yıkayın, her seferinde 1-2 dakika.</li>
			<li>Masson-Fontana boyama kitinden 1 mL çözelti B (hipo çözelti) ekleyin ve kabı 3-5 dakika oda sıcaklığında bırakın.</li>
			<li>B çözeltisini aspire edin ve bulaşığı musluk suyuyla 3 kez, her seferinde 1 dakika yıkayın.</li>
			<li>Masson-Fontana boyama kitinden 1 mL çözelti C (nötr kırmızı boya) ekleyin ve kabı 3-5 dakika oda sıcaklığında bırakın.</li>
			<li>C çözeltisini aspire edin ve bulaşığı 3 kez damıtılmış suyla yıkayın, her seferinde 1 dakika.</li>
			<li>Hızlı dehidrasyon için 1 mL% 100 etanol ekleyin ve 3 dakika sonra etanolün aspire edilmesini sağlayın. NOT: Lekeli numuneler, ksilen ve nötr balsam ile kapatıldıktan sonra uzun süre saklanabilir.</li>
		</ol>
</li>
	</ol></li>
</ol>

<ol><li>Ezzedine, K., Eleftheriadou, V., Whitton, M., van Geel, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vitiligo%5BTitle%5D)+AND+%22Lancet%22%5BJournal%5D)">Vitiligo.</a> Lancet. 386 (9988), 74-84 (2015).</li>
<li>Picardo, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vitiligo%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews.+Disease+Primers%22%5BJournal%5D)">Vitiligo.</a> Nature Reviews. Disease Primers. 1, 15011(2015).</li>
<li>Speeckaert, R., van Geel, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vitiligo%3A+An+update+on+pathophysiology+and+treatment+options%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Clinical+Dermatology%22%5BJournal%5D)">Vitiligo: An update on pathophysiology and treatment options.</a> American Journal of Clinical Dermatology. 18 (6), 733-744 (2017).</li>
<li>Cortelazzi, C., Pellacani, G., Raposio, E., Di Nuzzo, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vitiligo+management%3A+combination+of+surgical+treatment+and+phototherapy+under+reflectance+confocal+microscopy+monitoring%5BTitle%5D)+AND+%22European+Review+for+Medical+and+Pharmacological+Sciences%22%5BJournal%5D)">Vitiligo management: combination of surgical treatment and phototherapy under reflectance confocal microscopy monitoring.</a> European Review for Medical and Pharmacological Sciences. 24 (13), 7366-7371 (2020).</li>
<li>Mohammad, T. F., Hamzavi, I. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Surgical+therapies+for+vitiligo%5BTitle%5D)+AND+%22Dermatologic+Clinics%22%5BJournal%5D)">Surgical therapies for vitiligo.</a> Dermatologic Clinics. 35 (2), 193-203 (2017).</li>
<li>Bishnoi, A., Parsad, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clinical+and+molecular+aspects+of+vitiligo+treatments%5BTitle%5D)+AND+%22International+journal+of+molecular+sciences%22%5BJournal%5D)">Clinical and molecular aspects of vitiligo treatments.</a> International journal of molecular sciences. 19 (5), 1509(2018).</li>
<li>Takahashi, K., Yamanaka, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+decade+of+transcription+factor-mediated+reprogramming+to+pluripotency%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews.+Molecular+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">A decade of transcription factor-mediated reprogramming to pluripotency.</a> Nature Reviews. Molecular Cell Biology. 17 (3), 183-193 (2016).</li>
<li>Yamanaka, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pluripotent+stem+cell-based+cell+therapy-promise+and+challenges%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Pluripotent stem cell-based cell therapy-promise and challenges.</a> Cell Stem Cell. 27 (4), 523-531 (2020).</li>
<li>Xu, J., Du, Y., Deng, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+lineage+reprogramming%3A+strategies%2C+mechanisms%2C+and+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Direct lineage reprogramming: strategies, mechanisms, and applications.</a> Cell Stem Cell. 16 (2), 119-134 (2015).</li>
<li>Ieda, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+reprogramming+of+fibroblasts+into+functional+cardiomyocytes+by+defined+factors%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Direct reprogramming of fibroblasts into functional cardiomyocytes by defined factors.</a> Cell. 142 (3), 375-386 (2010).</li>
<li>Gascón, S., Masserdotti, G., Russo, G. L., Götz, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+neuronal+reprogramming%3A+achievements%2C+hurdles%2C+and+new+roads+to+success%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Direct neuronal reprogramming: achievements, hurdles, and new roads to success.</a> Cell Stem Cell. 21 (1), 18-34 (2017).</li>
<li>Atkinson, P. J., Kim, G. S., Cheng, A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+cellular+reprogramming+and+inner+ear+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Expert+Opinion+on+Biological+Therapy%22%5BJournal%5D)">Direct cellular reprogramming and inner ear regeneration.</a> Expert Opinion on Biological Therapy. 19 (2), 129-139 (2019).</li>
<li>Kurita, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+reprogramming+of+wound-resident+cells+generates+skin+epithelial+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">In vivo reprogramming of wound-resident cells generates skin epithelial tissue.</a> Nature. 561 (7722), 243-247 (2018).</li>
<li>Yang, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+conversion+of+mouse+and+human+fibroblasts+to+functional+melanocytes+by+defined+factors%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Direct conversion of mouse and human fibroblasts to functional melanocytes by defined factors.</a> Nature Communications. 5, 5807(2014).</li>
<li>Fehrenbach, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Loss+of+tumorigenic+potential+upon+transdifferentiation+from+keratinocytic+into+melanocytic+lineage%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Loss of tumorigenic potential upon transdifferentiation from keratinocytic into melanocytic lineage.</a> Scientific Reports. 6, 28891(2016).</li>
<li>Majumdar, G., Vera, S., Elam, M. B., Raghow, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+streamlined+protocol+for+extracting+RNA+and+genomic+DNA+from+archived+human+blood+and+muscle%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">A streamlined protocol for extracting RNA and genomic DNA from archived human blood and muscle.</a> Analytical Biochemistry. 474, 25-27 (2015).</li>
<li>Bachman, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reverse-transcription+PCR+%28RT-PCR%29%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Enzymology%22%5BJournal%5D)">Reverse-transcription PCR (RT-PCR).</a> Methods in Enzymology. 530, 67-74 (2013).</li>
<li>Donaldson, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunofluorescence+staining%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Protocols+in+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Immunofluorescence staining.</a> Current Protocols in Cell Biology. 69 (1), 1-7 (2015).</li>
<li>Yin, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Non-viral+vectors+for+gene-based+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews.+Genetics%22%5BJournal%5D)">Non-viral vectors for gene-based therapy.</a> Nature Reviews. Genetics. 15 (8), 541-555 (2014).</li>
</ol>

Yazarların açıklayacağı bir çıkar çatışması yoktur.

Virüsün kalitesi, bu protokolde melanositlere doğrudan yeniden programlamanın başarısı için çok önemlidir. Bu protokoldeki virüsleri paketleme ve yoğunlaştırma yöntemi basit ve tekrarlanması kolaydır ve başka herhangi bir yardımcı konsantre reaktife dayanmaz. Bu protokol çoğu laboratuvarda başarıyla takip edilebilir. Konsantre virüsün kalitesini sağlamak için, aşağıdaki noktalara özel dikkat gösterilmesi gerekir. Birincisi, HEK-293T'nin hücre durumudur. HEK-293T hücreleri ölümsüzleştirilmiş hücreler olmasına rağmen, kons...

Vitiligo, etkilenen bireylerin fiziksel ve zihinsel sağlığını ciddi şekilde etkileyen bir cilt hastalığıdır. Metabolik anormallikler, oksidatif stres, inflamatuar mediatörlerin oluşumu, hücre dekolmanı ve otoimmün yanıt gibi çeşitli nedenlerden dolayı, fonksiyonel melanositler kaybolur ve melanin salgılanması durdurulur ve vitiligo 1,2'nin gelişmesine yol açar. Bu durum yaygın olarak görülür ve özellikle yüzünde sorunludur. Ana tedavi kortikosteroidlerin ve immünomodülatörlerin sistemik kullanımıdır. Fototerapi sistemik veya lokal hastalıklarda kullanılabilmekte olup, delikli deri nakli ve otolog melanosit transplantasyonu gibi cerrahi tedaviler vardır 3,4,5. Bununla birlikte, ilaç tedavisi ve fototerapi kullanan hastalar nüksetmeye eğilimlidir ve bu tedavilerin uzun vadeli terapötik etkileri zayıftır. Cerrahi tedavi travmatiktir ve sadece orta derecede etkilidir 2,6. Bu nedenle vitiligo için yeni ve etkili bir tedavi stratejisine ihtiyaç vardır.
İndüklenmiş pluripotent kök hücrelerin (iPSC'ler) yeniden programlanması, bu hücreleri terminal durumlarından pluripotent bir duruma çevirir, bu da transkripsiyon faktörleri, Oct4, Sox2, Klf4 ve c-Myc7 tarafından aracılık edilen bir süreçtir. Bununla birlikte, tümörojenisite olasılığı ve uzun üretim süresi nedeniyle, bu teknoloji klinik ortamlara uygulandığında şüphecilikle karşılanmıştır8. Doğrudan yeniden programlama, bir terminal hücresi türünün başka bir terminal hücresi türüne dönüşmesini sağlayan bir teknolojidir9. Bu işlem uygun transkripsiyon faktörleri ile elde edilir. Kardiyomiyositler10, nöronlar 11 ve koklear saç hücreleri12 dahil olmak üzere çeşitli hücreler doğrudan başarıyla yeniden programlanmıştır. Bazı araştırmacılar, cilt dokusunu doğrudan in situ olarak yeniden programlamışlardır, bu da yara onarımı için kullanılabilir13. Doğrudan yeniden programlamanın avantajları arasında daha az bekleme süresi ve maliyeti, daha düşük kanser riski, daha az etik sorun ve hücre kaderinin belirlenmesinin altında yatan mekanizmanın daha iyi anlaşılmasıyer almaktadır 9.
Doğrudan yeniden programlama yöntemi yaygın olarak kullanılmasına rağmen, özellikle14,15 olarak kabul edilecek çok sayıda transkripsiyon faktörü nedeniyle, cilt hücrelerinin melanositlere doğrudan yeniden programlanması için şu anda kesin bir yöntem yoktur. Transkripsiyon faktörleri, Mitf, Sox10 ve Pax3, cilt hücrelerinin melanositlere doğrudan yeniden programlanması için kullanılmıştır14. Buna karşılık, MITF, PAX3, SOX2 ve SOX9'un kombinasyonu, başka bir çalışmada cilt hücrelerinin insan melanositlerine doğrudan yeniden programlanması için de kullanılmıştır15. Bu protokolde, farklı bir tarama yönteminin kullanılmasına rağmen, daha önce tarif edildiği gibi cilt hücrelerinin melanositlere doğrudan yeniden programlanması için Mitf, Sox10 ve Pax3 kombinasyonu ile aynı sonuç elde edilmiştir14. Diğer cilt hücrelerinden melanosit üretmek için bir sistem geliştirmek, vitiligo hastalarının diğer cilt hücrelerini melanositlere dönüştürmek için bir şema sağlayabilir. Bu nedenle, melanositleri başarılı bir şekilde üretmek için bu doğrudan yeniden programlama için basit ve etkili bir yöntem oluşturmak çok önemlidir.

<table><tbody><tr><td>% 0.05 Tripsin-EDTA</td><td>Gibco</td><td>25300-062</td><td>-20 °C'de saklanır; C</td></tr><tr><td>0.45 & mu; M filtre</td><td>Millipore</td><td>SLHVR33RB</td><td></td></tr><tr><td>5 mL polistiren yuvarlak tabanlı tüp</td><td>Falcon</td><td>352052</td><td></td></tr><tr><td>%95/%100 etanol</td><td>LANBAO</td><td>210106</td> RT Adenine Sigma A2786'da <td>saklanır</td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td>Stok konsantrasyonu 40 mg / mL Nihai konsantrasyon 24 ve mikro; g / mL</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 555 Keçi anti-Fare IgG2a</td><td>Invitrogen</td><td>A21137</td><td>Antibiyotik kullanmak için 1:500 seyreltme</td></tr><tr><td>(Kalem / Strep)</td> <td>Gibco</td><td>15140-122</td><td>-20 ° C'de saklanır; C</td></tr><tr><td>Anti-TRP1/TYRP1 Antikor</td><td>Kırkayak</td><td>MABC592</td><td>Konakçı/İzotip: Fare IgG2a Tür reaktivitesi: Fare/İnsan </td></tr><tr><td>Anti-TRP2/DCT</td><td>Antikoru Abcam</td><td>ab74073</td> kullanmak için 1:200 seyreltme <td>Konak/İzotip: Tavşan IgG Tür reaktivitesi: Fare/İnsan CHIR99021 Stemgent 04-0004 kullanmak için 1:200 seyreltme</td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td>Stok konsantrasyonu 10 mM Final konsantrasyon 3 &mu; M</td></tr><tr><td>Kolera toksini</td><td>Sigma</td><td>C8052</td><td>Stok konsantrasyonu 0.3 mg / mL Son konsantrasyon 20</td></tr><tr><td>pM Cy3 Keçi anti-Tavşan IgG (H + L)</td> <td>Jackson Immunoresearch</td><td>111-165-144</td> DMEM (Yüksek glikoz) <td>kullanmak için 1:500 seyreltme</td></tr> <tr><td></td><td>HyClone</td><td>SH30243.01</td><td>4 &°C'de saklanır; C</td></tr><tr><td>DMSO&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>D2650</td><td>RT</td></tr><tr><td>FBS</td><td>Gibco</td><td>10270-106'da</td><td>saklanır -20 &°C'de saklanır; C Kullanmadan önce ısıyla inaktive</td></tr> edilmiş <tr><td>Jelatin</td><td>Sigma</td><td>G9391</td><td>RT</td></tr><tr><td>GFP-PURO plazmitlerinde saklanır (Mitf, Sox10, Pax3, Sox2, Sox9 ve Snai2)</td><td>Hanheng Biological Technology Co., Ltd.</td><td>pHBLPm003198 pHBLPm001143 pHBLPm002968 pHBLPm002981 pHBLPm004348 pHBLPm000325</td><td>-20 °C'de saklanır; C</td></tr><tr><td>Hematoksilen</td><td>Abcam</td><td>ab220365</td><td>RT</td></tr><tr><td>İnsan EDN3</td><td>Amerikan-Peptit</td><td>88-5-10A'da</td> saklanır <td>Stok konsantrasyonu 100 &mu; M Nihai konsantrasyon 0.1 &mu; M</td></tr><tr><td>Hidrokortizon</td><td>Sigma</td><td>H0888</td><td>Stok konsantrasyonu 100 & g / mL Nihai konsantrasyon 0.5 &mikro; g/mL</td></tr><tr><td>L-DOPA</td><td>Sigma</td><td>D9628</td><td>RT</td></tr><tr><td>Lipofectamine 2000</td><td>Invitrogen</td><td>11668-019</td><td>Transfeksiyon reaktifinde saklanır, 4 ° C'de saklanır; C</td></tr><tr><td>Masson-Fontana boyama kiti</td><td>Solarbio</td><td>G2032</td><td>4 ° C'de saklanır; C</td></tr><tr><td>Nötr balsam</td><td>Solarbio</td><td>G8590</td><td>4 °C'de saklanır; C</td></tr><tr><td>Paraformaldehit</td><td>Sigma</td><td>P6148</td><td>RT</td></tr><tr><td>PBS (-)</td> <td>Gibco'da</td> saklanır <td>C10010500BT</td> RT <td>Phorbol</td></tr><tr><td>12-miristat 13-asetat (TPA)</td> <td>Sigma</td><td>P8139'da</td> saklanır <td>Stok konsantrasyonu 1 mM Nihai konsantrasyon 200 nM</td></tr><tr><td>Polibren</td><td>Sigma</td><td>H9268</td><td>katyonik polimerik transfeksiyon reaktifi; Stok konsantrasyonu 8 &mu; g/&mikro; L Nihai konsantrasyon 4 ng/&mikro; L</td></tr><tr><td>Puromycin</td><td>Gibco</td><td>A11138-03</td><td>-20 °C'de saklanır; C</td></tr><tr><td>Rekombinant insan bFGF</td><td>Invitrogen</td><td>13256-029</td><td>Stok konsantrasyonu 4 &mu; g/mL Nihai konsantrasyon 10 ng/mL</td></tr><tr><td>Rekombinant insan insülini</td><td>Sigma&nbsp;</td><td>I3536</td><td>Stok konsantrasyonu 10 mg/mL Nihai konsantrasyon 5 & mikro; g/mL</td></tr><tr><td>Rekombinant insan SCF</td><td>R& D</td><td>255-SC-010</td><td>Stok konsantrasyonu 200 &mu; g/mL Nihai konsantrasyon 100 ng/mL</td></tr><tr><td>RPMI-1640</td><td>Gibco</td><td>11875-093</td><td>4 °C'de saklanır; C</td></tr><tr><td>Ksilen</td><td>Sigma</td><td>1330-20-7</td><td>RT'de saklanır</td></tr></tbody></table>

fare fibroblastlarının melanositlere doğrudan yeniden programlanması

Direct Reprogramming of Mouse Fibroblasts into Melanocytes

Melanositlerin fonksiyon kaybı, etkilenen bireylerin fiziksel ve zihinsel sağlığını ciddi şekilde etkileyen vitiligoya yol açar. Halen, vitiligo için etkili bir uzun süreli tedavi yoktur. Bu nedenle, vitiligo için uygun ve etkili bir tedavi geliştirmek zorunludur. Cilt hücrelerinin melanositlere doğrudan yeniden programlanması için rejeneratif tıp teknolojisi, vitiligo'nun umut verici yeni bir tedavisi gibi görünmektedir. Bu, vitiligolu hastalarda melanosit kaybını iyileştirmeye yardımcı olmak için hastanın cilt hücrelerinin fonksiyonel melanositlere doğrudan yeniden programlanmasını içerir. Bununla birlikte, bu yöntemin önce fareler üzerinde test edilmesi gerekir. Doğrudan yeniden programlama yaygın olarak kullanılmasına rağmen, melanositlere doğrudan yeniden programlama için net bir protokol yoktur. Dahası, mevcut transkripsiyon faktörlerinin sayısı çok fazladır. 
Burada, cilt hücrelerini melanositlere yeniden programlamak için seçilen transkripsiyon faktörlerini üretmek için Sox10, Mitf, Pax3, Sox2, Sox9 ve Snai2 dahil olmak üzere konsantre bir lentivirüs paketleme sistemi protokolü sunulmaktadır. Fare embriyonik fibroblastları (MEF'ler), MEF'lerin in vitro olarak indüklenmiş melanositlere (iMel'ler) doğrudan yeniden programlanması için tüm bu transkripsiyon faktörleri için konsantre lentivirüs ile enfekte olmuştur. Ayrıca, bu transkripsiyon faktörleri tarandı ve sistem melanositlere doğrudan yeniden programlama için optimize edildi. iMel'lerde melaninin karakteristik belirteçlerinin gen veya protein seviyesinde ekspresyonu önemli ölçüde artmıştır. Bu sonuçlar, fibroblastların melanositlere doğrudan yeniden programlanmasının vitiligo için başarılı bir yeni terapötik strateji olabileceğini ve fibroblastların in vivo melanositlere doğrudan yeniden programlanması için temel oluşturacak melanosit gelişim mekanizmasını doğrulayabileceğini düşündürmektedir.

Bu makalede, fibroblastların melanositlere doğrudan yeniden programlanması için transkripsiyon faktörlerinin lentivirüsünü üretmek için konsantre bir lentivirüs paketleme sisteminin protokolleri ve transkripsiyon faktörlerinin taranması ve melanositlerin MEF'lerden doğrudan yeniden programlanması için protokoller bulunmaktadır.
Konsantre lentivirüs üretiminin başarısı, GFP'nin floresan yoğunluğunu gözlemleyerek (Şekil 1A) veya HEK-293T hücrelerini konsantre olmaya...

Burada, melanositler için optimize edilmiş bir doğrudan yeniden programlama sistemi ve sorunsuz doğrudan yeniden programlama sağlayan yüksek verimli, konsantre bir virüs paketleme sistemi açıklanmaktadır.

Fare Fibroblastlarının Melanositlere Doğrudan Yeniden Programlanması

The loss of function of melanocytes leads to vitiligo, which seriously affects the physical and mental health of the affected individuals. Presently, ...

Melanositler üretmek için doğrudan yeniden programlama bildirilmiştir. Bununla birlikte, farklı çalışmalarda çeşitli transkripsiyon faktörleri kullanılmaktadır. Bu protokolde, transkripsiyon faktörü sayısını hala daha yüksek yeniden programlama verimliliği ile doğruladık ve azalttık.Sadece üç transkripsiyon faktörü olan Mitf, Sox10 ve PAX3'ü kullanarak melanositler üretmek için doğrudan bir yeniden programlama sistemi kurduk ve kültür sistemini daha kararlı ve sağlam hale getirmek için değiştirdik. Fonksiyonel melanositlerin nasıl yenileneceği, vitiligo gibi depigmentasyon hastalıkları için tedavi sınırlamalarının ele alınmasına yardımcı olabilecek önemli bir sorudur. Doğru yeniden programlama, ileriye dönük bir teknik sağlar Tekniğimiz, tanıtılması ve tekrarlanması daha kolay olan kolaylık, güçlü çalışabilirlik ve kararlılık özelliklerine sahiptir.Konsantre lentivirüsün üretimine başlamak için, 6 HEK-293T hücresine 1,5 kez 10 kez 60 milimetrelik bir kaba yerleştirin ve normal ortama sahip hücreleri% 5 karbondioksit içeren nemlendirilmiş bir inkübatörde 37 santigrat derecede kültürleyin. Kuluçkadan 24 saat sonra, HEK-293T hücreleri% 80 ila% 90 akıcılığa ulaştığında, ortamı 3.5 mL DMEM ile değiştirin, ardından hücreleri iki saat boyunca% 5 karbondioksit içeren nemlendirilmiş bir inkübatörde 37 santigrat derecede inkübe edin. Hücreleri inkübatörden çıkardıktan sonra, ortamı% 2 FBS içeren DMEM ile değiştirin ve taze hazırlanmış transfeksiyon kompleksi karışımını hücrelere damla damla bir şekilde ekleyin.Sıvı karışımı nazikçe karıştırın. Sekiz saatin sonunda, hücre ortamını 3.5 mL normal ortam ile değiştirin. Virüs süpernatantını 24 ve 48 saatte toplayın.Daha sonra, iki farklı zaman noktasında toplanan virüs süpernatantlarını karıştırın ve karışımı dört santigrat derecede beş dakika boyunca 200 xg'de santrifüj edin. Daha sonra toplanan süpernatantı 50 mL'lik steril konik bir tüpte filtrat toplamak için 0.45 mikron filtrelerden geçirin. Filtrelenmiş virüs süpernatantını gece boyunca dört santigrat derecede 6.000 xg'de santrifüjleme ile konsantre edin.İşiniz bittiğinde, virüs peletinin konik tüpün dibinde görünür olduğundan emin olun. Süpernatantı yavaşça dökün. Virüs peletini normal ortamda, virüs süpernatantının 100th * hacminin bir tanesi ile çözmek için.Homojen bir 100x konsantre virüs karışımı elde edilene kadar yavaşça yukarı ve aşağı pipet yapmak için bir P1000 mikropipet kullanın. Konsantre virüsü 80 santigrat derecede saklamak için mikrosantrifüj tüplerine bölün. 5. HEK-293T hücrelerine 1 kez 10 kez altı delikli bir plakanın bir kuyucuğuna plaka yapın.Bu hücreleri% 5 karbondioksit içeren nemlendirilmiş bir inkübatörde 37 santigrat derecede normal ortamla kültürleyin. 24 saat sonra, her bir kuyucuğa 100x floresan konsantre virüsün 0.1 ila 0.2 mikrolitresini ekleyin. Bunu takiben, her bir kuyucuğa katyonik polimerik transfeksiyon reaktifinin mikrolitresi başına dört nanogram eklenmesi takip edilir.Virüs ile enfeksiyondan yaklaşık sekiz ila on iki saat sonra, ortamı normal ortamla değiştirin. Enfeksiyondan kırk sekiz saat sonra, ölü hücreleri çıkarmak için bulaşığı 1 mL steril PBS ile yıkayın. Daha sonra, oda sıcaklığında altı delikli bir plakanın kuyucuğu başına 250 mikrolitre% 0.05 tripsin-EDTA çözeltisi kullanarak hücreleri tripsinize edin.Plakayı dört santigrat derecede beş dakika boyunca 200 xg'de santrifüj yapın. Süpernatanı çıkardıktan sonra, hücre peletini bir mL PBS içinde tekrar askıya alın ve hücre süspansiyonunu beş mL'lik polistiren yuvarlak tabanlı bir tüpe ekleyin. Ardından, numuneyi analiz etmek için tüpü akış sitometresine yerleştirin.Fibroblastların doğrudan yeniden programlanması için, altı kuyucuklu bir hücre kültürü plakasının bir kuyucuğunu, oda sıcaklığında 1 mL% 0.1 jelatin çözeltisi ile kaplayın. 15 ila 30 dakika sonra, kuyu tamamen jelatin ile kaplandığında,% 0.1 jelatin çözeltisini aspire edin. Daha sonra, 4. fare embriyonik fibroblastlarına veya MEF'lere 5 kez 10 kez,% 0.1 jelatin ile kaplanmış altı kuyucuklu bir plakanın bir kuyucuğuna plakalayın ve% 5 karbondioksit içeren nemlendirilmiş bir inkübatörde hücreleri 37 santigrat derecede normal ortamla gece boyunca kültürleyin.24 saat sonra, MEF'ler% 40 ila% 50 akıcılığa ulaştığında, ortamı normal ortamla değiştirin. Daha sonra, donmuş, konsantre virüsü buz üzerinde eritin. Denklemi kullanarak eklenecek virüsün hacmini hesaplayın ve ardından hesaplanan hacme göre altı transkripsiyon faktörü için konsantre virüsü her bir kuyucuğa ekleyin.Katyonik polimerik transfeksiyon ajanının mL'si başına dört mikrogramı kuyucuğa ekleyin. Bunu lentivirüs enfeksiyonunun sıfır günü olarak düşünün. İlk gün, 8 ila 12 saatlik enfeksiyondan sonra, virüsü içeren ortamı taze normal ortamla değiştirin, kararlı enfekte hücre hatlarını taramak için mL puromisin başına 0.5 mikrogram ekleyin.İkinci günde, enfeksiyondan 48 saat sonra, süpernatant ortamı yavaş yavaş yeniden programlama ortamı ile değiştirin. Üç mikromolar CHIR99021 eklemeden önce toplam orta hacmin dörtte birini değiştirin. Üçüncü günden yedinci güne kadar, hücrelerin durumuna bağlı olarak, beş gün içinde tam yeniden programlama ortamına geçmek için ortamı kademeli olarak daha yüksek oranda yeniden programlama ortamıyla değiştirerek ortamı değiştirin.Daha sonra, hücreleri oda sıcaklığında üç dakika boyunca 500 mikrolitre% 0.05 tripsin-EDTA sindirim enzimi ile ayırın. Hücrelerin yaklaşık yüzde altmışı yüzdüğünde, sindirim enziminin hacminin iki katı olan normal ortamı ekleyerek sindirimi durdurun. Hücre süspansiyonunu 15 mL'lik steril konik bir tüpte toplayın ve dört santigrat derecede beş dakika boyunca 200 xg'de santrifüj yapın.Hücre peletini yeniden programlama ortamıyla yeniden askıya almadan önce süpernatantı çıkarın. İşiniz bittiğinde, yeniden askıya alınan hücreleri 60 milimetrelik steril bir kapta tabaklayın. Hücreleri nemlendirilmiş% 5 karbondioksit inkübatöründe 37 santigrat derecede kültürleyin.HEK-293T hücrelerinde kırk sekiz saatlik lentivirüs enfeksiyonundan sonra, konsantre lentivirüs üretiminin başarısı, GFP'nin floresan yoğunluğunu gözlemleyerek veya akış sitometrisi ile değerlendirildi. Konsantre virüsün titresinin 10 ila 8. TU / mL'de yüksek olduğu bulundu. Fibroblastların doğrudan yeniden programlanması sırasında, hücre morfolojisi yavaş yavaş uzatılmış hücre sinapsına ve genişlemiş hücre çekirdeklerine dönüştü.Bununla birlikte, hücreler yirmi günden sonra giderek yaşlanır. Transkripsiyon faktörlerinin, Mitf, Pax3 veya Sox10'un çıkarılması, melanositik genlerin, Tyr, Tyrp1 ve Mlana'nın ekspresyonunun susturulmasıyla sonuçlandı ve bu da fibroblastın melanositlere dönüşümü üzerindeki en büyük etkiyi gösterdi. Bu nedenle, üç transkripsiyon faktörü ile doğrudan programlama tarafından indüklenen melanositik genlerin ekspresyonu, altı transkripsiyon faktörü ile karşılaştırıldığında daha yüksekti.MEF ile indüklenen melanositleri veya iMel'leri tanımlamak için, melanositik belirteçlerin, TYRP1 ve DCT'nin ekspresyonu, immünofloresan boyama kullanılarak tespit edildi. Ayrıca, DOPA ve Masson-Fontana boyama gibi melanine özgü boyama yöntemleri olumlu sonuçlar göstermiştir. 293T hücreleri eşit olarak dağıtılmalıdır.Ayrıca, hücrelere transfeksiyon karışımının eklenmesi, hücrelerin yüzmesini önlemek için nazikçe yapılmalıdır. Protokol kararlı ve pratiktir ve diğer hücre türlerini yeniden programlamak için kullanılabilir. Gelecekteki tıpta melanosit rejenerasyonunda in vivo doğrudan yeniden programlama için bir referans ve strateji sağlamayı beklemektedir.

direct-reprogramming-of-mouse-fibroblasts-into-melanocytes

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Gelişim Biyolojisi

Bu video indüklenebilir lentivirüs kullanarak bağlı pluripotent kök hücreleri üretmek için prosedürü ifade Oct4, Sox2, c-Myc ve Klf4 gösterir.

Sox-2 Zorla İfade yoluyla MEFS iPS Hücreler oluşturma, Eki 4, c-Myc ve Klf4

Bu videoda, doğum sonrası fare yavrusunun derisinden melanositleri ve fibroblastı aynı anda izole etmek ve kültürlemek için hızlı yöntem açıklanmaktadır. Bu hücreler, cilt hücresi biyolojisini, yara iyileşmesini ve melanomu incelemek için in vitro olarak korunabilir ve manipüle edilebilir.

Primer Murin Melanositlerinin ve Fibroblastlarının Hızlı Kültürlenmesi: Tüm Murin Deri Örneğinden Melanositlerin ve Fibroblastların İzole Edilmesi

Uyarılmış pluripotent kök hücrelerin üretilmesi otolog nakli türetilmesi için ilginç umutları sağlar. Ancak, pluripotent devlet ve zahmetli yeniden farklılaşma yoluyla ilerleme hala klinik çeviri engellemektedir. Burada erişkin insan fibroblast türetme ve uyarılmış nöral progenitör hücrelerin içine doğrudan dönüşüm ve nöral soy içine sonradan farklılaşmayı açıklar.

Yetişkin İnsan Fibroblastları türetilmesi ve Genişletilebilir Sinir Progenitör Hücreler içine Doğrudan Dönüşüm

Burada açıklanan protokol, minimal bir transkripsiyon faktörü setinin aşırı ekspresyonu yoluyla fare embriyonik fibroblastlarında bir hemojenik programın indüksiyonunu detaylandırır. Bu teknoloji, hematopoez, hematolojik hastalık ve hematopoietik kök hücre nakli ile ilgili gelecekteki çalışmalar için platformlar sağlamak üzere insan sistemine çevrilebilir.

Transkripsiyon Faktörleri ile fare embriyonik fibroblastlar yeniden programlama bir Hemogenic Programı tetikleyebilecek

Burada birincil embriyonik fibroblastlar içine fonksiyonel cardiomyocytes overexpression GATA4, Hand2, Mef2c, Tbx5, miR-1 ve miR-133, TGF-β sinyal inhibisyon yanında (GHMT2m) aracılığıyla yeniden programlamak için sağlam bir yöntem mevcut. Bizim iletişim kuralı dayak cardiomyocytes 7 gün sonrası iletim % 60 ile olduğu kadar erken oluşturur verimlilik.

Pro-fibrotik sinyal bastırma faktörü-aracılı fare embriyonik fibroblastlar indüklenen Cardiomyocytes yeniden programlama Potentiates

Üreten indüklenen için burada bizim iletişim kuralı mevcut erythroid ataları (iEPs) üzerinden fare yetişkin fibroblastlar transkripsiyon faktörü odaklı kullanarak doğrudan lineage (DLR) yeniden şekillendirmek için.

Lineage yetişkin fare Fibroblast Erythroid ataları için yeniden programlama doğrudan

Burada biz insan birincil fibroblastlar değiştirilmiş mRNA'ların programlama faktörler kodlama kullanarak indüklenmiş pluripotent kök hücre yeniden programlamak için klinik, yüksek verimli, besleyici-Alerjik bir yöntemi açıklamak ve olgun mikroRNA-367/302 taklit eder. Ayrıca programlama verimlilik, değerlendirmek için yöntem klonal IPSC kolonileri genişletin ve pluripotency işaretin TRA-1-60 ifade onaylamak bulunmaktadır.

RNA tabanlı insan birincil fibroblastlar indüklenmiş Pluripotent kök hücre yeniden programlama

Bu protokol, 0-4 gün eski farelerin derisinden melanosit ve fibroblast kültürlerini eşzamanlı olarak oluşturmak için hızlı bir yöntem özetliyor. Bu primer kültürler, cilt hücresi biyolojisi, pigmentasyon, yara iyileşmesi ve melanom dahil olmak üzere fizyolojik olarak ilgili süreçlerin çeşitli çalışma için muhafaza ve manipüle edilebilir.

Primer Murine melanosit ve fibroblast kültürlerinin hızlı üretimi

Bu protokol, insan dermal fibroblastlarında hemojenik bir programın hematopoetik kök ve döl hücreleri üretmek için gata2, GFI1B ve FOS transkripsiyon faktörlerinin zorunlu ekspresyonu ile indüksiyonuna neden olduğunu göstermektedir.

Transkripsiyon Faktörlerinin Zorunlu İfadesi Ile İnsan Fibroblastlarının Hemojenik Yeniden Programlanması

Hücre yeniden programlama, pluripotent hücre durumunu düzenleyen ve koruyan anahtar genlerin tanıtılmasını gerektirir. Açıklanan protokol, insan dermal fibroblastlarından viral/entegre yöntemler olmadan ancak modifiye edilmeyen RNA'lar (NM-RNA) kullanarak hücresel savunma mekanizmalarını azaltan immün kaçırma faktörleri ile birlikte indüklenen pluripotent kök hücrelerin (iPSCs) kolonilerinin oluşmasını sağlar.

Erişkin İnsan Dermal Fibroblastlarının Abdominal Deriden İzolasyon ve İndüklenen Pluripotent Kök Hücrelerin Indüklenen Alacalı Kök Hücrelerin Indükleyici Olmayan Yöntemle Üretilmesi

Bu protokol, cilt fibroblastlarının miyoblastlara dönüşümünü ve farklılaşmalarını miyotüplere açıklar. Hücre hatları nöromüsküler bozukluğu olan hastalardan türetilmiştir ve patolojik mekanizmaları araştırmak ve terapötik stratejileri test etmek için kullanılabilir.

Nöromüsküler Bozukluklar için Tedavileri Araştırmak için İnsan Fibroblastlarının Myoblastlara Doğrudan Yeniden Programlanması

Öğrenin fare fibroblastlarının melanositlere doğrudan yeniden programlanması için optimize edilmiş yöntemi. Mitf, Sox10 ve PAX3 transkripsiyon faktörleri kullanılarak yüksek verimlilik ve stabilite sağlanmaktadır.

Fare Fibroblastlarının Melanositlere Doğrudan Yeniden Programlanması

Daha fazla video keşfet