Genetik Olarak Kodlanmış Ca²⁺ Göstergeleri (GECI'ler) Kullanarak Astrositlerde ve Nöronlarda Mitokondriyal Ca²⁺ Alımı Görüntüleme

Prosedürü gösteren yüksek lisans öğrencisi Zhe Zhang, araştırma uzmanı Nannan Zhang, profesörler Illker Özden ve Shinghua Ding olacak. Bu prosedürün genel amacı, genetik olarak kodlanmış kalsiyum göstergesi, GCaMP5G ve 6s kullanarak in vitro ve in vivo mitokondriyal görüntüleme sayıları için hücre tipi spesifik çift astrositler ve nöronlar ve mitokondriyal hedefleme yöntemini geliştirmektir. İn vitro veya in vivo görüntüleme için, astrosit veya nöronlara özgü organizatörler gfaABC1D veya CaMKII içeren DNA plazmidleri ve genetik olarak kodlanmış kalsiyum göstergeleri, mitokondriyal hedefleme dizilimleri olan GCaMP5G/6'lar inşa edeceğiz.

İn vitro mitokondriyal kalsiyum görüntüleme için, lipofectamin yöntemini kullanarak yukarıda belirtilen DNA plazmidleri ile cam kapak kaymaları üzerinde kültürlenmiş astrosit nöronlarını transkâr ettik. Cam kapak kaymalarının epifluoresans veya iki foton mikroskobu altında bolluk odasına aktarılmasıyla transeksiyondan bir ila iki gün sonra görüntülemeye başlanabilir. İşte mitokondriden floresan sinyal örnekleri ve solda GCaMP6s'ı ifade eden bir astrosit ve sağdaki GCaMP5G'yi ifade eden bir nörondaki mitokondri için.

In vivo görüntüleme için, astrositlerde mito-GCaMP5G ekspresyonu için serotip 5 ilişkili adenovirüs ve nöronlarda mito-GCaMP6s ekspresyonu için serotip 9 ilişkili adenovirüs hazırladık. Stereotaksik virüs enjeksiyon ameliyatları için önce fareyi %3 izofluran ile uyuşturduk. Ameliyat sırasında daha sonra izofluran seviyeleri %2'ye düşürülür Uygun anestezi seviyesine ulaşıldıktan sonra saç derisinin üzerindeki saçlar tıraş edilir ve fare stereotaks cerrahi bir alet üzerine yerlenir.

Ameliyat sırasında onları korumak için gözlere oftalmik bir merhem uygulanır. Enjeksiyon ameliyatları steril aletler ve aseptik teknikler de dahil olmak üzere aseptik prosedürler kullanılarak gerçekleştirilir. Cerrahi aletler ya otoklavlama ya da sıcak boncuk sterilizatörü ile sterilize edilir.

Fare stereotaks üzerine monte edildikten sonra, kafa derisi betadin ve% 70 etanol ile üç kez temizlenir. Daha sonra cilt Bregma Lambda ekseni boyunca kesilir ve dikey hedef konum üzerinde yüksek hızlı bir matkapla yapılır. Bu çalışmada ya motor korteksi ya da parakorteksi hedef aldık.

İlişkili bir adenovirüs vektörü taşıyan 33 kalibrelik hamilton şırınnası delikten beyne yerleştirilir ve hedef bölgeye vektörler enjekte edilir. Kortikal teslimat için virüs çözeltisini birden fazla adımda iki derinlikte enjekte ediyoruz. İlk olarak, iğneyi korteksin bir milimetre derinine yerleştiriyoruz.

Beynin iyileşmesi için beş dakika izin ettikten sonra, iğneyi 700 mikrometre derine kadar hareket ettiriyoruz, 500 nano litre virüs çözeltisi enjekte ediyoruz. Enjeksiyon tamamlandıktan sonra, virüsün beyinde yayılması için beş dakika bekleriz. Sonra iğneyi 300 mikrometre derinlikteki ikinci enjeksiyon yerine taşıyacağız.

Burada, 500 nano litre daha virüs çözeltisi enjekte ediyoruz. Enjeksiyon tamamlandıktan sonra, virüsün yayılmasına izin vermek için 10 dakika bekleriz ve ardından iğneyi beyinden çıkarır ve çapak deliğini kemik balmumu veya Kwik-Sil ile kapatırız. Son olarak, cilt Vetbond ile dikilir ve fare hayvan tesisine geri gönderilmeden önce bir ısıtma yastığı üzerinde kurtarılmıştır.

Fare, GCaMP ifadesinin olgunlaştığı zaman dilimi olan en az üç hafta içinde in vivo görüntüleme için kullanıma hazır olacaktır. Kranial pencere implantasyon ameliyatları da enjeksiyon ameliyatları için açıklandığı gibi aseptik durumlar kullanılarak yapılır. Kranial pencere cerrahi prosedürleri kafatasına maruz kalma noktasına kadar enjeksiyon cerrahi prosedürleri ile aynıdır.

Kafatası açığa çıktıktan sonra, virüs enjekte edilen bölge üzerindeki 2-3 mm çapındaki kraniyotomi çeyrekleri, bir manipülatöre bağlı yüksek hızlı bir matkap tarafından yapılan dört sığ delik ile işaretlenir. Daha sonra kafatasının kraniyotomi geçitlerindeki bölümü, bu dört deliği birbirine bağlayarak kemiği bir daire içinde dikkatlice ve yavaşça delerek inceltilir. Sınırlardaki kafatası yeterince ince olduğunda, kemik keskin cımbızla kaldırılır ve çıkarılır.

Maruz kalan dura mater, kraniyal pencerenin implantasyonu için çıkarılabilir veya bozulmadan tutulabilir. Kranial penceremiz, merkezde yaklaşık 300 mikron kalınlığında bir silikon disk oluşturan 3-5 milimetre çapında bir cam kapak kaymasından oluşur. Kranial pencerenin montajı kraniyotomi üzerine yerleştirilerek gerçekleştirilir.

Bir manipülatöre bağlı bir kürdan parçası, kraniyal pencereyi beynin yüzeyine hafifçe itmek için kullanılır. Daha sonra, kranial pencerenin kenarı az miktarda silikon yapıştırıcı Kwik-Sil ile kapatılır. Son olarak, kranial pencere diş akrilik ile kafatası kenarlarına sabitlenir.

Güçlü yapıştırma için diş akrilikinin kranial pencerenin kenarlarına hafifçe uygulanmasına özen gösterilmelidir. Geçmişte diğer birçok araştırma grubunun uyguladığı gibi, silikon diske alternatif olarak kapak camı ve beyin arasında% 1.2 agarose jel kullanılabilir. Kranial pencere güvenli bir şekilde monte edildikten sonra, kafatasına metal bir plaka tutturulur.

Bu kafa plakası, görüntüleme seansları sırasında farenin başını iki foton mikroskop sahnesinde sabitlemek için kullanılacaktır. Astrositlerde mitokondriyal kalsiyum alımı ATD uygulaması ile ortaya çıkabilirken, nöronlarda mitokondriyal kalsiyum alımı yapay serebral spinal sıvıda glutamat glisin uygulaması ile, bir perfüzyon sistemi ile yerçekimi ile ortaya çıkabilir. Astrositlerde ve nöronlarda bireysel mitokondrilerde kalsiyum alımı daha sonra gözlenebilir.

Aşağıdaki filmler, solda ATP tarafından ortaya çıkan bir astrositte ve sağdaki glutamat ve glisin tarafından ortaya çıkan bir nöronda mitokondriyal kalsiyum alımını göstermektedir. Görüntüleme, Coherent'ten bir milyon Ti Sapphire Ultra bir lazerle donatılmış Prairie Technologies'den Ultima iki fotonlu mikroskopi sistemi ile astrositlerde ve nöronlarda mitokondriyal floresan sinyallerin zaman atlamalı in vivo iki foton görüntülerinin toplanmasıyla yapılır. GCaMP5G ve 6s ile in vivo görüntüleme için en uygun olan 880 ila 910 nanometrelik ekscitasyon dalga boylarını kullanıyoruz.

Astrositler ve mito-GCaMP5G ve 6s'in nörona özgü ekspresyasyonu ve SR101 veya nörona özgü belirteç NeuN'un astrositlere özgü etiketlemesinin birlikte lokalizasyonu ile yeniden doğrulanmıştır. Astrositlerde ve in vivo nöronlarda spontan mitokondriyal kalsiyum alımı, iki fotonlu mikroskopi kullanılarak hızlandırılmış görüntüleme ile gözlemlenebilir. Görüntüler, solda bir astrositte ve sağda bir nöronda bireysel mitokondrilerde spontan kalsiyum artışlarını göstermektedir.

Yaklaşımlarımız hücre tipi spesifik mitokondriyal kalsiyum görüntüleme in vitro ve in vivo için yararlıdır. Bu videoyu izledikten sonra, astrositlerde ve nöronlarda mitokondriyal kalsiyum alımını nasıl görüntüleyebilirsiniz.