Name: Msp1 Ayıklama Etkinliğinin Tamamen Saflaştırılmış Bileşenlerle Yeniden Uzlaştırılması (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-08-10T14:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 52 s
Description: Öğrenin, AAA-ATPaz Msp1'in tamamen saflaştırılmış bileşenlerle yeniden uzlaştırma protokolünü. Bu yöntem, protein kalite kontrolündeki ayıklama mekanizmalarını anlamak için tanımlı bir lipozom sistemi sunar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

MLW, chicago Üniversitesi'nde Dr. Robert Keenan ile yaptığı doktora sonrası çalışmalar sırasında bu protokolün bir parçasını geliştirdi.
Bu çalışma MLW'ye NIH hibe 1R35GM137904-01 tarafından finanse edilir.

Uygun mitokondriyal fonksiyon sağlam bir protein kalite kontrol sistemine bağlıdır. TA protein hedefleme yollarının doğruluğundaki doğal sınırlar nedeniyle, yanlış hesaplanan TA proteinleri mitokondri için sürekli bir stres kaynağıdır. Mitokondriyal proteostaz ağının önemli bir bileşeni, yanlış etiketlenmiş TA proteinlerini OMM'den uzaklaştıran bir membran bağlantılı AAA + ATPase olan Msp1'dir. Burada, proteolipozomların nasıl hazırlanacağını, Msp1 ve bir model TA proteinini nasıl yeniden inşa edeceğimizi ve bir ekstraks...

Doğru hücresel fonksiyon, fonksiyonel proteinlerin doğru konsantrasyonda ve hücresel konumda olmasını sağlayan proteostaz adı verilen bir işleme bağlıdır1. Proteostazdaki başarısızlıklar organel fonksiyonlarının tehlikeye atmasına yol açar ve birçok nörodejeneratifhastalıklailişkilidir 2,3,4. Membran proteinleri, hidrofobik transmembran etki alanlarından (TMD'ler) toplanmaktan kaçınırken doğru zara hedeflenmeleri gerektiğinden proteostaz ağına benzersiz zorluklar sunar5. Sonuç olarak, özel makine hidrofobik TMD'yi sitozodan korumak ve uygun hücresel membran 6 , 7 , 8,9, 10,11,12,13,14,15'ehedeflemeyi ve yerleştirmeyi kolaylaştırmak için evrimleşmiştir.
Mitokondri hücrenin metabolik merkezidir ve oksidatif fosforilasyon, demir-kükürt kümesi üretimi ve apoptotik düzenleme16,17gibi çok sayıda temel hücresel işlemde yer almaktadır. Bu endosimbiyotik organeller, iç mitokondriyal membran (İbb) ve dış mitokondriyal membran (OMM) olarak adlandırılan iki membran içerir. 1.500 insan mitokondriyal proteininin %99'undan fazlası nükleer genomda kodlanmıştır ve bir veya iki farklı zarda yer değiştirmeleri gerekir18,19. Bu nedenle uygun mitokondriyal fonksiyon, protein hedefleme veya translokasyondaki hataları düzeltmek için sağlam bir proteostaz ağına bağlıdır.
Laboratuvarımız, çok C-terminus 20,21,22,23,24'tetek bir transmembranetki alanına sahip kuyruk bağlantılı (TA) proteinleri adı verilen mitokondriyal membran proteinlerinin bir alt kümesine odaklanmaktadır. TA proteinleri, apoptoz, vezikül taşınması ve protein translokasyonu25gibi bir dizi temel işlemde yer almaktadır. TA proteinlerinin benzersiz topolojisi, endoplazmik retikulumda (ER) Kuyruk bağlantılı (GET) veya Endoplazmik retikül Membran protein Kompleksi (EMC) yollarının Rehberli Girişi ile veya kötü karakterize edilmiş bir yol olan 20 , 26 ,27,28ile OMM'ye giren çeviri sonrası ekleme gerektirir. TMD'nin biyofiziksel özellikleri, TA proteinlerini doğru zara yönlendirmek için gerekli ve yeterlidir29. Tanımlanmış bir dizi motifi yerine biyofiziksel özelliklerin tanınması, hedefleme yollarının doğruluğunu sınırlar5. Bu nedenle, TA proteinlerinin yanlış hesaplanması proteostaz ağları için yaygın bir strestir. GET yolunun inhibisyonu gibi hücresel stres, bu proteinler derhal çıkarılmadığı sürece OMM'ye protein yanlış sapkalizasyonunda ve mitokondriyal disfonksiyonda artışa neden olur30,31.
Membran proteostazında ortak bir tema, lipid bilayer 1 , 32, 33 , 34 , 35 ,36,37,38'den eski, hasarlı veya yanlış tanımlanmış proteinleri çıkarmak için AAA+ (hücresel A eğilimleri ile ssociated bir TPase A)proteinlerinin kullanılmasıdır. . AAA+ proteinleri, altıgen halkalar oluşturan ve genellikle dar bir eksenel gözenek yoluyla translokasyon yoluyla bir substratı yeniden şekillendirmek için ATP bağımlı hareketlerinden geçen moleküler motorlardır39,40. AAA+ ATPases tarafından membran proteinlerinin ekstraksiyonunu incelemeye büyük çaba sarf edilmiş olsa da, rekonstrüzyonlar karmaşıktır veya lipid bilayerden substrat ekstraksiyon mekanizmasını incelemek için deneysel gücü sınırlayan lipit ve deterjan41,42karışımını içerir.
Msp1, OMM'ye bağlı yüksek oranda korunmuş bir AAA+ ATPaz ve yanlış tanımlanmış TA proteinleri43 , 44 , 45,46,47'yiçıkararak membran proteostazında kritik rol oynayan peroksiomlardır. Msp1'in ayrıca yakın zamanda OMM48'detranslokasyon sırasında duran membran proteinlerini çıkararak mitokondriyal protein ithalat stresini hafifletdiği gösterilmiştir. Msp1 veya insan homolog ATAD1 kaybı mitokondriyal parçalanma, oksidatif fosforilasyonda başarısızlıklar, nöbetler, inme sonrasında yaralanma artışı ve erken ölüm31,49,50 , 51,52,53,54,55,56ile sonuçlanır.
TA proteinlerini Msp1 ile birlikte yeniden inşa etmenin ve lipid bilayer57'denekstraksiyonu tespit etmenin mümkün olduğunu gösterdik. Bu basitleştirilmiş sistem, OMM'yi taklit eden tanımlanmış lipozomlara yeniden inşa edilmiş tamamen saflaştırılmış proteinler kullanır (Şekil 1)58,59. Bu deneysel kontrol seviyesi, diğer AAA+ proteinlerini içeren daha karmaşık rekonstrüzyonlarla deneysel olarak zor olan substrat ekstraksiyonunun ayrıntılı mekanistik sorularını ele alabilir. Burada, lipozom hazırlama, membran proteini rekonsupsiyonu ve ekstraksiyon tahlil yöntemlerini ayrıntılı olarak açıklayan deneysel protokoller sunuyoruz. Bu deneysel detayların membran proteostazının temel ama iyi anlaşılmayan sürecinin daha fazla incelenmesini kolaylaştıracağını umuyoruz.

<table><tbody><tr><td>Biobeads</td><td>Bio-Rad</td><td>1523920</td><td></td></tr><tr><td>Sığır karaciğeri fosfatidil inositol</td><td>Avanti</td><td>840042C</td><td></td></tr><tr><td>PI Tavuk yumurtası fosfatidil kolin</td><td>Avanti</td><td>840051C</td><td>PC</td></tr><tr><td>Tavuk yumurtası fosfatidil etanolamin</td><td>Avanti</td><td>840021C</td><td>PE</td></tr><tr><td>ECL Select western lekeleme algılama reaktifi</td><td>GE</td><td>RPN2235</td><td></td></tr><tr><td>Filtre,</td><td>Avanti</td><td>610014</td><td></td></tr><tr><td>Cam şişeyi</td> destekler <td>VWR</td><td>60910L-1</td><td></td></tr><tr><td>Glutatyon spin sütunu</td><td>Thermo Fisher</td><td>PI16103</td><td></td></tr><tr><td>Keçi anti-tavşan</td><td>Thermo Fisher</td><td>NC1050917</td><td></td></tr><tr><td>Mini Ekstruder</td><td>Avanti</td><td>610020</td><td></td></tr><tr><td>Polikarbonat membran</td><td>Avanti</td><td>610006</td><td>200 nM</td></tr><tr><td>PVDF membran</td><td>Thermo Fisher</td><td>88518</td><td>45 & M</td></tr><tr><td>Tavşan anti-FLAG</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F7245</td><td></td></tr><tr><td>Sentetik 1,2-dioleoil-sn-glisero-3-fosfo-L-serin</td><td>Avanti</td><td>840035C</td><td>DOPS</td></tr><tr><td>Sentetik 1 ', 3'-bis [1,2-dioleoil-sn-glisero-3-fosfo] -gliserol</td><td>Avanti</td><td>710335C</td><td>TOCL</td></tr><tr><td>Şırınga, 1 mL</td><td>Norm-Ject</td><td>53548-001</td><td></td></tr><tr><td>Şırınga, 1 mL, gaz geçirmez</td><td>Avanti</td><td>610017</td><td></td></tr></tbody></table>

msp1 ayıklama etkinliğinin tamamen saflaştırılmış bileşenlerle yeniden uzlaştırılması

Reconstitution of Msp1 Extraction Activity with Fully Purified Components

Oksidatif fosforilasyon ve apoptotik regülasyon merkezi olarak mitokondri insan sağlığında hayati bir rol oynar. Uygun mitokondriyal fonksiyon, protein homeostazının (proteostaz) korunması için sağlam bir kalite kontrol sistemine bağlıdır. Mitokondriyal proteostazdaki düşüşler kanser, yaşlanma, nörodejenerasyon ve diğer birçok hastalıkla bağlantılıdır. Msp1, yanlış hesaplanmış kuyruk bağlantılı proteinleri çıkararak proteostaz koruyan dış mitokondriyal membrana tutturulmuş bir AAA+ ATPazdır. Proteolipozomlara yeniden inşa edilen saflaştırılmış bileşenleri kullanarak, Msp1'in bir lipid bilayerden model kuyruk bağlantılı bir protein çıkarmak için gerekli ve yeterli olduğunu gösterdik. Basitleştirilmiş yeniden inşa edilmiş sistemimiz, membran protein ekstraksiyonunun ayrıntılı çalışmasını engelleyen teknik engellerin birkaçını aşıyor. Burada lipozomların üretimi, membran proteini rekonsupsiyonu ve MSP1 ekstraksiyon tahlilleri için detaylı yöntemler sunuyoruz.

Sonuçları düzgün bir şekilde yorumlamak için lekesiz jel ve batı lekesi birlikte görülmelidir. Lekesiz jel, tüm numunelerde eşit yükleme sağlar. Lekesiz jeli görüntülerken, refakatçiler (GST-calmodulin ve GST-SGTA) INPUT (I) ve ELUTE (E) şeritlerinde görülebilir. Bu bantların yoğunluğunun tüm INPUT örneklerinde tekdüze olup olmadığını iki kez kontrol edin. Aynı şekilde, yoğunluğun ELUTE numuneleri boyunca düzgün olduğundan emin olun. ELUTE, Gİrİş'ten 5 kat daha konsantredir ve bu yoğunluk farkı jellerde görülebilir.
...

Burada, tanımlanmış proteolipozomlarda tamamen saflaştırılmış bileşenlerle Msp1 ekstraksiyon aktivitesinin yeniden uzlaştırılması için ayrıntılı bir protokol sunuyoruz.

Msp1 Ayıklama Etkinliğinin Tamamen Saflaştırılmış Bileşenlerle Yeniden Uzlaştırılması

As the center for oxidative phosphorylation and apoptotic regulation, mitochondria play a vital role in human health. Proper mitochondrial function ...

AAA-ATPases'in proteinleri lipid bilayerden çıkarmak için kullanılması protein kalite kontrolünde yaygın bir temadır. Bu temel sürecin mekanistik bir anlayışı, yeniden inşa edilmiş bir sistem gerektirir. AAA-ATPases ile önceki rekonstruş karmaşık ve heterojendi.Sistemimiz basit ve tam olarak tanımlanmıştır. Bu, AAA-ATPase Msp1, substrat ve lipid ortamını manipüle etmemizi sağlar. Başlamak için, daha önce hazırlanmış yeniden yapılanma tamponu, saflaştırılmış Msp1 ve TA proteinlerini ve lipozomlarını bir PCR tüpüne ekleyin, ardından karışımı 10 dakika boyunca buz üzerinde kuluçkaya bırakın.Kuluçka sırasında, bir P200 pipet ucunun ucunu bir inçin yaklaşık 1/8 çapındaki kısmına kesin. Daha sonra, düzgün bir karışım elde etmek için BioBeads içeren tüpü iyice girdaplayın. Ardından, kapağı hızlı bir şekilde çıkarın ve boncukların uygun bir hacmini boş bir PCR tüpüne aktarmak için kesilmiş P200 pipet ucunu kullanın.Yeniden yapılanma için 10 dakikalık inkübasyon tamamlandıktan sonra, kesilmemiş bir pipet ucu kullanarak, biobeads'tan tüm sıvıyı çıkarın. Daha sonra, 100 mikrolitre rekonsiyel biobeads ile tüpe aktarın ve 16 saat boyunca bir tekerlek üzerinde dönmesine izin verin. Ertesi gün, boncukları peletmek için tüpü bir PicoFuge'da döndürün, ardından yeniden inşa edilen malzemeyi temiz bir PCR tüpüne aktarın ve tüpü buzda tutun.Lipozomlara yeniden inşa edemeyen proteinleri çıkarmak için, glutatyon spin sütunlarını ekstraksiyon tamponu ile dengeleyin, bu da tipik olarak 400 mikrolitre tamponla üç tur yıkamayı ve ardından tamponu çıkarmak için santrifüjlenmeyi içerir. Daha sonra, yeniden inşa edilen malzemeye her bir refakatçiden beş mikromol ekleyin, ardından 100 mikrolitre ekstraksiyon tamponu, hacmi 200 mikrolitreye kadar getirin. Bu karışımı dengelenmiş glutatyon spin sütunlarına ekleyin, ardından spin sütunlarını takın ve 30 dakika döndürerek refakatçilerin reçineye bağlanmasını bekleyin.Döndükten sonra sütunları kısa bir süre döndürün. Agrega proteinlerinin önceden temizlenmiş malzemesi olan akış toplayın. Buzun üzerine yerleştirin ve doğrudan çıkarma testine geçin.Tüpleri SDS-PAGE analizi için hazırlayın. Giriş tüpüne 45 mikrolitre çift damıtılmış su, akış tüpüne 40 mikrolitre su ve her tüpe 16,6 mikrolitre 4X SDS-PAGE yükleme tamponu ekleyin. Ekstraksiyon tahlil için ekstraksiyon reaksiyonu hazırlayın ve ekstraksiyon tamponu ile son hacmi 200 mikrolitreye getirin.Daha sonra, ekstraksiyon tahlilini 30 santigrat derecelik bir ısı bloğunda iki dakika boyunca ön ısıtma yapın. Tahlil başlatmak için, atp'yi iki milimol son konsantrasyona ekleyin. Tüpü bir PicoFuge'da beş saniye döndürün ve 30 dakika boyunca 30 santigrat derecede kuluçkaya yatırın.Kuluçka sırasında, reaksiyonun beş mikroliter örneğini alın ve giriş tüpüne ekleyin. Ayrıca, ekstraksiyon testinde her örnek için daha önce gösterildiği gibi bir glutatyon spin sütunu aşındırın. 30 dakikalık inkübasyon tamamlandıktan sonra, tüpe 200 mikrolitre ekstraksiyon tamponu ekleyin ve toplam hacmi 400 mikrolitreye getirin.Daha sonra, bu reaksiyonun dengelenmiş glutatyon reçinesine ekleyin ve dört santigrat derecede 30 dakika dönmesine izin verin. Döndükten sonra, akış akışını toplamak için sütunları döndürün, ardından akış tüpü için 10 mikroliterlik bir örnek alın. Reçineyi 400 mikrolitre ekstraksiyon tamponu ile iki kez yıkayın, her yıkamadan sonra akıştan atın.Üçüncü yıkamadan sonra, akışı tutun ve yıkama tüpü için 50 mikroliter numune alın. Daha sonra, ekstraksiyon tamponunda beş milimollük son konsantrasyona azaltılmış glutatyon ekleyerek beş mililitrelik elüasyon tamponu hazırlayın. Spin sütununa 200 mikrolitre elution tamponu ekleyin ve beş dakika kuluçkaya yatırın.Ardından, sütunu santrifüj edin ve akışı toplayın. İfade adımını bir kez daha tekrarlayın. İkinci elutiondan sonra, elution örneğinden 50 mikroliter aliquot alın ve elute tüpüne ekleyin.Batı lekesi çalıştırılmasından sonra, ekstraksiyon verimliliği, elute fraksiyonundaki substrat miktarı ile giriş fraksiyonu karşılaştırılarak belirlenebilir. Akıştaki sinyal bazı değişkenlik gösterir, ancak genellikle giriş fraksiyonu ile benzer ve yıkama fraksiyonunda sinyal yoktur. Tipik olarak, pozitif kontrol için yaklaşık% 10 ekstraksiyon verimliliği ve negatif kontrol için% 1 ila% 2 ekstraksiyon verimliliği vardır.Yeniden yapılanma koşulları optimize edilmemişse, ekstraksiyon seviyeleri pozitif ve negatif numuneler arasında karşılaştırılabilir. Bu teknik, laboratuvarımızın alt tabakanın biyofiziksel özelliklerinin Msp1 tarafından tanınmasını etkilemesini test etmesine izin sağladı.

reconstitution-msp1-extraction-activity-with-fully-purified

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Biyokimya

Burada, son derece aktif Hsp104 hexameric AAA + protein mayası, protein ayrıştırılmasıyla çiftler ATP hidrolizi arıtma için bir protokol açıklar. Bu düzeni yakınlık arıtma için His6 etiketli inşa...

Hsp104 saflaştırılması, Protein Disaggregase

Nanodiscs fosfolipid çift tabakası küçük bir yama içine membran proteinleri dahil küçük diskoid parçacıklardır. Biz bir disk içine MalFGK2 taşıyıcı adım adım kuruluş gösteren görsel bir protokol sağlar.

Nanodisc Lipid Parçacıklar içine bir ABC Transporter Sulandırma için bir adım-adım yöntemi

Bu video, lipozomların lipid çift tabakasına entegre edilmiş yanlış lokalize TA proteinlerinin Msp1 aracılı uzaklaştırılmasını incelemek için bir in vitro protokolü göstermektedir. Msp1 ve TA proteinleri lipozomlara birlikte sulandırılır ve TA proteinlerinin ATP'ye bağlı translokasyonu, afinite saflaştırması yoluyla doğrulanır.

Yanlış lokalize TA proteinlerinin uzaklaştırılmasını incelemek için Msp1 ekstraksiyon testi

Maya mitokondriyal nükleoit proteini Mgm101, büyük oligomerik halkalar oluşturan bir Rad52 tipi rekombinasyon proteindir. Bir protokol, maltoz bağlanma proteini (MBP)-etiketleme katyon değişimi ve boyut dışlama kromatografisi ile birlikte stratejisi kullanılarak çözülebilir rekombinant Mgm101 hazırlamak için tarif edilmektedir.

MBP tabanlı Etiketleme Stratejisi Mgm101 Rekombinasyon Protein hazırlanması

Bir yöntem olup (Strep-taktin) reçinesi kovalent Bis (sülfosuksinimidil) suberat (BS3) ile çapraz bağlanmış, modifiye edilmiş streptavidin ile ilgili çift-Strep-etiketli füzyon proteinleri ve bunların özel komplekslerinin etkin arıtma için açıklanmıştır. Bir yöntem hızlı hızlı, iyi bir hedef protein geri kazanımı ve yüksek saflıkta avantajları vardır ve kütle spektrometresi ile bir sonraki analiz ile uyumludur.

Tek aşamalı Strep-taktin Reçine Bis (sülfosuksinimidil) ile çapraz bağlanmış suberat (BS3) hakkında Çift Strep-etiketli proteinler ve komplekslerinin saflaştırılması

Birçok protein, zar yüzeylerine bağlandığında işlevlerini yerine getirir. Ekstrinsik proteinlerin nanodisk membranları üzerindeki bağlanması, transmisyon elektron mikroskobu ile dolaylı olarak görüntülenebilir. Negatif leke sodyum fosfotungstat tarafından indüklenen nanodisklerin karakteristik istiflenmesinin (rouleau), ekstrinsik proteinin bağlanmasıyla önlendiğini gösteriyoruz.

Yöntem gözünüzde canlandırın ve Transmisyon Elektron Mikroskobu Membran Etkileşen Proteinler Analiz için

Biz bir protokol vitro için zihin ve benim kendi kendine organizasyon deneyleri desteklenen lipid bilayer açık bir odasında üzerinde sağlar. Ayrıca, biz tepki doğumdan tarafından vivo koşulları taklit için PDMS microcompartments lipid kaplı tahlil içine alın anlatan.

Vitro Sulandırma Protein kalıpları üzerinde desteklenen Lipid Bilayers kendi kendini düzenleme

Önceden oluşturulmuş nanodisklere birlikte translasyonel yerleştirme, tanımlanmış lipit ortamlarında deterjanlarla temas etmeden hücresiz sentezlenmiş membran proteinlerinin incelenmesini mümkün kılar. Bu protokol, temel sistem bileşenlerinin hazırlanmasını ve ifade verimliliğini ve numune kalitesini artırmak için kritik parametreleri açıklar.

Membran Proteinlerinin Önceden Oluşturulmuş Nanodisklere Ko-Translasyonel Olarak Yerleştirilmesi

Bu protokol, Mycobacterium smegmatis'in (Msm) aksenik kültürlerinden doğal mikobakteriyel hücre dışı veziküllerin (mEV'ler) zenginleştirilmesini ve mCherry (kırmızı floresan raportör) içeren rekombinant MsmEV'lerin nasıl tasarlanabileceğini ve zenginleştirilebileceğini detaylandırır. Son olarak, Mycobacterium tuberculosis'in EsxA proteinini içeren MsmEV'lerin zenginleştirilmesiyle yeni yaklaşımı doğrulamaktadır.

Mikobakterilerin Doğal ve Rekombinant Hücre Dışı Veziküllerinin Zenginleştirilmesi

Bu makale, bir C41 (DE3) ekspresyon sisteminde toksik bir nükleaz olan rekombinant Nsp15'in aşırı eksprese edilmesi için bir metodolojiyi ve ardından afinite ve boyut dışlama kromatografisi kullanılarak etiketli proteinin saflaştırılmasını açıklamaktadır. Bu protokoller diğer zorlu toksik proteinler için uyarlanabilir.

Escherichia coli'den Toksik Bir Nükleazın Aşırı İfade Edilmesi ve Saflaştırılması

Bu çalışma, membran proteini TWIK ile ilişkili asite duyarlı K+ kanal 2'nin (Görev 2) nanodisklere yeniden yapılandırılması prosedürünü özetlemektedir. Başarılı montaj, iyi tanımlanmış iki boyutlu sınıf ortalamaları elde eden tek parçacıklı kriyoelektron mikroskopi ile doğrulandı.

Nanodisklerde Membran Proteinlerini Stabilize Etme Tekniği

Öğrenin, AAA-ATPaz Msp1'in tamamen saflaştırılmış bileşenlerle yeniden uzlaştırma protokolünü. Bu yöntem, protein kalite kontrolündeki ayıklama mekanizmalarını anlamak için tanımlı bir lipozom sistemi sunar.

Msp1 Ayıklama Etkinliğinin Tamamen Saflaştırılmış Bileşenlerle Yeniden Uzlaştırılması

Daha fazla video keşfet