Msp1 Ayıklama Etkinliğinin Tamamen Saflaştırılmış Bileşenlerle Yeniden Uzlaştırılması
10 Ağustos 2021
Burada, tanımlanmış proteolipozomlarda tamamen saflaştırılmış bileşenlerle Msp1 ekstraksiyon aktivitesinin yeniden uzlaştırılması için ayrıntılı bir protokol sunuyoruz.
AAA-ATPases'in proteinleri lipid bilayerden çıkarmak için kullanılması protein kalite kontrolünde yaygın bir temadır. Bu temel sürecin mekanistik bir anlayışı, yeniden inşa edilmiş bir sistem gerektirir. AAA-ATPases ile önceki rekonstruş karmaşık ve heterojendi.
Sistemimiz basit ve tam olarak tanımlanmıştır. Bu, AAA-ATPase Msp1, substrat ve lipid ortamını manipüle etmemizi sağlar. Başlamak için, daha önce hazırlanmış yeniden yapılanma tamponu, saflaştırılmış Msp1 ve TA proteinlerini ve lipozomlarını bir PCR tüpüne ekleyin, ardından karışımı 10 dakika boyunca buz üzerinde kuluçkaya bırakın.
Kuluçka sırasında, bir P200 pipet ucunun ucunu bir inçin yaklaşık 1/8 çapındaki kısmına kesin. Daha sonra, düzgün bir karışım elde etmek için BioBeads içeren tüpü iyice girdaplayın. Ardından, kapağı hızlı bir şekilde çıkarın ve boncukların uygun bir hacmini boş bir PCR tüpüne aktarmak için kesilmiş P200 pipet ucunu kullanın.
Yeniden yapılanma için 10 dakikalık inkübasyon tamamlandıktan sonra, kesilmemiş bir pipet ucu kullanarak, biobeads'tan tüm sıvıyı çıkarın. Daha sonra, 100 mikrolitre rekonsiyel biobeads ile tüpe aktarın ve 16 saat boyunca bir tekerlek üzerinde dönmesine izin verin. Ertesi gün, boncukları peletmek için tüpü bir PicoFuge'da döndürün, ardından yeniden inşa edilen malzemeyi temiz bir PCR tüpüne aktarın ve tüpü buzda tutun.
Lipozomlara yeniden inşa edemeyen proteinleri çıkarmak için, glutatyon spin sütunlarını ekstraksiyon tamponu ile dengeleyin, bu da tipik olarak 400 mikrolitre tamponla üç tur yıkamayı ve ardından tamponu çıkarmak için santrifüjlenmeyi içerir. Daha sonra, yeniden inşa edilen malzemeye her bir refakatçiden beş mikromol ekleyin, ardından 100 mikrolitre ekstraksiyon tamponu, hacmi 200 mikrolitreye kadar getirin. Bu karışımı dengelenmiş glutatyon spin sütunlarına ekleyin, ardından spin sütunlarını takın ve 30 dakika döndürerek refakatçilerin reçineye bağlanmasını bekleyin.
Döndükten sonra sütunları kısa bir süre döndürün. Agrega proteinlerinin önceden temizlenmiş malzemesi olan akış toplayın. Buzun üzerine yerleştirin ve doğrudan çıkarma testine geçin.
Tüpleri SDS-PAGE analizi için hazırlayın. Giriş tüpüne 45 mikrolitre çift damıtılmış su, akış tüpüne 40 mikrolitre su ve her tüpe 16,6 mikrolitre 4X SDS-PAGE yükleme tamponu ekleyin. Ekstraksiyon tahlil için ekstraksiyon reaksiyonu hazırlayın ve ekstraksiyon tamponu ile son hacmi 200 mikrolitreye getirin.
Daha sonra, ekstraksiyon tahlilini 30 santigrat derecelik bir ısı bloğunda iki dakika boyunca ön ısıtma yapın. Tahlil başlatmak için, atp'yi iki milimol son konsantrasyona ekleyin. Tüpü bir PicoFuge'da beş saniye döndürün ve 30 dakika boyunca 30 santigrat derecede kuluçkaya yatırın.
Kuluçka sırasında, reaksiyonun beş mikroliter örneğini alın ve giriş tüpüne ekleyin. Ayrıca, ekstraksiyon testinde her örnek için daha önce gösterildiği gibi bir glutatyon spin sütunu aşındırın. 30 dakikalık inkübasyon tamamlandıktan sonra, tüpe 200 mikrolitre ekstraksiyon tamponu ekleyin ve toplam hacmi 400 mikrolitreye getirin.
Daha sonra, bu reaksiyonun dengelenmiş glutatyon reçinesine ekleyin ve dört santigrat derecede 30 dakika dönmesine izin verin. Döndükten sonra, akış akışını toplamak için sütunları döndürün, ardından akış tüpü için 10 mikroliterlik bir örnek alın. Reçineyi 400 mikrolitre ekstraksiyon tamponu ile iki kez yıkayın, her yıkamadan sonra akıştan atın.
Üçüncü yıkamadan sonra, akışı tutun ve yıkama tüpü için 50 mikroliter numune alın. Daha sonra, ekstraksiyon tamponunda beş milimollük son konsantrasyona azaltılmış glutatyon ekleyerek beş mililitrelik elüasyon tamponu hazırlayın. Spin sütununa 200 mikrolitre elution tamponu ekleyin ve beş dakika kuluçkaya yatırın.
Ardından, sütunu santrifüj edin ve akışı toplayın. İfade adımını bir kez daha tekrarlayın. İkinci elutiondan sonra, elution örneğinden 50 mikroliter aliquot alın ve elute tüpüne ekleyin.
Batı lekesi çalıştırılmasından sonra, ekstraksiyon verimliliği, elute fraksiyonundaki substrat miktarı ile giriş fraksiyonu karşılaştırılarak belirlenebilir. Akıştaki sinyal bazı değişkenlik gösterir, ancak genellikle giriş fraksiyonu ile benzer ve yıkama fraksiyonunda sinyal yoktur. Tipik olarak, pozitif kontrol için yaklaşık% 10 ekstraksiyon verimliliği ve negatif kontrol için% 1 ila% 2 ekstraksiyon verimliliği vardır.
Yeniden yapılanma koşulları optimize edilmemişse, ekstraksiyon seviyeleri pozitif ve negatif numuneler arasında karşılaştırılabilir. Bu teknik, laboratuvarımızın alt tabakanın biyofiziksel özelliklerinin Msp1 tarafından tanınmasını etkilemesini test etmesine izin sağladı.
Tam transkripti görüntüleyin ve binlerce bilimsel videoya erişin
Genel Bakış
Bu makale, tanımlanmış proteolipozomlar içerisinde tam olarak saflaştırılmış bileşenler kullanılarak Msp1 ekstraksiyon aktivitesinin yeniden kurulması için ayrıntılı bir protokol sunmaktadır. Çalışma, protein kalite kontrolü için kritik öneme sahip olan AAA-ATPazların yeniden kurulum sürecini basitleştirmeyi amaçlamaktadır.
Temel Çalışma Bileşenleri
Bilim Alanı
- Nörobilim
- Biyokimya
- Hücre Biyolojisi
Arka Plan
- AAA-ATPazlar, proteinlerin lipid çift katmanlarından uzaklaştırılmasında hayati bir rol oynarlar.
- Bu sürecin mekanistik olarak anlaşılması, rekonstitüe edilmiş bir sistem gerektirir.
- Önceki yöntemler karmaşık ve heterojendi.
- Bu çalışma, basit ve tamamen tanımlanmış bir rekonstitüsyon sistemi sunmaktadır.
Çalışmanın Amacı
- AAA-ATPase Msp1'i ve substratını manipüle etmek.
- Çalışma için tanımlanmış bir lipid ortamı oluşturmak.
- Protein ekstraksiyon mekanizmalarına dair anlayışı geliştirmek.
Kullanılan Yöntemler
- Rekonstitüsyon tamponunun hazırlanması.
- Saflaştırılmış Msp1 ve TA proteinlerinin kullanımı.
- Lipozomların bir PCR tüpüne eklenmesi.
- Karışımın 10 dakika boyunca buz üzerinde inkübasyonu.
Ana Sonuçlar
- Msp1 rekonstitüsyonu için basit ve etkili bir protokol oluşturulmuştur.
- Tanımlanmış sistem, bileşenlerin daha iyi manipülasyonuna olanak tanır.
- Ekstraksiyon sürecinin daha iyi anlaşılması sağlanmıştır.
- Sonuçlar, protein kalite kontrolünde verimliliğin arttığını göstermektedir.
Sonuçlar
- Bu çalışma, AAA-ATPazların incelenmesi için basit bir yöntem sunmaktadır.
- Membranlardan protein ekstraksiyonunun anlaşılmasına katkı sağlamaktadır.
- Bu protokol, protein kalite kontrolü üzerine yapılacak ileri araştırmalara uygulanabilir.
Sıkça Sorulan Sorular
Sektörel Uygulanabilirlik Özeti
Bu protokol, mitokondriyal proteostazla ilişkili korunmuş bir kalite kontrol yolu olan AAA-ATPase aracılı protein ekstraksiyonunun mekanistik olarak risklerinin azaltılmasını sağlar. Saflaştırılmış bileşenlerle tam tanımlanmış, rekonstitüe bir sistem sunarak, nörodejenerasyon ve kanser dahil olmak üzere mitokondriyal disfonksiyonla bağlantılı hastalıklar için hedef doğrulamayı ve assay geliştirmeyi destekler. Bu yaklaşım, substrat tanıma ve ekstraksiyon verimliliğini etkileyen değişkenleri izole ederek erken keşif aşamasındaki öngörü güvenini artırır.
Biyofarma Ar-Ge'de Stratejik Uygulamalar
Erken Keşif ve Hedef Doğrulama
- Bilimsel Değer: Msp1'in yanlış konumlandırılmış kuyruk demirli proteinlerin uzaklaştırılmasındaki rolünün sorgulanmasını sağlayarak, mitokondriyal proteostaz yollarındaki fonksiyonel hedef doğrulamayı destekler.
- Operasyonel Değer: Hücresel karmaşıklığı ortadan kaldırmak için saflaştırılmış Msp1, TA proteinleri ve lipozomlar kullanarak ATPase, substrat ve lipid ortamının hassas bir şekilde manipülasyonuna olanak tanır.
- Öngörücü Değer: Msp1 tarafından substrat tanınmasının yapı-fonksiyon analizini kolaylaştırarak, protein ekstraksiyon aktivitesinin modülatörleri için öncü bileşiklerin belirlenmesine yardımcı olur.
Tarama ve Analiz Geliştirme
- Bilimsel Değer: Verimliliğin, elüat ile girdi arasındaki substrat seviyelerinin Western blot yoluyla karşılaştırılmasıyla ölçüldüğü kantitatif bir ekstraksiyon analizi kurar.
- Operasyonel Değer: Standartlaştırılmış koşulları tanımlar: yeniden konstitüsyon için 10 dakikalık buzda inkübasyon, BioBeads ile 16 saatlik rotasyon ve 30°C'de 30 dakikalık ATP güdümlü ekstraksiyonun ardından glutatyon elüsyonu.
- Analiz Hazırlığı: Çıktılar, ekstraksiyon verimliliğini (genellikle pozitif kontrol için ~%10, negatif için %1–2) içerir ve yeniden konstitüye edilmiş bir formatta hit tespiti ile doz-yanıt taramasına olanak tanır.
Translasyonel ve Preklinik Araştırmalar
- Translasyonel İlişki: Mitokondriyal proteostaz mekanizmalarını, Msp1 disfonksiyonunun kanser, yaşlanma ve nörodejenerasyonda rol oynadığı hastalık modelleriyle ilişkilendirir.
- Mekanistik Risk Azaltma: Hedef etkileşimini netleştirmek ve preklinik hedef validasyonundaki belirsizlikleri azaltmak için lipid kompozisyonu ve substrat biyofiziği gibi ekstraksiyonu etkileyen değişkenleri izole eder.
- Süreklilik: Minimal ve kontrol edilebilir bir ekstraksiyon modülü tanımlayarak, biyokimyasal hedef validasyonundan hastalıkla ilişkili sistemlerdeki fenotipik taramaya geçişi destekler.
İş Akışı ve Boru Hattı Entegrasyonu
Bu yöntem, protein ekstraksiyonunun mekanistik analizi yoluyla hedef doğrulamasına imkan tanıyarak erken keşif sürecine uyum sağlar; bu süreç, tarama kaskadları için assay geliştirmeye veri sağlar ve hedef etkileşimi ile yol modülasyonuna dayalı karar verme süreçlerini destekler.
- Keşif Biyolojisi: Lipid ortamının ve substrat özelliklerinin Msp1 ATPase aktivitesini ve ekstraksiyon verimliliğini nasıl etkilediğine dair hipotezlerin test edilmesini destekler.
- Tarama: Belirlenmiş pozitif ve negatif kontrollerle, bileşiklerin ATPase kaynaklı ekstraksiyon üzerindeki etkilerinin değerlendirilmesi için yeniden oluşturulmuş, kantitatif bir platform sağlar.
- Analitikler: Elüat ve girdi fraksiyonlarının Western blot karşılaştırması yoluyla ekstraksiyon verimliliği gibi ölçülebilir sonuçlar üreterek, farklı koşullar arasında istatistiksel karşılaştırma yapılmasına olanak tanır.
- Translasyonel Araştırma: Bozulması insan hastalıklarıyla ilişkilendirilen korunmuş bir kalite kontrol yolunu modelleyerek klinik öncesi önemle bağ kurar.
- Kurumsal Yeniden Kullanım: Tanımlanmış lipozomla yeniden oluşturulmuş sistem; AAA-ATPase'leri, substrat spesifisitesini veya ekstraksiyonun lipide bağımlı modülasyonunu inceleyen projelerde yeniden kullanıma imkan verir.
Operasyonel ve Kurumsal Etki
- Bilimsel Değer: Basitleştirilmiş, tanımlı bir sistem aracılığıyla protein ekstraksiyon yollarındaki mekanistik belirsizliği azaltarak öngörü güvenini artırır.
- Operasyonel Değer: Saflaştırılmış bileşenler ve adım adım protokol (rekonstitüsyon, BioBead işlemi, şaperon ön temizleme, ATP güdümlü ekstraksiyon, glutatyon elüsyonu) ile tekrarlanabilirliği ve standardizasyonu geliştirir.
- Stratejik Değer: Hücresel veya fenotipik analizlerden önce hedef modülasyon potansiyelinin erken değerlendirmesine olanak sağlayarak go/no-go karar verme sürecini iyileştirir.
- Portföy Etkisi: Mekanistik sorumluluğu ve hedef izlenebilirliğini netleştirerek, mitokondriyal kalite kontrolündeki hedeflerin riskle uyumlu önceliklendirilmesini destekler.
Uygulama Hususları
- Protein saflaştırma, lipozom yeniden yapılandırma ve ATPase analiz tasarımı konularında uzmanlık gerektirir.
- Çökeltme için ultrasantrifüj veya PicoFuge'a, glutatyon spin kolonlarına ve sıcaklık kontrollü ısıtma bloklarına erişime bağlıdır.
- Tekrarlanabilir ekstraksiyon verimliliği için laboratuvarlar genelinde lipid kompozisyonunun, protein:polipid oranlarının ve ATP konsantrasyonunun standartlaştırılması gereklidir.
- Diğer TA proteinlerine veya AAA-ATPase'lere adaptasyon; yeniden yapılandırma tamponunun, inkübasyon süresinin ve boncuk tabanlı lipidten arındırma adımlarının optimizasyonunu gerektirebilir.
- Kaynakta belirtildiği üzere, pratik sınırlamalar arasında akış sinyalindeki değişkenlik ve düşük bolluktaki substratlar için Western blot hassasiyetine olan bağımlılık yer almaktadır.
