Name: In Situ Mesonephros Gelişimi Sırasında Zebra Balığı Larvaları ve Yavrularında Melezleme (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-08-13T14:45:00.000+00:00
Duration: 8 min 16 s
Description: Öğrenin, Danio rerio larvalarında mezonefros gelişimi sırasında gen ekspresyonunu in situ hibridizasyon ile tespit etmeyi. Bu optimize protokol, böbrek gelişimini in vivo çalışmak için değerli bir yöntem sunar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Pensilvanya Bilim Akademisi ve Pennsylvania Biyologlar Topluluğu ve Indiana University of Pennsylvania (Lisansüstü Çalışmalar ve Araştırma Okulu, Biyoloji Bölümü ve Cynthia Sushak Lisans BiyolojiSi Mükemmellik Fonu) tarafından finanse edildi. Tg(lhx1a-EGFP) transgenik hattı Dr. Neil Hukriede (Pittsburgh Üniversitesi) tarafından sağlanmıştır.

Zebra balığı larvalarının ve yavrularının kullanımı IUP IACUC (protokol #02-1920, #08-1920) tarafından onaylanmıştır. Çözüm içeriğinin ayrıntıları Malzeme Tablosunda listelenmiştir.
1. Larvaların yükseltilmesi
NOT: Larvaları ve gençleri ilgi alanına yükseltmek 21 gün veya daha fazla sürecektir.
<ol><li>Son yemeklerinden sonra öğleden sonra bir çiftleşme tankına 1 erkek ve 1 dişi balık ekleyerek çiftleşmek için yetişkin zebra balığı kurun. NOT: Tüm balık çiftleri çiftleşmez. Çiftleşme oranını belirlemek için 20 çift ayarlayarak başlayın ve gelecekteki denemelerde buna göre ayarlayın.</li>
	<li>Ertesi gün balık çiftleşmeyi bitirdikten sonra (yaklaşık 1 pm), embriyoları Petri plakalarında E3 orta ile toplayın.<ol>
<li>Plaka başına en fazla 30 embriyo olduğundan emin olun.</li>
		<li>Petri plakalarından kalıntıları (dışkı gibi) çıkarın ve 20 mL E3 ortamı ekleyin.</li>
		<li>1 gün boyunca 28,5 °C'de kuluçkaya yatır.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Yetişkin zebra balığını su sistemine geri koyun.</li>
	<li>1 dpf'de, E3 ortamını taze E3 ile değiştirin.<ol>
<li>5 dpf'ye kadar 4 gün daha 28,5 °C'de kuluçkaya yatır.</li>
	</ol>
</li>
	<li>2,8 L'lik bir tanka 400 μm ekran koyun ve 2 cm sistem suyu ile doldurun.<ol>
<li>1 plakadan 5 dpf larva ekleyin (toplam larva sayısı 30'a kadar).</li>
		<li>Tankı su sistemine koyun, ancak su akışını başlatmayın.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Larvaları günde iki kez 14 dpf'ye kadar 4 mL toz gıda ile besleyin.</li>
	<li>6 dpf'de, su akışını saniyede 1 damlada başlatın. NOT: Günlük su akışını kontrol edin ve buna göre ayarlayın.</li>
	<li>8 dpf'de, su akışını yavaş ve sabit bir akışa yükseltin.</li>
	<li>14 dpf'de, toz yiyeceklere ek olarak canlı salamura karides besleyin.</li>
</ol>2. Gün 1 - 2: Larvaların sabitlenerek
<ol><li>İstenilen zaman noktasında bir larva tankını çıkarın.</li>
	<li>Bir Petri plakasını 20 mL sistem suyu ile doldurun.</li>
	<li>Larvaları hafifçe kepçelamak ve su yüzeyine getirmek için ince bir ağ kullanın.<ol>
<li>Daha geniş bir açıklık sağlamak ve larvaları Petri plakasına aktarmak için bir transfer pipetinin ucunu kesin. Daha büyük pipet ağzı, aynı anda birkaç küçük larva veya birkaç büyük larvanın aktarılmasına izin verir.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Larvaları hareketsiz hale getirmek için 2 mL trikain (%2, pH 7 stok) ekleyin.<ol>
<li>Larvalar hareket etmeyi bıraktıktan sonra, suyun çoğunu çıkarın ve 10 mL trikain ekleyin. Larvaların ötenazi için 15 dakika bekleyin.</li>
		<li>İsteğe bağlı: 8 mm'den uzun gençler için, sabitleme çözeltisinin penetrasyonunu iyileştirmek için bir kesme mikroskobu altında kafaları ve kuyrukları bir jiletle (ötanaziden sonra) kesin. Başı ve kuyruğu kesmeden önce her hayvanın toplam uzunluğunu kaydettiğinizden ve her birini kendi Petri plakasında izole ettiğinizden emin olun. Hayvanların nasıl ölçülecekleri için 3.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Trikaini 20 mL sabitleme çözeltisi (%4 paraformaldehit, %1 DMSO) ile değiştirin. Kapağı petri plakasına geri koyun ve duman kaputunda yavaşça sallayın. NOT: Sallanan bir platform kullanmak önemlidir. Dairesel hareketle sallanan bir platform, hayvan ekseninin kavisli olmasına neden olacaktır. Sadece taze (önceden yapılmamış dondurulmuş değil) sabitleme sosu kullanın. DİkKAT: Sabitleme çözeltisi, muhtemel bir kanserojen olan paraformaldehit içerir. Tozu ölçmek için duman davlumbaz (veya maske) ve eldiven kullanın.</li>
	<li>30 dakika sonra, sabitleme çözümünü yeni bir sabitleme çözümü ile değiştirin.<ol>
<li>Kullanılmış sabitleme sokicisini uygun bertaraf için ayrı bir atık konteynerinde toplayın.</li>
		<li>Larvaları 25 mL taze sabitleme çözeltisi içeren 50 mL'lik bir tüpe aktarın.</li>
		<li>Kapağın sıkı olduğundan ve 2 gün boyunca 4 °C'de yavaşça sallanarak olduğundan emin olun. Kolaylık sağlamak için daha uzun süre kuluçkaya yatmak mümkündür.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. Gün 3: Larvaların ölçülmesi
<ol><li>Duman kaputunda, sabitleme solüsyonunu 20 mL PBST ile değiştirin.</li>
	<li>Larvaları bir Petri plakasına aktarın.</li>
	<li>Bir diseksiyon mikroskobuna düz bir cetvel koyun ve Petri plakasını cetvelin üzerine koyun.</li>
	<li>Toplam uzunluğunu ölçmek için her larvayı cetvele taşımak için bir kirpik manipülatörü kullanın (snout'tan kaudal yüzgecin ucuna kadar) (Şekil 1).</li>
	<li>Benzer uzunluklarda (örneğin, 5,0 mm ve 5,1 mm) çeşitli larvaları, şişe başına 10 larvaya kadar bir 5,5 mL cam şişede birleştirin.</li>
</ol>4. Gün 3 - 4: Dehidrasyon
<ol><li>PBST'i %100 metanolden oluşan 4 mL ile değiştirin. Şişeyi oda sıcaklığında 5 dakika sallayın.</li>
	<li>Metanol'i 5 dakika boyunca taze metanol ve kaya ile değiştirin. Bir kez daha tekrarla.</li>
	<li>Şişeyi -20 °C'de 2 gün saklayın. Kolaylık sağlamak için daha uzun süre kuluçkaya yatmak mümkündür.</li>
</ol>5. Gün 5: Rehidrasyon
<ol><li>Şişeyi oda sıcaklığına ısıtın.</li>
	<li>Metanolünü %75 metanol/%25 PBST'nin 4 mL'si ile değiştirin. Oda sıcaklığında 5 dakika kaya.</li>
	<li>5.2 adımdaki çözeltiyi 4 mL%50 metanol/%50 PBST ile değiştirin ve 5 dakika boyunca kayan.</li>
	<li>5.3 adımdaki çözeltiyi% 25 metanol / % 75 PBST'nin 4 mL'si ve 5 dakika boyunca kaya ile değiştirin.</li>
	<li>5.4 adımdaki çözümü 4 mL PBST ile değiştirin ve 10 dakika boyunca kayan.</li>
	<li>PBST'yi 4 mL taze PBST ve kaya ile 10 dakika değiştirin. Bir kez daha tekrarla.</li>
</ol>6. Gün 5: Proteinaz K sindirim
<ol><li>PBST'yi 2 mL proteinaz K çözeltisi (20 μg/mL, PBST'de% 1 DMSO son konsantrasyon) ile değiştirin ve oda sıcaklığında 30 dakika boyunca kayan. NOT: 6 mm'den uzun larvalar daha uzun bir kuluçka süresine ve /veya daha yüksek bir proteinaz K konsantrasyonuna ihtiyaç duyacaktır. Kesin zaman ve konsantrasyonun ampirik olarak belirlenmesi gerekecektir. 6 mm'den uzun her 0,5 mm için kuluçka süresinde 10 dakikalık bir artışla başlayın.</li>
	<li>Proteinaz K çözeltisini 4 mL PBST ile değiştirin ve 10 dakika boyunca kayan.</li>
	<li>PBST'yi 4 mL taze PBST ve kaya ile 10 dakika değiştirin. Bir kez daha tekrarla.</li>
	<li>PBST'yi 4 mL taze sabitleme çözeltisi ve 1 saat boyunca kaya ile değiştirin. Kolaylık sağlamak için 4 °C'de daha uzun süre kuluçkaya yatmak mümkündür.</li>
</ol>7. Gün 5: Beyazlatma
<ol><li>Sabitleme solüsyonunun yerine 4 mL PBST ve oda sıcaklığında 10 dakika kaya kullanın.</li>
	<li>PBST'yi 4 mL taze PBST ve kaya ile 10 dakika değiştirin. Bir kez daha tekrarla.</li>
	<li>Larvaları 6 kuyulu bir tabağa aktarın (kuyu başına 10 larvaya kadar).</li>
	<li>PBST'yi 3 mL taze ağartma çözeltisi ile değiştirin.</li>
	<li>Oda sıcaklığında kaya ve her 5 dakikada bir diseksiyon mikroskobu altında pigmentasyonu izleyin. Mezonephros boyunca pigmentasyonun kayboluşunu arayın (yüzme mesanesine ve bağırsasına dorsal). NOT: 6 mm uzunlukta larvalar için, mezonephroları çevreleyen pigmentasyonun ağartması 20 dakika kadar sürecektir. Larvaların bütünlüğünü korumak için gerekenden daha uzun süre ağartmayın.</li>
	<li>Larvaları tekrar bir cam şişeye aktarın.</li>
	<li>Beyazlatma solüsyonunun yerine 4 mL PBST kullanın. 10 dakika boyunca kaya.</li>
	<li>PBST'yi 4 mL taze PBST ve kaya ile 10 dakika değiştirin. Bir kez daha tekrarla.</li>
	<li>PBST'yi 4 mL taze sabitleme çözeltisi ve 1 saat boyunca kaya ile değiştirin. Kolaylık sağlamak için 4 °C'de daha uzun süre kuluçkaya yatmak mümkündür.</li>
</ol>8. 5. Gün: Prehidrizasyon
NOT: 70 °C'de yapılan adımlar için şişe soğutmasını en aza indirmek için hızlı bir şekilde çalışmak önemlidir.
<ol><li>Sabitleme solüsyonunun yerine 4 mL PBST ve oda sıcaklığında 10 dakika kaya kullanın.</li>
	<li>PBST'yi 4 mL taze PBST ve kaya ile 10 dakika değiştirin. Bir kez daha tekrarla.</li>
	<li>PBST'yi 4 mL Hyb çözeltisi ile değiştirin ve 10 dakika boyunca oda sıcaklığında kayan. DİkKAT: Hyb-, Hyb+ ve prob çözeltileri cildi tahriş edebilecek formamid içerir. Bu çözümleri kullanmak için eldiven kullanın.</li>
	<li>Hyb-'i 4 mL taze Hyb ile değiştirin ve 10 dakika boyunca kaya. Bir kez daha tekrarla.<ol>
<li>Kullanılmış Hyb-, Hyb+ ve prob çözeltilerini uygun bertaraf için ayrı bir atık konteynerinde toplayın.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Hyb- yerine Hyb+ çözümünün 4 mL'si kullanın.</li>
	<li>Şişeyi gece boyunca 70 °C'de kuluçkaya yatırın.</li>
	<li>EGFP-floresan prob 1:100 hyb+ 500 μL seyreltin ve 70 °C'de O/N kuluçkaya yatırın. NOT: Prob sentezi için üreticinin yönergelerini izleyin.</li>
</ol>9. Gün 6: Prob hibridizasyonu
<ol><li>Şişedeki Hyb+ çözeltisini önceden ısıtılmış probla değiştirin ve gece boyunca 70 °C'de kuluçkaya yatırın. NOT: 6 mm'den uzun larvalar 2 günlük inkübasyona ihtiyaç duyar.</li>
	<li>Yıkama tamponu, 2x SSCT ve 0,2x SSCT çözümlerini 70 °C'de gece boyunca önceden ısıtın.</li>
</ol>10. Gün 7: Prob yıkama
<ol><li>Probu önceden ısıtılmış yıkama tamponunun 4 mL'si ile değiştirin ve 70 °C'de 30 dakika kuluçkaya yatırın.<ol>
<li>Kullanılmış probu uygun bertaraf için ayrı bir atık konteynerinde toplayın.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Yıkama tamponu 4 mL taze yıkama tamponu ile değiştirin ve 70 °C'de 30 dakika kuluçkaya yatırın.</li>
	<li>Yıkama tamponu önceden ısıtılmış 2x SSCT çözeltisinin 4 mL'si ile değiştirin ve 70 °C'de 15 dakika kuluçkaya yatırın.</li>
	<li>50 mL'lik bir tüpe önceden ısıtılmış 0,2x SSCT 50 mL ekleyin.<ol>
<li>Tüpün üstüne bir hücre süzgeci (100 μm) yerleştirin. Hücre süzgecinin durana kadar aşağı itilmesini sağlayın.</li>
		<li>Larvaları cam şişeden hücre süzgecine aktarın. Larvaların tampona batırılmış olduğundan emin olun ve 2 saat boyunca 70 °C'de kuluçkaya yatırın.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Önceden ısıtılmış 0,2 kat SSCT'nin 50 mL'lik yeni bir tüpünü hazırlayın.<ol>
<li>Hücre süzgecini adım 10.4.2'den 0.2x SSCT'nin yeni tüpüne aktarın ve 2 saat boyunca 70 °C'de kuluçkaya yatırın.</li>
		<li>10.5. adımı bir kez daha tekrarlayın.</li>
	</ol>
</li>
</ol>11. Gün 7: Engelleme
<ol><li>Larvaları yeni bir cam şişeye aktarın ve oda sıcaklığına soğutun.</li>
	<li>0,2x SSCT'yi 4 mL%67 0,2x SSCT/%33 MABT ile değiştirin ve oda sıcaklığında 10 dakika boyunca kayan.</li>
	<li>11.2 adımındaki çözeltiyi 4 mL%33 0.2x SSCT/%67 MABT ile değiştirin ve 10 dakika boyunca kayan.</li>
	<li>11.3 adımdaki çözeltiyi 4 mL MABT ile değiştirin ve 10 dakika boyunca kayan.</li>
	<li>MABT'yi 4 mL taze MABT ve kaya ile 10 dakika değiştirin. Bir kez daha tekrarla.</li>
	<li>MABT'yi 4 mL engelleme çözeltisi ile değiştirin ve bir gecede 4 °C'de kuluçkaya yatırın. Kolaylık sağlamak için daha uzun süre kuluçkaya yatmak mümkündür.</li>
</ol>12. Gün 8 - 9: Antikor inkübasyonu
<ol><li>Anti-floresan antikoru 1:5.000 500 μL blokaj çözeltisinde seyreltin.</li>
	<li>Blokaj çözeltisini antikor çözeltisi ile değiştirin ve 2 gün boyunca 4 °C'de kuluçkaya yatırın. Kolaylık sağlamak için daha uzun süre kuluçkaya yatmak mümkündür.<ol>
<li>Larvaları çalkalamak için şişeyi günde iki kez döndürün. NOT: 6 mm'den uzun larvalar 1-2 gün daha kuluçkaya ihtiyaç duyar.</li>
	</ol>
</li>
</ol>13. Gün 10 - 11: Antikor yıkama
<ol><li>Antikor çözeltisini 4 mL PBST ile değiştirin ve 10 dakika boyunca oda sıcaklığında kaya.</li>
	<li>PBST'yi 4 mL taze PBST ve kaya ile 10 dakika değiştirin. Bir kez daha tekrarla.</li>
	<li>Larvaları 50 mL'lik bir tüpe aktarın.</li>
	<li>40 mL PBST2 ekleyin. Tüpü yan yatırın ve bir gecede 4 °C'de sallanın.</li>
	<li>PBST2'yi 40 mL taze PBST2 ile değiştirin ve gece boyunca 4 °C'de kaya. Kolaylık sağlamak için daha uzun süre kuluçkaya yatmak mümkündür. NOT: 6 mm'den uzun larvaların 1-2 gün daha yıkanması gerekir.</li>
</ol>14. Gün 12: Boyama
<ol><li>Larvaları 6 kuyulu bir tabağa aktarın.</li>
	<li>PBST2'yi 5 dakika boyunca oda sıcaklığında 3 mL boyama tamponu ve kaya ile değiştirin.</li>
	<li>Boyama tamponu 3 mL taze boyama tamponu ve kaya ile 5 dakika değiştirin. Bir kez daha tekrarla.</li>
	<li>Boyama tamponu 3 mL boyama çözeltisi ile değiştirin. Alüminyum folyo ile örtün ve önümüzdeki birkaç saat boyunca lekeleri izleyin.<ol>
<li>Zayıf sinyalli problar için, bir gecede 4 °C'de kuluçkaya yatırın ve arada bir kez boyama çözeltisini taze boyama çözeltisi ile değiştirin.</li>
	</ol>
</li>
	<li>İstenilen boyama yoğunluğuna ulaşıldığında, boyama çözeltisini 3 mL durdurma çözeltisi ve 30 dakika kaya ile değiştirin.</li>
	<li>Durdurma solüsyonunun yerine 3 mL taze durdurma çözeltisi ve 30 dakika boyunca kaya kullanın. Bir kez daha tekrarla.</li>
	<li>Larvaları yeni bir cam şişeye aktarın ve durdurma çözeltisini 4 mL taze sabitleme çözeltisi ile değiştirin ve oda sıcaklığında 1 saat kuluçkaya yatırın. Kolaylık sağlamak için 4 °C'de daha uzun süre kuluçkaya yatmak mümkündür.</li>
	<li>Larvaları bir yıla kadar 4 ° C'de karanlıkta sabitleme çözeltisinde saklayın.</li>
</ol>15. Gün 12: Görüntüleme
<ol><li>Sabitleme solüsyonunun yerine 4 mL PBST ve oda sıcaklığında 10 dakika kaya kullanın.</li>
	<li>Larvaları 6 kuyulu bir tabağa aktarın.</li>
	<li>PBST'yi 4 mL taze PBST ve kaya ile 10 dakika değiştirin. Bir kez daha tekrarla.</li>
	<li>PBST'yi %50 gliserol (PBST'de) 3 mL ile değiştirin ve 10 dakika boyunca kayan.</li>
	<li>15.4 adımdaki çözeltiyi 10 dakika boyunca sallanmadan 3 mL% 100 gliserol ile değiştirin.</li>
	<li>Larvaları doğrudan 6 kuyu plakasında görüntülemek veya larvaları bileşik bir mikroskop altında görüntüye bir çöküntü slaydına aktarmak için bir diseksiyon mikroskobu kullanın. Larvaları yönlendirmek için bir kirpik manipülatörü kullanın.</li>
</ol>

<ol><li>Kinth, P., Mahesh, G., Panwar, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mapping+of+zebrafish+research%3A+a+global+outlook%5BTitle%5D)+AND+%22Zebrafish%22%5BJournal%5D)">Mapping of zebrafish research: a global outlook.</a> Zebrafish. 10 (4), 510-517 (2013).</li>
<li>Grunwald, D. J., Eisen, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Headwaters+of+the+zebrafish+-+emergence+of+a+new+model+vertebrate%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews.+Genetics%22%5BJournal%5D)">Headwaters of the zebrafish - emergence of a new model vertebrate.</a> Nature Reviews. Genetics. 3 (9), 717-724 (2002).</li>
<li>Wingert, R. A., Davidson, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+zebrafish+pronephros%3A+a+model+to+study+nephron+segmentation%5BTitle%5D)+AND+%22Kidney+International%22%5BJournal%5D)">The zebrafish pronephros: a model to study nephron segmentation.</a> Kidney International. 73 (10), 1120-1127 (2008).</li>
<li>Drummond, I. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Kidney+development+and+disease+in+the+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Society+of+Nephrology%3A+JASN%22%5BJournal%5D)">Kidney development and disease in the zebrafish.</a> Journal of the American Society of Nephrology: JASN. 16 (2), 299-304 (2005).</li>
<li>Swanhart, L. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zebrafish+kidney+development%3A+basic+science+to+translational+research%5BTitle%5D)+AND+%22Birth+defects+research.+Part+C%2C+Embryo+Today%3A+Reviews%22%5BJournal%5D)">Zebrafish kidney development: basic science to translational research.</a> Birth defects research. Part C, Embryo Today: Reviews. 93 (2), 141-156 (2011).</li>
<li>Dressler, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Advances+in+early+kidney+specification%2C+development+and+patterning%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Advances in early kidney specification, development and patterning.</a> Development. 136 (23), 3863-3874 (2009).</li>
<li>Johnson, C. S., Holzemer, N. F., Wingert, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Laser+ablation+of+the+zebrafish+pronephros+to+study+renal+epithelial+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">Laser ablation of the zebrafish pronephros to study renal epithelial regeneration.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (54), e2845(2011).</li>
<li>Marra, A. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualizing+gene+expression+during+zebrafish+pronephros+development+and+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Visualizing gene expression during zebrafish pronephros development and regeneration.</a> Methods in Cell Biology. 154, 183-215 (2019).</li>
<li>McMenamin, S. K., Chandless, M. N., Parichy, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Working+with+zebrafish+at+postembryonic+stages%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Working with zebrafish at postembryonic stages.</a> Methods in Cell Biology. 134, 587-607 (2016).</li>
<li>Diep, C. Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+the+zebrafish+mesonephros%5BTitle%5D)+AND+%22Genesis%22%5BJournal%5D)">Development of the zebrafish mesonephros.</a> Genesis. 53 (3-4), 257-269 (2015).</li>
<li>Zhou, W., Boucher, R. C., Bollig, F., Englert, C., Hildebrandt, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+mesonephric+development+and+regeneration+using+transgenic+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology.+Renal+Physiology%22%5BJournal%5D)">Characterization of mesonephric development and regeneration using transgenic zebrafish.</a> American Journal of Physiology. Renal Physiology. 299 (5), 1040-1047 (2010).</li>
<li>Diep, C. Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+adult+nephron+progenitors+capable+of+kidney+regeneration+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Identification of adult nephron progenitors capable of kidney regeneration in zebrafish.</a> Nature. 470 (7332), 95-100 (2011).</li>
<li>Diep, C. Q., Mikeasky, N., Davidson, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aDiep%2C+CQ+%22The+Zebrafish+in+Biomedical+Research%3A+Biology%2C+Husbandry%2C+Diseases%2C+and+Research+Applications%22">The Zebrafish in Biomedical Research: Biology, Husbandry, Diseases, and Research Applications</a>. Cartner, S. C., et al. , Elsevier. 145-150 (2020).</li>
<li>Parichy, D., Elizondo, M., Mills, M., Gordon, T., Engeszer, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Normal+table+of+postembryonic+zebrafish+development%3A+staging+by+externally+visible+anatomy+of+the+living+fish%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+dynamics%3A+An+Official+Publication+of+the+American+Association+of+Anatomists%22%5BJournal%5D)">Normal table of postembryonic zebrafish development: staging by externally visible anatomy of the living fish.</a> Developmental dynamics: An Official Publication of the American Association of Anatomists. 238 (12), 2975-3015 (2009).</li>
<li>Guo, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((LIM+Homeobox+4+%28lhx4%29+regulates+retinal+neural+differentiation+and+visual+function+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Science+Reports%22%5BJournal%5D)">LIM Homeobox 4 (lhx4) regulates retinal neural differentiation and visual function in zebrafish.</a> Science Reports. 11 (1), 1977(2021).</li>
<li>Vauti, F., Stegemann, L. A., Vogele, V., Koster, R. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((All-age+whole+mount+in+situ+hybridization+to+reveal+larval+and+juvenile+expression+patterns+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+One%22%5BJournal%5D)">All-age whole mount in situ hybridization to reveal larval and juvenile expression patterns in zebrafish.</a> PloS One. 15 (8), 0237167(2020).</li>
<li>Parichy, D. M., Turner, J. M., Parker, N. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Essential+role+for+puma+in+development+of+postembryonic+neural+crest-derived+cell+lineages+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Essential role for puma in development of postembryonic neural crest-derived cell lineages in zebrafish.</a> Developmental Biology. 256 (2), 221-241 (2003).</li>
<li>Yang, H., Wanner, I. B., Roper, S. D., Chaudhari, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+optimized+method+for+in+situ+hybridization+with+signal+amplification+that+allows+the+detection+of+rare+mRNAs%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Histochemistry+%26+Cytochemistry%22%5BJournal%5D)">An optimized method for in situ hybridization with signal amplification that allows the detection of rare mRNAs.</a> The Journal of Histochemistry & Cytochemistry. 47 (4), 431-445 (1999).</li>
<li>McCampbell, K. K., Springer, K. N., Wingert, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+nephron+composition+and+function+in+the+adult+zebrafish+kidney%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">Analysis of nephron composition and function in the adult zebrafish kidney.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (90), e51644(2014).</li>
</ol>

Yazarların çıkar çatışması yoktur.

Burada açıklanan in situ hibridizasyon yöntemi mezonephros gelişimini incelemeye yöneliktir. Bununla birlikte, metamorfoz sırasında bağırsak, sinir sistemi, ölçekler ve pigmentasyon gibi diğer doku ve organların gelişimini incelemek için uygulanabilir14. Endojen genler veya transgenik çizgilerdeki floresan belirteçler için problar oluşturulabilir.
Larvaların, organları ve dokuları kendi bağlamlarında gözlemlemek için bozulmadan kalmaları önemlidir. Doku bütünlü...

Zebra balığı embriyosu, küçük boyutu, şeffaflığı, mevcut araçları ve beş güne kadar beslenmeden hayatta kalması nedeniyle doku gelişimini incelemek için önemli bir modeldir1,2. Böbrek gelişiminin anlaşılmasına ve zebra balıkları ile memeliler arasındaki korumanın korunmasına büyük katkıda bulunmuştur3,4,5. Böbrek, sıvı homeostazını korumada, kanı filtrelemede ve atıkların atılmasında önemli bir rol oynar6. Böbreğin fonksiyonel birimi olan nefron, uzun bir tübüle bağlı bir kan filtresinden oluşur. Zebra balıklarında, yaşamı boyunca iki böbrek yapısı oluşur. Pronephros (geçici embriyonik böbrek) ilk olarak erken gelişim sırasında oluşur. Ön-arka eksen boyunca çalışan iki nefrondan oluşur ve döllenmeden (dpf) yaklaşık 2 gün sonra işlevsel hale gelir. Pronephros'un faydası basitliğinde yatmaktadır, çoğunlukla doğrusal ve görselleştirilmesi kolay sadece iki nefrona sahiptir (proksimal dolambaçlı tübül üç dpf'de sarmal yapmaya başlasa da)3. Bu sadece ara mezodermden erken gelişiminin çalışmalarını değil, aynı zamanda segmentasyon deseni ve tübül onarımını da kolaylaştırmıştır7,8.
Zebra balıklarının kullanışlılığı, yumurta sarısı azaldığında ve larvalar su sisteminde beslenmeye dayandığında beş dpf'den sonra sınırlı hale gelir9. Yaklaşık 2 haftalıkken larvalar, yeni dokuların oluştuğu ve eski dokuların kaybolduğu ve / veya yeniden düzenlendiği gençlere metamorfoz geçirir9. Bu aynı zamanda mezonephros (kalıcı yetişkin böbreği) 10,11,12 oluşturur. İlk yetişkin nefron altıncı somit yakınında oluşur ve pronephros distal erken tübül ile kaynaşır. Ek nefronlar başlangıçta bu konuma arka olarak eklenir, ancak daha sonra ön konuma da eklenir. Bu ilk dalgadaki birincil nefronlar pronephros tübüllerine kaynaşır ve atıklarını biriktirmek için ortak bir lümeni paylaşırlar. İkincil nefronlar bir sonraki dalgada oluşur ve birincil nefronlara kaynaşır. Bu tekrarlayıcı süreç, memeli böbreği gibi dallı bir mezonephros oluşturur. Muhtemelen, pronephros sonunda tübüle kimliğini kaybeder ve tüm nefronların atıklarını boşalttığı iki büyük toplama kanalı haline gelir13.
İlk yetişkin nefron oluşumundan önce, tek ata hücreleri ~4 mm (toplam uzunluk) larvalarda (~10 dpf) görünmeye başlar. Tg(lhx1a-EGFP) transgenik çizgisinde işaretlenen bu hücreler, proneforolara yapışır ve gelecekteki nefrogenez bölgelerine göç eder gibi görünmektedir. Tek hücreler kümeler halinde birleşir ve bu da yeni nefronlara dönüşür12. Bu hücrelerin nerede yaşadığı veya mezonephrogenez başlangıcından önce hangi genleri ifade ettikleri belirsizdir.
Mezoneforos gelişimini anlamak, memeli böbreği hakkında pronephros'un yapamayacağı şekilde içgörüler sağlar. Bunlar arasında tek progenitör hücrelerden nefrojenik agregaların oluşumu, yeni nefronların mevcutlarla fonksiyonel entegrasyonu ve dallanma morfogenezi saydır. Bununla birlikte, postembriyonik gelişimi incelemek için sınırlamalar vardır. Larvalar daha büyük boyutları ve pigmentasyonları nedeniyle daha az şeffaftır. Gelişimsel zaman çizelgesi bireysel hayvanlar arasında senkronize değildir ve beslenme ve kalabalık oluşturma9,14 gibi çevresel faktörlere oldukça bağlıdır. Nakavt reaktifleri mevcut olmasına rağmen, larvalarda embriyolara kıyasla daha az etkilidirler15. Bu protokolde zebra balığı mezoteforos gelişimi sırasında gen ekspresyonunu belirlemek için yerinde melezleme yöntemi tanımlanmıştır. Mezomreforoların görselleştirilmesini ve prob ve antikorun penetrasyonunu ve yıkanmasını artırmak için çeşitli adımlar optimize edilmiştir. Tg(lhx1a-EGFP) transgenik hattı, EGFP'nin tek progenitör hücreleri, nefrojenik agregaları ve nascent nephronların distal tübüllerini etiketlemesi için bir prob ile birlikte kullanılır. Bu yöntem, mezometroların gelişiminin daha derin anlaşılmasını ve rejeneratif tedaviler hakkında fikir verilmesini sağlayacaktır.

<table><tbody><tr><td>Anti-floresein antikoru</td><td>Roche/Sigma-Aldrich</td><td>11426338910</td><td></td></tr><tr><td>Ağartma solüsyonu</td><td></td><td></td><td>PBST Bloke edici reaktifte %0.8 KOH, %0.9 H2O2</td></tr><tr><td></td><td>Roche/Sigma-Aldrich</td><td>11096176001</td><td>Bloke edici çözelti için kullanın, üreticinin talimatına göre hazırlayın</td></tr><tr><td>Hücre süzgeci</td><td>Fisher Scientific</td><td>&nbsp; 22-363-549</td><td>100 &mu; m</td></tr><tr><td>E3 ortamı</td><td></td><td></td><td>5 mM NaCl, 0.33 mM CaCl2, 0.33 mM MgSO4, 0.17 mM KCl, %0.0001 metilen mavisi</td></tr><tr><td>Kirpik manipülatörü</td><td>Fisher Scientific</td><td>NC1083208</td><td>Larvaları manipüle etmek için kullanın</td></tr><tr><td>Sabitleme çözeltisi</td><td></td><td></td><td>% 4 paraformaldehit,% 1 DMSO PBS'de; 65 ° C'de ısı; Toz eriyene kadar çalkalarken C, ardından soğuduktan sonra DMSO'yu ekleyin</td></tr><tr><td>Floresein prob sentezi</td><td>Roche/Sigma-Aldrich</td><td>11685619910</td><td></td></tr><tr><td>Cam şişe</td><td>Fisher Scientific</td><td>03-338B</td><td></td></tr><tr><td>Hatchfry kapsülleme</td><td>Argent</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Hyb- çözeltisi</td><td></td><td></td><td>%50 formamid, 5X SSC, %0.1 Tween-20</td></tr><tr><td>Hyb+ çözeltisi</td><td></td><td></td><td>HYB-, 5 mg/mL torula RNA, 50 ug/mL heparin</td></tr><tr><td>MAB (10X)</td><td></td><td></td><td>1 M maleik asit, 1.5 M NaCl, pH 7.5</td></tr><tr><td>MABT</td><td></td><td></td><td>1X MAB, %0.1 Tween-20</td></tr><tr><td>Maleik asit</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M0375</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehit</td><td>Sigma Aldrich</td><td>158127</td><td></td></tr><tr><td>PBS (10X)</td><td></td><td></td><td>%8 NaCl, %0.2 KCl, %1.44 Na2HPO4, %0.24 KH2PO4</td></tr><tr><td>PBST</td><td></td><td></td><td>1X PBS, %0.1 Ara-20</td></tr><tr><td>PBST2</td><td></td><td></td><td>1X PBS, %0.2 Ara-20</td></tr><tr><td>Toz gıda</td><td></td><td></td><td>50 mL balık sistemi suyunda 2 g spirulina ve hatchfry enkapsülonunu karıştırın ve iyice çalkalayın</td></tr><tr><td>Proteinaz K</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P5568</td><td>Larvaları geçirgen hale getirmek için kullanın</td></tr><tr><td>Proteinaz K çözeltisi</td><td></td><td></td><td>20&nbşk; &mu; g/mL, PBST</td></tr><tr><td>Spirulina mikro ince tozunda</td> %1 DMSO nihai konsantrasyonu <td>Argent</td><td></td><td></td></tr><tr><td>SSC (20X)</td><td></td><td></td><td>3 M NaCl, 0,3 M sodyum asetat susuz, pH 7, otoklav</td></tr><tr><td>SSCT (0,2X)</td><td></td><td></td><td>20X SSC'den seyreltin, %0,1 Tween-20</td></tr><tr><td>SSCT (2X)</td><td></td><td></td><td>20X SSC'den seyreltin, %0,1 Tween-20</td></tr><tr><td>Boyama tamponu</td><td></td><td></td><td>100 mM Tris pH 9.5, 50 mM MgCl2, 100 mM NaCl, %0.1 Tween-20</td></tr><tr><td>Boyama çözeltisi</td><td></td><td></td><td>200 &mu; g / mL iyodonitrotetrazolyum klorür, 200 &mu; g/mL 5-Bromo-4-kloro-3-indolil fosfat disodyum tuzu, boyama tamponunda</td></tr><tr><td>Durdurma çözeltisi</td><td></td><td></td><td>1 mM EDTA, pH 5.5, PBST</td></tr><tr><td>Torula (maya) RNA'sında</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>R6625</td><td></td></tr><tr><td>Trikain</td><td>Sigma Aldrich</td><td>E10521</td><td>%2, pH 7</td></tr><tr><td>Yıkama tamponu</td><td></td><td></td><td>%50 formamid, 2X SSC, %0.1 Tween-20</td></tr></tbody></table>

in situ mesonephros gelişimi sırasında zebra balığı larvaları ve yavrularında melezleme

In Situ Hybridization in Zebrafish Larvae and Juveniles during Mesonephros Development

Zebra balığı ömrü boyunca iki böbrek yapısı oluşturur. Pronephros (embriyonik böbrek) embriyonik gelişim sırasında oluşur ve döllenmeden 2 gün sonra çalışmaya başlar. Sadece iki nefrondan oluşan pronephros, artan vücut kütlesi nedeniyle daha fazla böbrek fonksiyonu gerekli olana kadar larva yaşamı boyunca tek böbrek görevi görür. Bu yüksek taleple başa çıkmak için, metamorfoz sırasında mezonephros (yetişkin böbrek) oluşmaya başlar. Yeni birincil nefronlar pronephros'a kaynaşır ve bağlı lümenler oluşturur. Daha sonra, ikincil nefronlar, mezonephros'ta bir dallanma ağı oluşturmak için birincil olanlara (vb.) kaynaşır. Araştırmaların büyük çoğunluğu embriyo kullanma kolaylığı nedeniyle pronephros üzerinde yoğunlaşmıştır. Bu nedenle, mezonephros gelişimini daha iyi anlamak için daha yaşlı ve daha büyük larvaları ve yavru balıkları incelemek için teknikler geliştirmeye ihtiyaç vardır. Burada, gen ekspresyon analizi için bir in situ hibridizasyon protokolü, prob penetrasyonu, probların ve antikorların yıkanması ve mezomünleri daha iyi görselleştirmek için pigmentlerin ağartılması için optimize edilmiştir. Tg(lhx1a-EGFP) transgenik hattı, progenitör hücreleri ve nascent nephronların distal tübüllerini etiketlemek için kullanılır. Bu protokol mesonephros araştırmalarındaki boşluğu dolduruyor. Yeni böbrek dokularının mevcut nefronlarla nasıl oluştuğunu ve bütünleşip yenileyici tedaviler hakkında fikir verdiğini anlamak için çok önemli bir modeldir.

Tg(lhx1a-EGFP) transgenik hattı kullanılarak, bu in situ hibridizasyon protokolünün mezonephros gelişimi sırasında böbrek progenitör hücrelerinin ve çeşitli nefron yapıların etiketlenmesinde etkili olduğu gösterilmiştir. Beklendiği gibi, merkezi sinir sistemi de bu transgenik çizgide etiketlenmiştir (gösterilmez). İlk mezofrerik nefron yaklaşık 5,2 mm'de oluşur, pronephros'a dorsal (Şekil 2A) ve bu nefron distal tübül EGFP10,12 ile etiketlenmiştir.<s...

Zebra balığı böbrek gelişimini anlamak için önemli bir modeldir. Burada, mezonephros gelişimi sırasında zebra balığı larvalarında ve yavrularda gen ekspresyonunu tespit etmek için bir in situ melezleme protokolü optimize edilmiştir.

In Situ Mesonephros Gelişimi Sırasında Zebra Balığı Larvaları ve Yavrularında Melezleme

The zebrafish forms two kidney structures in its lifetime. The pronephros (embryonic kidney) forms during embryonic development and begins to function at ...

Bu protokol önemlidir, çünkü metamorfoz sırasında yaşlı zebra balığı larvalarında ve yavrularında gen ekspresyonunun belirlenmesine izin verir. Bu tekniğin avantajı, prob penetrasyonu ve böbreğin görselleştirilmesi için birkaç adımın optimize edilmiş olmasıdır. Başlamak için, son yemeklerinden sonra öğleden sonra geç saatlerde bir çiftleşme tankına bir erkek ve bir dişi balık ekleyerek çiftleşmek için yetişkin zebra balığı kurun.Ertesi gün, embriyoları E3 ortamı içeren Petri plakalarında toplayın. Döllenmeden beş gün sonra, 2.8 litrelik bir tanka 400 mikrometrelik bir ekran yerleştirin ve 2 santimetre sistem suyu ile doldurun. Sonra larvaları bir Petri tabağından ekleyin.Larvayı düzeltmek için, istenen zaman noktasında bir larva tankını çıkarın, ardından bir ağ kullanarak ve ucu kesilmiş pipet aktarın, larvayı Petri plakasına aktarın. Daha sonra, larvayı hareketsiz hale getirmek için iki mililitre% 2 trikain ekleyin. Hareketsiz hale getirdikten sonra, trikaini 20 mililitre sabitleme çözeltisi ile değiştirin.30 dakika sonra larvaları 25 mililitre taze sabitleme çözeltisi içeren 50 mililitrelik bir tüpe aktarın. Daha sonra, kapağın sıkı olduğundan emin olarak, tüpü iki gün boyunca dört santigrat derecede yavaşça sallar. Üçüncü gün, sabitleme çözeltisini 20 mililitre PBST ile değiştirin, ardından larvayı bir Petri plakasına aktarın.Larvayı ölçmek için, Petri plakasını bir diseksiyon mikroskobu altında düz bir cetvelin üzerine yerleştirin, ardından bir kirpik manipülatörü kullanarak, toplam uzunluğunu ölçmek için her larvayı cetvelin üzerine taşıyın. Tüm larvaları ölçtükten sonra, benzer uzunluklardaki birkaç larvayı PBST ile bir 5,5 mililitrelik cam şişede birleştirin. Dehidrasyon için, PBST'yi cam şişedeki% 100 metanol dört mililitre ile değiştirin, ardından şişeyi iki gün boyunca eksi 20 santigrat derecede saklayın.Rehidrasyon için% 100 metanolünü% 75 metanol ve% 25 PBST çözeltisinin dört mililitresi ile değiştirin ve şişeyi beş dakika sallayın. Ardından, metanol ve PBST çözeltisini dört mililitre taze PBST ile değiştirin ve şişeyi 10 dakika boyunca tekrar sallayın. Proteinaz K sindirimi için PBST'yi iki mililitre proteinaz K çözeltisi ile değiştirin ve şişeyi oda sıcaklığında 30 dakika sallayın.Daha sonra, ağartma için larvayı altı kuyulu bir tabağa aktarın ve PBST'yi üç mililitre taze ağartma çözeltisi ile değiştirin. Mezonephros boyunca pigmentasyonun tamamen kaybolmasından sonra, larvayı bir cam şişeye geri aktarın, ağartma çözeltisini dört mililitre PBST ile değiştirin ve şişeyi 10 dakika sallayın. Ön hibridizasyon için sabitleme solüsyonunu dört mililitre PBST ile değiştirin ve şişeyi 10 dakika sallayın, ardından PBST'yi dört mililitre Hyb çözeltisi ve 10 dakika boyunca kaya ile değiştirin.Hyb çözeltisinde iki ek inkübasyondan sonra, çözeltiyi hyb+çözeltinin dört mililitresi ile değiştirin. Egfp floresan probunu aynı anda 500 mikrolitrede 100 mikrolitre hibridizasyon artı çözelti ile seyreltin ve şişeyi ve probu bir gecede 70 santigrat derecede kuluçkaya yatırın. Ertesi gün, probu melezlemek için şişedeki Hyb+çözeltisini önceden ısıtılmış probla değiştirin ve bir gecede 70 santigrat derecede kuluçkaya yatırın.Ertesi gün, 50 mililitrelik bir tüpe 50 mililitre önceden ısıtılmış 0,2 kat SSCT ekleyin. Daha sonra, tüpün üstüne 100 mikrometre hücre süzgeci yerleştirin, larvaları cam şişeden hücre süzgecine aktarın ve larvaların tampona batırılmasını sağlayın, şişeyi iki saat boyunca 70 santigrat derecede kuluçkaya yatırın. Kuluçkadan sonra, hücre süzgecini önceden ısıtılmış 0,2 kat SSCT içeren yeni bir tüpe aktarın ve iki saat boyunca 70 santigrat derecede tekrar kuluçkaya yayalım.Daha sonra, blokaj için larvayı yeni bir cam şişeye aktarın ve oda sıcaklığına soğumasını bekleyin. Ardından, 0,2 kat SSCT çözeltisini dört mililitre 67%0,2 kat SSCT ve %33 MABT çözelti ile değiştirin ve şişeyi oda sıcaklığında 10 dakika sallayın. Ardından, SSCTT MABT çözeltisini dört mililitre taze MABT ile değiştirin ve şişeyi bir rocker üzerinde 10 dakika kuluçkaya bırakın.Ardından, MABT'yi dört mililitrelik blokaj çözeltisi ile değiştirin ve bir gecede dört santigrat derece kuluçkaya yatırın. Ertesi gün, blokaj çözeltisini bir antikor çözeltisi ile değiştirin ve iki gün boyunca dört santigrat derecede kuluçkaya yatırın. Antikor yıkama için larvayı 50 mililitrelik bir tüpe aktarın, ardından 40 mililitre PBST2 ekleyin ve tüpü dört santigrat derecede gece kuluçka için yan yatırın.12. günde, lavları altı kuyulu bir tabağa aktardıktan sonra, PBST2'yi üç mililitrelik boyama tamponu ile değiştirin. Bir rocker üzerinde beş dakikalık bir inkübasyondan sonra, boyama tamponunu üç mililitrelik boyama çözeltisi ile değiştirin. İstenilen lekeleme yoğunluğuna ulaşıldığında, boyama çözeltisini üç mililitre durdurma çözeltisi ile değiştirin ve 30 dakika boyunca kayan.Daha sonra larvayı yeni bir cam şişeye aktarın, durdurma çözeltisini dört mililitre taze sabitleme çözeltisi ile değiştirin ve oda sıcaklığında bir saat kuluçkaya yatırın. Görüntüleme için sabitleme çözümünü dört mililitre taze PBST ile değiştirin. Bir rocker üzerinde 10 dakikalık bir inkübasyonu takiben, larvayı altı kuyulu bir tabağa aktarın, ardından PBST'yi dört mililitre taze PBST ile değiştirin ve plakayı 10 dakika boyunca tekrar sallayın.Daha sonra, PBST'ye üç mililitre% 50 gliserol ekleyin ve 10 dakika boyunca kayan, daha sonra bir diseksiyon mikroskobu kullanarak larvayı doğrudan altı kuyu plakasında görüntüleyin. Bu in situ hibridizasyon protokolü, mezonephros gelişimini kullanarak böbrek progenitör hücrelerini ve çeşitli nefron yapılarını etkili bir şekilde etiketler. İlk mezometerik nefron pronephros için yaklaşık 5.2 milimetre sırtta oluşur.Mezoneforo gelişimi sırasında tek progenitör hücrelere ek olarak progenitör hücre kümeleri de mevcuttur. Daha büyük gençlerde, somitlerde arka plan lekesi oluşabilir. Genel olarak, bu yöntem, parçalanmış yetişkin organlarına ek olarak metamorfoz sırasında oluşan diğer dokuları incelemek için kullanılabilir.

in-situ-hybridization-zebrafish-larvae-juveniles-during-mesonephros

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Gelişim Biyolojisi

In situ hibridizasyon Tüm montaj, gelişim biyolojisi en yaygın olarak kullanılan teknikleri biridir. Burada, tek bir genin kesin ifadelerde desen analiz ve iki genin ifadesi etki çakışma belirlenmesi için çift floresan in situ hibridizasyon protokol yüksek çözünürlüklü sunuyoruz. Biz bir doku organizasyon vurgulamak için propidium iyodür nükleer karşı leke içerir.

Zebra balığı Tüm Dağı Yüksek Çözünürlüklü Çift Floresan Yerinde Hibridizasyon

Tüm Dağı In situ Moleküler Biyoloji ve organizma Biyoloji Link Hibridizasyon

Zebra balığı, küçük tropikal balık, omurgalı geliştirme ve hastalık sırasında gen fonksiyonu çalışmak için popüler bir model haline gelmiştir. Hedef genlerin uzaysal ve zamansal ifade ile tespit...

Yüksek Çözünürlüklü Tüm Dağı<em&gt; Yerinde</emGen İfade ve Fonksiyon Eğitim için Zebra balığı Embriyolar içinde&gt; Hibridizasyon

Çoğalma, desenleme, farklılaşma ve akson rehberlik gibi gelişimsel süreçleri kolaylıkla Zebrafish omurilikte örnek alınabilir. Bu yazıda, bu olayların görselleştirme optimize eden, zebra balığı embriyolarının için bir montaj prosedürü açıklar.

Diseksiyon ve Zebra balığı Embriyolar Yanal Montaj: Omurilik Kalkınma Analizi

Zebra balığı embriyo gelişim biyoloji araştırma için mükemmel bir model. Embriyogenez sırasında, zebra balığı örnek gözlem ve analiz için üç-boyutlu zorluklar sunuyor, bir yumurta sarısı kitle ile gelişir. Bu protokol situ (DİLERİZ) lekeli Zebra balığı embriyo örnekleri içinde bütün montaj iki-boyutlu düz monte hazırlıkları nasıl oluşturulacağı açıklanır.

Tüm Dağı ile Zebra balığı Embriyo örnekler Vitray gözlenmesi ve Analiz Daire Dağı Hazırlık<em&gt; In situ</em&gt; Melezleme

Zebra balığı, daha yüksek omurgalılarla genetik benzerlikleri nedeniyle gelişimsel biyoloji ve insan hastalıkları araştırmaları için güçlü bir model sistemdir. Bu protokol, erken embriyogenez için gerekli olan genlerdeki resesif mutasyonları tanımlamak için ileri tarama stratejileri için kullanılabilecek haploid zebra balığı embriyoları oluşturmak için bir metodolojiyi açıklar.

Haploit Zebra balığı Embriyolar üretimi ile<em&gt; In Vitro</em&gt; Gübreleme

Teknikler, tüm zebra balığı embriyolar fosfo-epitopları immunostain ve daha sonra birincil kirpikler kadar küçük hücresel yapılarının iki renkli flüoresan konfokal lokalizasyonu yapmak için tarif edilmiştir. tespit ve görüntüleme için teknikler yer ve spesifik protein ortaya veya aktivasyon kinetikleri tanımlayabilir.

Tüm Dağı Zebra balığı Embriyolar kirpikli Organları boyanmasına Fosfo-epitoplar

Burada anlatılan yöntemi fokal ve düzlemsel kaymasını düzeltmek için optik bölümlendirilmeleri ve güçlük basit stratejileri yürütebilecek diseksiyon mikroskobu bir floresan kullanılarak Zebra balığı embriyolarının organ gelişiminin time-lapse analiz sağlar.

diseksiyon mikroskobu kullanılarak Time-lapse Görüntüleme ile Zebra balığı Böbrek Kalkınma Analizi Optik Kesit için donatılmış

Kirpikler geliştirme için uygun organogenesis hayati önem taşımaktadır. Bu iletişim kuralı etiket ve Zebra balığı siliyer hücreleri görselleştirmek için en iyi duruma getirilmiş bir yöntemini açıklar.

Zebra balığı bütün Dağı Floresan Situ hibridizasyon ve ayirt kombine bir protokol aracılığıyla Multiciliated hücrelerde görüntülenmesi

Burada, zebra balığı embriyoları ve larvalarının tüm preparatlarında floresan antikor aracılı proteinlerin tespiti için bir protokol salıyoruz.

Zebrabalığı Embriyoları ve Larvalarında Tüm Mount Immunohistochemistry

Bu protokol, zebra balığı embriyonik kesitlerinin in situ hibridizasyonu ve immünohistokimyasını birleştirerek görüntülerin nasıl elde edileceğini açıklar. Kriyoseksiyondan önce in situ hibridizasyon yapıldı, bunu takiben antikor boyaması yapıldı. Zebra balığında iki genin ekspresyon kalıplarını, antikorların yetersizliği varsa tespit etmek yararlıdır.

In Situ Kriyokesitli Zebra Balığı Embriyolarında İmmünohistokimya ile Kombine Hibridizasyon

Öğrenin, Danio rerio larvalarında mezonefros gelişimi sırasında gen ekspresyonunu in situ hibridizasyon ile tespit etmeyi. Bu optimize protokol, böbrek gelişimini in vivo çalışmak için değerli bir yöntem sunar.

In Situ Mesonephros Gelişimi Sırasında Zebra Balığı Larvaları ve Yavrularında Melezleme

Daha fazla video keşfet