Name: Çok Fonksiyonlu Bir Sistem Kullanarak İnsan Kanseri ve Normal Hücrelerde Evet İlişkili Proteinin Tamamen Optik Mekanobiyoloji Sorgulaması (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-12-20T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 55 s
Description: Keşfedin YAP proteininin mekanobiyolojik hassasiyetini açıklamak için çok fonksiyonlu otomatik görüntüleme ve mekanobiyolojik analiz protokolünü. Bu yöntem, canlı hücre görüntüleme teknikleri kullanarak moleküler mekanizmaları ortaya koyar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Bu proje, UF Sağlık Kanseri Merkezi'nden (X. T. ve D. S.) Kanser Pilot Ödülü ve Gatorade Ödülü Başlangıç Paketi (X. T.) tarafından finansal olarak desteklenmektedir. Yazarlar, Dr. Jonathan Licht (UFHCC), Dr. Rolf Renne (UFHCC), Dr. Ji-Hyun Lee (Biyoistatistik, UF), Dr. Hugh Fan (MAE, UF), Dr. Warren Dixon (MAE, UF), Dr. Ghatu Subhash (MAE, UF), Dr. Mark Sheplak (MAE & ECE, UF), Dr. Malisa Sarntinoranont (MAE, UF), Dr. Scott Banks (MAE, UF), Dr. Matthew Traum (MAE, UF), Dr. David Hahn (Arizona Üniversitesi), Dr. Weihong Wang (Oracle Corporation), Dr. Youhua Tan (Hong Kong Politeknik Üniversitesi) ve Nikon Destek Ekibi (Dr. Jose Serrano-Velez, Larry Kordon ve Jon Ekman). Yazarlar, Tang's, Siemann's ve Guan'ın araştırma laboratuvarlarının tüm üyelerinden ve MAE & ECE & Fizik ve Radyasyon Onkolojisi Departmanları, UF'nin tüm personelinden gelen cömert ve etkili destek için derinden minnettardır.

1. mNeonGreen21-10/11 etiketli YAP proteinini endojen olarak ifade eden stabil CRISPR/ Cas9 düzenlemeli insan akciğer kanseri hücre hattı (PC9) ve insan bronşiyal epitel hücre hattının (Beas2B) üretimi
<ol><li>Yüksek kaliteli DNA polimerazını kullanarak floresan proteininin 11. telini kodlayan DNA dizisini yükseltmek için polimeraz zincir reaksiyonu (PCR) gerçekleştirin mNeonGreen2 ( Bkz. Malzeme Tablosu).</li>
	<li>CRISPR-Cas9 gen düzenleme sistemini kullanarak PC9 ve B2B hücre hatlarının YAP genomik lokusuna güçlendirilmiş DNA dizisini vurun. NOT: Bu DNA dizisi, floresan yaymak için mNeonGreen2'nin 1-10 iplikçiklerini tamamlar. YAP-mNeonGreen21-10/11'in genomik dizi haritası Ek Şekil S1'de gösterilmiştir. Harita, etiketli genomik, donör ve mNeonGreen2 dizilerini içerir.</li>
	<li>Bir epifluoresans mikroskobu kullanarak CRISPR/Cas9 tarafından tasarlanmış mNeonGreen2 ifadesini kontrol edin ( Bkz. Malzeme Tablosu). mNeonGreen2, hücreler YAP'ı yerel gen düzenleyici ağı bağlamında ifade ettigezeni her ifade ettince YAP olarak etiketlendiği için, hem CRISPR/ Cas9 tarafından tasarlanmış hücrelerde floresan yoğunluğunun varlığını kontrol edin hem de ebeveyn hücrelerindeki (kontrol) bununla karşılaştırın. NOT: Bu protokole uymak için (1) uyarılma için 488 nm lazer (47,5 mW/mm2) kullanın, (2) floresan ölçümü için 40x objektif (sayısal diyafram (NA) = 0,95) ve bant geçiş emisyon filtresi (ET525/50 nm) ve (3) Floresan yoğunluklarını ölçmek, ölçmek ve karşılaştırmak için ImageJ yazılımı.</li>
	<li>CRISPR/Cas9 tarafından düzenlenen hücre çizgilerinden genomik DNA çıkararak mNeonGreen211'in doğru entegrasyonunu onaylayın; doğru genomik loci19,20'de yerleştirmeyi onaylamak için genomik kesici ucu ve dizilemeyi kuşatır astarlar kullanarak PCR gerçekleştirin.</li>
	<li>CRISPR/Cas9 gen düzenleme sistemini kullanarak mNeonGreen211'i çökertin ve 1.3 adımında açıklanan aynı mikroskop sistemlerini ve görüntüleme parametrelerini kullanarak hücrelerdeki floresan yoğunluğu azaltmayı kontrol edin. NOT: Bu adım, floresan yoğunluklarının karşılaştırılmasıyla mNeonGreen211'in doğru entegrasyonunu doğrular. Crispr/Cas9 tarafından tasarlanmış, devirme ve ebeveyn hücreleri olmayan hücreler kontrol olarak kullanılır.</li>
	<li>Floresan ile aktive edilmiş hücre sıralama (FACS) sıralama yoluyla ilgi etiketli protein ile hücreleri toplayın.<ol>
<li>Hücreleri FACS sıralamaya hazırlamak için, onları deneyin ve fosfat tamponlu salin (PBS) ile yeniden biriktirin.</li>
		<li>İki zenginleştirici FACS sıralama turunda ebeveyn hücre çizgilerinin arka plan düzeyinin üzerinde mNeonGreen2 floresanlı hücreleri toplayın. NOT: Burada açıklanan CRISPR/Cas9 düzenlemeli hücre çizgilerini oluşturmak için zaman çizelgesi 1-2 ay arasında. Diğer araştırma laboratuvarlarının sonuçları yeniden üretebilmesi için tüm hücre hatları talep üzerine halka açık hale getirilir.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. PC9 ve B2B hücrelerinin bakımı
<ol><li>37 °C'de %5 CO2 ile nemlendirilmiş doku kültürü inkübatörlerinde her iki hücre hattını da koruyun.</li>
	<li>Kültür 106 endojen olarak etiketlenmiş PC9 ve Beas2B hücreleri 75 cm2</li><li><li><li></ol><ol><li><ol><li></li><li></li><li></li><li></li></ol></li><li><ol><li><li><li></li><li></li><li></li><li></li><li></li><li></li><li></li><li></li></ol></li><li><ol><li></li><li></li><li></li><li><li></li></ol></li></ol><ol><li><li><li><li> </li><li><li><li><li><li><li></ol><ol><li><ol><li><li><li><li><li><li><li><li><li><li></ol></li><li><ol><li><li><li><li><li></li><li><li><li></ol></li></ol><ol><li><ol><li></li><li><li><li><li><li><li></ol></li><li><ol><li></li><li><ol><li></li></ol></li><li><li></li><li></li></ol></li><li><ol><li></li><li></li><li></li><li></li></ol></li><li><ol><li></li><li></li><li></li><li></li><li></li></ol></li><li><ol><li></li><li></li><li><li><li></li><li></li><li></li><li></ol></li></ol><ol><li><ol><li></li><li></li><li></li><li></li><li></li><li></li><li></li><li> <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/62934/62934eq01.jpg"> <img alt="Equation 2" src="/files/ftp_upload/62934/62934eq02.jpg"> <img alt="Equation 3" src="/files/ftp_upload/62934/62934eq03.jpg"> </li><li></li></ol></li></ol><ol><li><ol><li></li><li><li></li><li><li><li></li><li></li><li></li><li></li><li><li></li><li></li><li></li><li></li><li></li></ol></li><li><ol><li><li><li><li><li></li><li></li><li></li><li></li><li></li><li></li><li></li></ol></li><li><ol><li><li></li><li></li><li> </li></ol></li></ol>

<ol><li>Werley, C., Boccardo, S., Rigamonti, A., Hansson, E., Cohen, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiplexed+optical+sensors+in+arrayed+islands+of+cells+for+multimodal+recordings+of+cellular+physiology%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Multiplexed optical sensors in arrayed islands of cells for multimodal recordings of cellular physiology.</a> Nature Communications. 11 (1), 3881(2020).</li>
<li>Yang, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epi-illumination+SPIM+for+volumetric+imaging+with+high+spatial-temporal+resolution%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Epi-illumination SPIM for volumetric imaging with high spatial-temporal resolution.</a> Nature Methods. 16 (6), 501-504 (2019).</li>
<li>Saraswathibhatla, A., Galles, E. E., Notbohm, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spatiotemporal+force+and+motion+in+collective+cell+migration%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Data%22%5BJournal%5D)">Spatiotemporal force and motion in collective cell migration.</a> Scientific Data. 7 (1), 197(2020).</li>
<li>Saraswathibhatla, A., Henkes, S., Galles, E. E., Sknepnek, R., Notbohm, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Coordinated+tractions+control+the+size+of+a+collectively+moving+pack+in+a+cell+monolayer%5BTitle%5D)+AND+%22Extreme+Mechanics+Letters%22%5BJournal%5D)">Coordinated tractions control the size of a collectively moving pack in a cell monolayer.</a> Extreme Mechanics Letters. 48, 101438(2021).</li>
<li>Wang, W., Kim, C. K., Ting, A. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+tools+for+imaging+and+recording+neuronal+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Chemical+Biology%22%5BJournal%5D)">Molecular tools for imaging and recording neuronal activity.</a> Nature Chemical Biology. 15 (2), 101-110 (2019).</li>
<li>Eliceiri, K. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biological+imaging+software+tools%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Biological imaging software tools.</a> Nature Methods. 9 (7), 697-710 (2012).</li>
<li>Carpenter, A. E., Kamentsky, L., Eliceiri, K. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+call+for+bioimaging+software+usability%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">A call for bioimaging software usability.</a> Nature Methods. 9 (7), 666-670 (2012).</li>
<li>Skylaki, S., Hilsenbeck, O., Schroeder, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Challenges+in+long-term+imaging+and+quantification+of+single-cell+dynamics%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Challenges in long-term imaging and quantification of single-cell dynamics.</a> Nature Biotechnology. 34 (11), 1137-1144 (2016).</li>
<li>Lin, M. Z., Schnitzer, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetically+encoded+indicators+of+neuronal+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Genetically encoded indicators of neuronal activity.</a> Nature Neuroscience. 19 (9), 1142-1153 (2016).</li>
<li>Luo, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Automatic+multi-functional+integration+program+%28AMFIP%29+towards+all-optical+mechanobiology+interrogation%5BTitle%5D)+AND+%22bioRxiv%22%5BJournal%5D)">Automatic multi-functional integration program (AMFIP) towards all-optical mechanobiology interrogation.</a> bioRxiv. , (2021).</li>
<li>Edelstein, A., Amodaj, N., Hoover, K., Vale, R., Stuurman, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Computer+control+of+microscopes+using+manager%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Protocols+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Computer control of microscopes using manager.</a> Current Protocols in Molecular Biology. 92 (1), 14-20 (2010).</li>
<li>Tulpule, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Kinase-mediated+RAS+signaling+via+membraneless+cytoplasmic+protein+granules%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Kinase-mediated RAS signaling via membraneless cytoplasmic protein granules.</a> Cell. 184 (10), 2649-2664 (2021).</li>
<li>Tang, X., Tofangchi, A., Anand, S. V., Saif, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+cell+traction+force+microscopy+to+study+multi-cellular+system%5BTitle%5D)+AND+%22PLOS+Computational+Biology%22%5BJournal%5D)">A novel cell traction force microscopy to study multi-cellular system.</a> PLOS Computational Biology. 10 (6), 1003631(2014).</li>
<li>Tang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanical+force+affects+expression+of+an+in+vitro+metastasis-like+phenotype+in+HCT-8+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Journal%22%5BJournal%5D)">Mechanical force affects expression of an in vitro metastasis-like phenotype in HCT-8 cells.</a> Biophysical Journal. 99 (8), 2460-2469 (2010).</li>
<li>Guimarães, C. F., Gasperini, L., Marques, A. P., Reis, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+stiffness+of+living+tissues+and+its+implications+for+tissue+engineering%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Materials%22%5BJournal%5D)">The stiffness of living tissues and its implications for tissue engineering.</a> Nature Reviews Materials. 5, 351-370 (2020).</li>
<li>Phelps, E. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Maleimide+cross-linked+bioactive+PEG+hydrogel+exhibits+improved+reaction+kinetics+and+cross-linking+for+cell+encapsulation+and+in+situ+delivery%5BTitle%5D)+AND+%22Advanced+Materials%22%5BJournal%5D)">Maleimide cross-linked bioactive PEG hydrogel exhibits improved reaction kinetics and cross-linking for cell encapsulation and in situ delivery.</a> Advanced Materials. 24 (1), 64-70 (2012).</li>
<li>Bajaj, P., Tang, X., Saif, T. A., Bashir, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stiffness+of+the+substrate+influences+the+phenotype+of+embryonic+chicken+cardiac+myocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biomedical+Materials+Research.+Part+A%22%5BJournal%5D)">Stiffness of the substrate influences the phenotype of embryonic chicken cardiac myocytes.</a> Journal of Biomedical Materials Research. Part A. 95 (4), 1261-1269 (2010).</li>
<li>Temples, M. N., Adjei, I. M., Nimocks, P. M., Djeu, J., Sharma, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engineered+three-dimensional+tumor+models+to+study+natural+killer+cell+suppression%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Biomaterials+Science+%26+Engineering%22%5BJournal%5D)">Engineered three-dimensional tumor models to study natural killer cell suppression.</a> ACS Biomaterials Science & Engineering. 6 (7), 4179-4199 (2020).</li>
<li>Feng, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improved+split+fluorescent+proteins+for+endogenous+protein+labeling%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Improved split fluorescent proteins for endogenous protein labeling.</a> Nature Communications. 8, 370(2017).</li>
<li>Guan, J., Liu, H., Shi, X., Feng, S., Huang, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tracking+multiple+genomic+elements+using+correlative+CRISPR+imaging+and+sequential+DNA+FISH%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Journal%22%5BJournal%5D)">Tracking multiple genomic elements using correlative CRISPR imaging and sequential DNA FISH.</a> Biophysical Journal. 112 (6), 1077-1084 (2017).</li>
<li>Micro-Manager. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://micro-manager.org/wiki/NikonTi2">https://micro-manager.org/wiki/NikonTi2</a> (2021).</li>
<li>Schindelin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fiji%3A+An+open-source+platform+for+biological-image+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Fiji: An open-source platform for biological-image analysis.</a> Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).</li>
<li>Martiel, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measurement+of+cell+traction+forces+with+ImageJ%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Measurement of cell traction forces with ImageJ.</a> Methods in Cell Biology. 125, 269-287 (2015).</li>
<li>Okumurai, I. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((On+the+generalization+of+Cerruti%27s+problem+in+an+elastic+half-space%5BTitle%5D)+AND+%22Doboku+Gakkai+Ronbunshu%22%5BJournal%5D)">On the generalization of Cerruti's problem in an elastic half-space.</a> Doboku Gakkai Ronbunshu. 1995, 1-10 (1995).</li>
<li>Piccolo, S., Dupont, S., Cordenonsi, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+biology+of+YAP%2FTAZ%3A+hippo+signaling+and+beyond%5BTitle%5D)+AND+%22Physiological+Reviews%22%5BJournal%5D)">The biology of YAP/TAZ: hippo signaling and beyond.</a> Physiological Reviews. 94 (4), 1287-1312 (2014).</li>
<li>Hong, W. W., Guan, K. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+YAP+and+TAZ+transcription+co-activators%3A+Key+downstream+effectors+of+the+mammalian+Hippo+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22Seminars+in+Cell+and+Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">The YAP and TAZ transcription co-activators: Key downstream effectors of the mammalian Hippo pathway.</a> Seminars in Cell and Developmental Biology. 23 (7), 785-793 (2012).</li>
<li>Zanconato, F., Cordenonsi, M., Piccolo, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((YAP%2FTAZ+at+the+roots+of+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Cell%22%5BJournal%5D)">YAP/TAZ at the roots of cancer.</a> Cancer Cell. 29 (6), 783-803 (2016).</li>
<li>Wang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Overexpression+of+yes-associated+protein+contributes+to+progression+and+poor+prognosis+of+non-small-cell+lung+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Science%22%5BJournal%5D)">Overexpression of yes-associated protein contributes to progression and poor prognosis of non-small-cell lung cancer.</a> Cancer Science. 101 (5), 1279-1285 (2010).</li>
<li>Li, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhibition+of+YAP+suppresses+CML+cell+proliferation+and+enhances+efficacy+of+imatinib+in+vitro+and+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Experimental+%26+Clinical+Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">Inhibition of YAP suppresses CML cell proliferation and enhances efficacy of imatinib in vitro and in vivo.</a> Journal of Experimental & Clinical Cancer Research. 35 (1), 134(2016).</li>
<li>Tang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+mechanically-induced+colon+cancer+cell+population+shows+increased+metastatic+potential%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Cancer%22%5BJournal%5D)">A mechanically-induced colon cancer cell population shows increased metastatic potential.</a> Molecular Cancer. 13, 131(2014).</li>
<li>Panciera, T., Azzolin, L., Cordenonsi, M., Piccolo, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanobiology+of+YAP+and+TAZ+in+physiology+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Molecular+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Mechanobiology of YAP and TAZ in physiology and disease.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 18 (12), 758-770 (2017).</li>
<li>Yuan, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Yes-associated+protein+%28YAP%29+functions+as+a+tumor+suppressor+in+breast%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Death+and+Differentiation%22%5BJournal%5D)">Yes-associated protein (YAP) functions as a tumor suppressor in breast.</a> Cell Death and Differentiation. 15 (11), 1752-1759 (2008).</li>
<li>Koushki, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lamin+A+redistribution+mediated+by+nuclear+deformation+determines+dynamic+localization+of+YAP%5BTitle%5D)+AND+%22bioRxiv%22%5BJournal%5D)">Lamin A redistribution mediated by nuclear deformation determines dynamic localization of YAP.</a> bioRxiv. , (2020).</li>
<li>Chang, S. S., Rape, A. D., Wong, S. A., Guo, W. H., Wang, Y. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Migration+regulates+cellular+mechanical+states%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Biology+of+the+Cell%22%5BJournal%5D)">Migration regulates cellular mechanical states.</a> Molecular Biology of the Cell. 30 (26), 3104-3111 (2019).</li>
<li>Lee, J., Abdeen, A. A., Tang, X., Saif, T. A., Kilian, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Geometric+guidance+of+integrin+mediated+traction+stress+during+stem+cell+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Geometric guidance of integrin mediated traction stress during stem cell differentiation.</a> Biomaterials. 69, 174-183 (2015).</li>
<li>Lee, J., Abdeen, A., Tang, X., Saif, T. A., Kilian, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Matrix+directed+adipogenesis+and+neurogenesis+of+mesenchymal+stem+cells+derived+from+adipose+tissue+and+bone+marrow%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Biomaterialia%22%5BJournal%5D)">Matrix directed adipogenesis and neurogenesis of mesenchymal stem cells derived from adipose tissue and bone marrow.</a> Acta Biomaterialia. 42, 46-55 (2016).</li>
<li>Tang, X., Bajaj, P., Bashir, R., Saif, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((How+far+cardiac+cells+can+see+each+other+mechanically%5BTitle%5D)+AND+%22Soft+Matter%22%5BJournal%5D)">How far cardiac cells can see each other mechanically.</a> Soft Matter. 7 (13), 6151-6158 (2011).</li>
<li>Dembo, M., Wang, Y. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stresses+at+the+cell-to-substrate+interface+during+locomotion+of+fibroblasts%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Journal%22%5BJournal%5D)">Stresses at the cell-to-substrate interface during locomotion of fibroblasts.</a> Biophysical Journal. 76 (4), 2307-2316 (1999).</li>
<li>Rape, A., Guo, W. H., Wang, Y. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+regulation+of+traction+force+in+relation+to+cell+shape+and+focal+adhesions%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">The regulation of traction force in relation to cell shape and focal adhesions.</a> Biomaterials. 32 (8), 2043-2051 (2011).</li>
<li>Shiu, J. Y., Aires, L., Lin, Z., Vogel, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nanopillar+force+measurements+reveal+actin-cap-mediated+YAP+mechanotransduction%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Nanopillar force measurements reveal actin-cap-mediated YAP mechanotransduction.</a> Nature Cell Biology. 20 (3), 262-271 (2018).</li>
<li>Fracchia, A., Asraf, T., Salmon-Divon, M., Gerlitz, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Increased+lamin+B1+levels+promote+cell+migration+by+altering+perinuclear+actin+organization%5BTitle%5D)+AND+%22Cells%22%5BJournal%5D)">Increased lamin B1 levels promote cell migration by altering perinuclear actin organization.</a> Cells. 9 (10), 2161(2020).</li>
<li>Ramdas, N. M., Shivashankar, G. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cytoskeletal+control+of+nuclear+morphology+and+chromatin+o1rganization%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Cytoskeletal control of nuclear morphology and chromatin o1rganization.</a> Journal of Molecular Biology. 427 (3), 695-706 (2015).</li>
<li>Khatau, S. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+perinuclear+actin+cap+regulates+nuclear+shape%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">A perinuclear actin cap regulates nuclear shape.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (45), 19017-19022 (2009).</li>
<li>Kim, D. H., Cho, S., Wirtz, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tight+coupling+between+nucleus+and+cell+migration+through+the+perinuclear+actin+cap%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Science%22%5BJournal%5D)">Tight coupling between nucleus and cell migration through the perinuclear actin cap.</a> Journal of Cell Science. 127 (11), 2528-2541 (2014).</li>
</ol>

Beyan edecek çıkar çatışması yoktur.

Görüntüleme işlemi (adım 6.3), floresan görüntülerin geçerli nicelik sonuçları verecek kadar kaliteli olmasını sağlamak için kritik öneme sahiptir. Floresan protein veya boncukların z-stack görüntüleri, numunenin yayıldığı tüm Z konumları için odak içi görüntüleri içerecek kadar büyük bir z aralığına sahip olmalıdır. Bir diğer kritik adım, hücreleri çözdükten sonra floresan boncukların referans görüntülerini toplamaktır (adım 6.5). 6.3. adımda referans görüntülerinin aynı pozisyonlarda alınması gerektiğinden, Petri kabı, çevre odası ve mikroskop arasında göreceli bir yer değiştirme indüklenmemelidir. Çözünme adımını gerçekleştiren araştırmacılar, Petri kabının kapağını çıkarmaya ve uygulanan mekanik pertürbasyonun kabın çevre odasındaki yerini değiştirecek kadar büyük olmadığından emin olmaya dikkat etmelidir.
Denemeler sırasında oluşabilecek bazı hataları gidermek için çözümler aşağıda verilmiştir. 6.4 adımında Enter'u tıklattıktan sonra hiçbir makro etkinleştirilmezse, bunun nedeni büyük olasılıkla ekranın sol alt alanının Öğe olmayan bir pencere tarafından işgal edilmiş olmasıdır. Böyle bir durumda, makroların Öğeler'de etkinleştirilebilmesi için pencerenin sol alt alanının temizlenmesi gerekir. Bir başka yaygın hata, parlak alan görüntülerinin siyah görünmesidir. Bu sorun, floresan ve parlak alan görüntülerinin edinimi arasındaki yetersiz zaman aralığından kaynaklanır. Floresan görüntüleme süresi sayımındaki hafif gecikmeler zamanla birikebilir ve önemli gecikmelere neden olabilir ve parlak alan görüntülemesini engelleyebilir. Bir çözüm, tüm pozisyonların bir görüntüleme döngüsünün süresini, ardışık hareketlerin başlangıcı arasındaki zaman aralığından daha az (eşit olmayacak) olacak şekilde ayarlamaktır. Bu işlem zaman sayımını yeniler ve her görüntüleme döngüsünün başındaki kümülatif hatayı ortadan kaldırır.
Bu tamamen optik sorgulama teknolojisi (1) Nikon dahil ancak bunlarla sınırlı olmamak üzere çok çeşitli donanım/yazılımları, (2) jelatin, PEG, Matrigel ve kollajen I jelleri de dahil olmak üzere çeşitli doğrulanmış hidrojel sistemleri ve (3) araştırmacıların farklı ihtiyaçlarına dayalı programlanabilir özelleştirmeyi destekler. Ancak, alt düzey kontrol işlevlerinden herhangi biri ticari bir mikroskoptan kullanılamıyorsa, AMFIP kullanılarak işlevlerin özelleştirilmesi zorlaşır. Bu tekniğin bir diğer sınırlaması, numunenin hem XY hem de odak (Z) düzlemlerinde uzamsal sürüklenmesidir. Bu sınırlama görüntülerin işlenmesinden sonra aşılabilir, ancak örneklerin gerçek zamanlı sürüklenmesini düzeltmek için otomatik odaklama işlevini geliştirmek önemlidir. Bu iyileştirme, görüntüleme işleminin verimini artıracak ve deneyler sırasında sürüklenmenin neden olduğu olası hatayı azaltacaktır.
YAP gibi mekanotransdükerler, umut verici kanser tedavilerinin geliştirilmesi için yeni terapötik hedefler olarak hizmet edebilir25,26,27. Ortaya çıkan veriler, YAP'ın kanser hücrelerinin çoğalmasını ve istilasını desteklediğini göstermektedir. Sitoplazmadan çekirdeğe mekanik kaynaklı YAP translokasyonu hücre göçü, çoğalma, istila ve apoptoz ile ilgili genlerin transkripsiyonunu aktive ederek anormal hücre davranışlarına yol açar28,29,30,31. Bu çalışma, iki tipik insan akciğer kanseri ve normal hücre hattında YAP N/C oranı ve hücre mekaniğinin potansiyel korelasyonunu araştırmayı amaçlamaktadır. 10 saat hücre yayılma döneminde PC9 hücreleri çekirdek ve sitoplazmada benzer YAP konsantrasyonları gösterir (Şekil 3D ve Şekil 5A). B2B hücreleri çekirdekte sitoplazmadan daha yüksek yap konsantrasyonu gösterir (Şekil 3C ve Şekil 5A). Erken yayılma aşamasında bulunan bu ilişki, çekirdekteki YAP konsantrasyonunun normal ve kanser hücreleri arasında karşılaştırıldığı yayınlanan bulguların çoğundan farklıdır. Erken yayılma aşamasında olmasa da, yayınlanan bulguların çoğu YAP'ın normal hücrelerin çekirdeğine göre kanser hücrelerinin çekirdeğinde daha yoğun olduğunu göstermektedir27,28. Meme kanseri üzerine yapılan sadece bir çalışmada, YAP'ın sitoplazmda daha yoğun olduğunu gösteren bir istisna32 bildirilmiştir, bu da akciğer kanseri PC9 hücrelerinde yapılan mevcut gözlemlerimize uygundur. Yazarların bilgisine göre, bu çalışma bir insan akciğer kanseri hücre hattında daha düşük bir YAP N / C oranı gösteren ilk çalışmadır. Yazarlar, PC9 hücrelerinde stabil bir YAP N/C oranının nedeninin hücre/çekirdek yayılma alanındaki düşük varyasyondan ve erken yayılma aşamasında PC9 hücrelerindeki çekiş gücünden kaynaklanabileceğini vardır. PC9 ve B2B hücrelerde düşük YAP N/C oranının temel moleküler mekanizmalarının diseksiyonu devam etmektedir.
Yayılmanın ilk 10 saati boyunca, bu iki hücre çizgisi YAP YOK oranı, hücre çekişi ve yayılma alanı arasında belirgin bir ilişki gösterir (Şekil 5). B2B hücreleri için, daha yüksek bir YAP N/C oranı, diğer normal hücrelerin bildirilen verileriyle tutarlı olan daha yüksek bir hücre ve çekirdek yayılma alanı (Şekil 6A,B) ile ilişkilidir33. İlginçtir ki, bu ilişkinin gelişimsel eğilimi genellikle kaydedilen tüm B2B hücrelerinde bulunsa da, bu ilişkinin iki farklı derecesi (yüksek ve düşük) bulunur. Aynı anda yayılan ve göç eden B2B hücreler, daha yüksek YAP N/C oranına sahip daha düşük çekiş ve daha yüksek hücre ve çekirdek yayılma alanı gösterir (2,05 ± 0,32). Yayılan ve aynı yerde kalan B2B hücreleri için daha yüksek çekiş ve daha düşük yap N/C oranına sahip alt hücre ve çekirdek yayılma alanı gösterirler (1.74 ± 0.21). Bu iki derecelik ilişkiler, çatallanmış dağınık veri gruplarında gösterilmiştir (Şekil 6C,D). Literatürde bildirildiği gibi, embriyonik fibroblast NIH 3T3 hücreleri gibi sabit normal hücreler, göçmen hücrelerden daha yüksek çekiş gücüne sahiptir34. Bu makalede bildirilen veriler, yayılan ve göç etmeyen B2B hücrelerinin, B2B hücrelerinin yayılmasından ve taşınmasından daha yüksek çekiş uyguladığını, muhtemelen göç etmeyen hücrelerin substrat üzerinde stabilize olması için yüksek çekiş gerektiğini göstermektedir.
Ek olarak, bu veriler sabit normal B2B hücrelerinin daha yüksek bir peri-nükleer kuvvet ürettiğini gösterirken, diğer araştırmacılar tarafından yapılan önceki araştırmalar sabit hücrelerin çevresinde üretilen sadece daha yüksek hücre çekişi bildirdi34,35,36,37. Yazarlar, deneylerdeki içsel göç eğilimindeki farkın bu çelişkili sonuçlara neden olabileceğini düşünüyor. Yayınlanan deneylerde, tek hücrelerin yayılmasını sınırlamak ve göçü engellemek için kare şekilli mikropatterning kullanılmıştır; hücrelerin geçiş eğilimi olup olmadığı bilinmemektedir. Göçmen hücreler genellikle hücrelerin çevresinde yüksek çekiş kuvveti gösterdiğinden38, göç etme eğilimi olan hücrelerin göçleri kısıtlanmış olsa bile hala yüksek çevresel çekişi sürdürmeleri muhtemeldir. Bu çalışmada, sabit hücreler herhangi bir mikropattern tarafından kısıtlanmamaktadır, ancak hücrelerin göç etmeyen durumlarını koruma eğiliminde olduklarını gösteren göç etmezler. Diğer bir olasılık, mikropattern tarafından tanımlanan hücre şeklinin odak yapışıklıklarının ve çekiş kuvvetlerinin dağılımını etkileyebileceğidir39. Bu çalışmadaki sonuçlar herhangi bir mikropatterning olmadan oluşturulmuş ve sabit hücrelerin orijinal şekillerindeki kuvvet dağılımını temsil eder.
Yazarların bilgisine göre, bugüne kadar sadece bir yayın, çekirdek40'a yayılan akrin kapağının neden olabileceği normal hücrelerde (fare embriyonik fibroblastları) peri-nükleer kuvvetlerin bulunmasını özellikle bildirdi. YAP sitoplazma-çekirdek translokasyonu peri-nükleer kuvvet40'taki artışla ilişkilidir. İlgili literatürün kapsamlı bir araştırması, peri-nükleer kuvveti veya kanser hücrelerindeki akran kapağını bildiren herhangi bir yayın vermedi. Melanom kanser hücreleri üzerinde yapılan dolaylı bir çalışma, aktin jantının (etrafında bulunan ancak çekirdeği kapsamayan başka bir peri-nükleer aktin organizasyonu) hücre göç oranlarını düşürdüğünü göstermiştir41, dolaylı olarak bir peri-nükleer kuvvetin varlığını düşündürmektedir. Ancak, doğrudan deneysel veri bildirilmemektedir. Bu çalışmada, yazarlar hem PC9 hem de B2B hücrelerinin peri-nükleer yer değiştirme ve çekiş gösterdiğini buldular. Peri-nükleer kuvvetlerin üretim mekanizmaları ve etkileri tartışmalı olmaya devam ediyor. Normal hücrelerde, aktin kapağının çekirdek morfolojisi ve kromatin organizasyonunun düzenlenmesinde rol oynadığı bildirilmiştir42, odak yapışıklıklarından mekanik sinyallerin nükleoskeleton ve sitoskeleton (LINC) kompleksinin bağlayıcıları aracılığıyla çekirdeğe iletilmesi43 ve hücre göçlerinin düzenlenmesi44. Lamin Klima, akin kapağının oluşumu ve bozulması ile ilgilidir40,41,42,43,44. Bununla birlikte, aktiin kapağının peri-nükleer bir güç ürettiğini iddia eden rapor, actin rim40'ın potansiyel rolünü dikkate almadı. Kanser hücrelerinde, Lamin A'nın aşırı ifade etmesi bir akin jantı oluşumunu kolaylaştırır ve kanser hücresi göçini kısıtlar. Lamin B'nin aşırı ifade etmesi akredin jant oluşumunu azaltır ve göçü teşvik eder. Peri-nükleer aktivin örgütünün varlığı ve Lamin A'nın etkisiyle peri-nükleer gücü bu sürece dahil olabilir. Bununla birlikte, bu çalışmanın sonuçları, ölçülen peri-nükleer kuvvetlere veya akin kapağının davranışına dair herhangi bir kanıt göstermedi. Bu nedenle, bu çalışmada PC9 hücrelerinde peri-nükleer kuvvetlerin keşfi, akciğer kanseri hücrelerindeki peri-nükleer kuvvetleri ve yer değiştirmeleri gösteren ilk rapordur. Yazarlar şu anda CRISPR/Cas9 tarafından tasarlanmış PC9 ve B2B hücrelerinde peri-nükleer kuvvetlerin moleküler mekanizmalarını ve işlevlerini araştırmamaktadır.
Bu makalede gösterilen tüm optik mekanobiyoloji sorgulamasının ötesinde, entegre çok fonksiyonlu sistem, canlı sistemlerdeki sayısız diğer temel fizyolojik ve patobiyolojik sinyalleri optik olarak araştırmak için uygulanabilir. Örneğin, yazarların laboratuvarı son zamanlarda üç ışık duyarlı membran proteinini birlikte ifade eden birden fazla saptan transdüklenmiş insan kanseri hücre hattı kurdu: membran voltaj göstergesi QuasAr2 (heyecan: 640 nm; emisyon: 660 nm-740 nm), membran voltaj depolarizörü CheRiff (heyecan: 488 nm) ve membran voltajı hiperpolarizatör eNpHR3 (heyecan: 590 nm). Bu üç fonksiyonel protein spektrum-ortogonal lazer hatları ile çapraz konuşma içermeyen bir şekilde aktive edilebilir ve membran elektrofizyolojisinin tüm optik iki yönlü sinyal iletişimini (okuma ve kontrol) sağlar. Entegre bir opto-elektronik sistemi ve manuel bir yama kelepçesi kullanan yazarlar, tek insan kanser hücrelerinde ve çok hücreli tümör sferoidlerinde membran voltajının (Vm) tüm optik kontrolünü ve okunmasını doğruladılar. Tüm optik elektrofizyoloji sorgulaması, kanser hücrelerinde daha önce erişilemeyen biyoelektrikliğin ayrıntılı olarak araştırılması olasılığını açar ve bu da tümör biyolojisini yeni bir eksenden ilerletmeye yardımcı olabilir.

Bu yöntemin genel amacı, tüm optik çok fonksiyonlu görüntüleme ve canlı hücrelerin analizini sağlamaktır. Çok fonksiyonlu optoelektronik cihazların otomatik koordinasyonunu sağlayan hepsi bir arada görüntüleme programı, emek yoğun ve hataya açık manuel işlemleri azaltacaktır ve araştırmacıların uzun süreli canlı hücre görüntülemesi yapması için gereklidir1,2,3,4. Bununla birlikte, biyomedikal araştırma topluluğundaki mevcut kamu programlarının çoğu ya sadece sınırlı optoelektronik cihazlar için geçerlidir ya da farklı ekipmanların koordinasyonu için ek donanım gerektirir5,6,7,8,9. Son zamanlarda, çok kanallı ve hızlandırılmış görüntülemeyi mümkün kılacak "Otomatik Çok fonksiyonlu Entegrasyon Programı (AMFIP)" başlıklı açık kaynaklı ve yazılım tabanlı bir program geliştirilmiştir. Java diline ve μManager11,12'lik Uygulama Programlama Arabirimi'ne (API) dayanan AMFIP, Nikon'dan gelenler de dahil ancak bunlarla sınırlı olmamak üzere birden fazla optoelektronik donanım ve yazılım platformunun yazılım tabanlı iletişimlerini gerçekleştirmek için özelleştirilmiş Java komut dosyaları yürüten bir eklenti olarak geliştirilmiştir. AMFIP'nin kurulması, hücre davranışlarının programlanabilir ve çok fonksiyonlu sorgulanma olasılığını açar. Bu makalede entegre bir deneysel ve hesaplama sistemi geliştirilmiştir ve AMFIP ile dijital görüntüleme analizi ve hücre çekiş kuvveti mikroskopisini birleştirir. Sistem, CRISPR/Cas9 tarafından tasarlanmış insan normal B2B (Şekil 1) ve akciğer kanseri PC9 (Şekil 2) hücre hatlarında belirgin YAP mekanobiyolojisinin aydınlatıcısını sağlar. Sistem, bilim topluluğuna, her görüntüleme sistemi için mevcut olmayan ve/veya uyumlu olabilecek ek kontrol cihazları satın alma talebini önleyen kapsamlı bir çözüm sunar.
Bu makalede sunulan protokoller, (1) mNEonGreen2 etiketli YAP'ı ifade eden crispr/cas9 tarafından tasarlanmış hücre hatları için otomatik uzun süreli görüntüleme yapmak için AMFIP'nin nasıl uygulanacağını tanıtır; ve (2) Floresan yoğunluklarına (Şekil 3 ve Şekil 4), hücresel yer değiştirme alanına (Şekil 1C ve Şekil 2C) ve hücresel çekiş alanına (Şekil 1D ve Şekil 2D) göre YAP nükleer/sitoplazma (N/C) oranının nicel analizi için Fiji ImageJ, MATLAB ve Origin'i birleştirir. ). Sonuçlar, (1) fizyolojik olarak ilgili mekanik sertliğe sahip substratlara yayılan hücrenin ilk 10 h'si sırasında13,14,15,16,17,18, tek B2B hücrelerin YAP N/C oranının tek PC9 hücrelerine kıyasla daha belirgin zamana bağlı değişim ve dalgalanma gösterdiğini göstermektedir (Şekil 5 ve Şekil 6 ); ve (2) PC9 kanser hücreleri peri-nükleer bölgelerinde gözle görülür bir çekiş oluşturur (Şekil 7). Bu protokolde açıklanan entegre sistem ve metodolojiler, belirli hücre türlerini ve optogenetik molekülleri aşmaktadır. Araştırmacılar, özel canlı hücre sorgulama deneylerini özelleştirmek ve hücre fizyolojisi ve patolojisi bağlamında çok yönlü sinyal dinamiklerini aydınlatmak için protokolleri uygulayabilirler.

<table><tbody><tr><td>(3-Aminopropil) trietoksisilan</td><td>Sigma-aldrich</td><td>440140</td><td></td></tr><tr><td>% 0.05 Tripsin</td><td>Corning</td><td>25-051-CI</td><td></td></tr><tr><td>75 cm 2 şişesi</td><td>Corning</td><td>430641U</td><td></td></tr><tr><td>8 Tezgah Üstü Santrifüj</td><td>Termo</td><td>75007210</td><td></td></tr><tr><td>A1R konfokal sistem</td><td>Nikon</td><td>HD25</td><td></td></tr><tr><td>Asetik asit</td><td>Sigma-aldrich</td><td>695092</td><td>buzul, ACS reaktifi, & ge; % 99,7</td></tr> <tr><td>BEAS-2B (B2B) hücreleri</td><td>Sigma-aldrich</td><td>95102433</td><td>akciğer dokusundan insan epitel hücreleri</td></tr><tr><td>Karboksilat Modifiye Mikroküreler</td><td>Invitrogen</td><td>F8797</td><td></td></tr><tr><td>Kültür ortamı (RPMI-1640)</td><td>Gibco</td><td>11875093</td><td></td></tr><tr><td>Masaüstü Bilgisayar</td><td>Dell</td><td>2018</td>, <td>Windows 10 işletim sistemli</td></tr><tr><td>Çevre odası TIZB</td><td>Tokai Hit</td><td>TIZB</td><td></td></tr><tr><td>Fetal sığır serumu (FBS)</td><td>Gibco</td><td>26140</td><td></td></tr><tr><td>Fibronektin İnsan Proteini, Plazma</td><td>Gibco</td><td>33016015</td><td></td></tr><tr><td>Fiji ImageJ</td><td>Ulusal Sağlık Enstitüleri ve Optik ve Hesaplamalı Enstrümantasyon Laboratuvarı</td><td>1.53k</td><td></td></tr><tr><td>Cam tabanlı petri kabı</td><td>MatTek</td><td>P35G-1.5-14-C</td><td></td></tr><tr><td>HEPES tamponlu tuzlu</td><td>su Sigma-aldrich</td><td>51558</td><td></td></tr><tr><td>Hidrazin hidrat çözeltisi</td><td>Sigma-aldrich</td><td>53847</td><td></td></tr><tr><td>IntelliJ IDEA</td><td>JetBrains</td><td>2020</td><td>Java geliştirme platformu</td></tr><tr><td>Java Geliştirme Kiti</td><td>Oracle</td><td>14.0</td><td></td></tr><tr><td>Kimwipe</td><td>Kimtech Science</td><td>3066-05</td><td></td></tr><tr><td>MATLAB</td><td>MathWorks</td><td>2020b</td><td></td></tr><tr><td>Tek renkli&nbsp; Kamera</td><td>FLIR</td><td>BFS-U3-70S7M-C</td><td></td></tr><tr><td>MycoAlert Mikoplazma Tespit Kiti</td><td>Lonza</td><td>LT07-218</td><td></td></tr><tr><td>N, N & prime;-Metilenbisakrilamid çözeltisi</td><td>Sigma-aldrich</td><td>M1533</td><td></td></tr><tr><td>NIS-Elements yazılım platformu</td><td>Nikon</td><td>4.50</td><td>yazılım platformu</td></tr><tr><td>Origin</td><td>OriginLab</td><td>OriginPro 2017 (Learning Edition)</td> <td>veri analizi ve grafik yazılımı</td></tr><tr><td>Penisilin-streptomisin</td><td>Gibco</td><td>15140122</td><td></td></tr><tr><td>PC9 hücreleri</td><td>Sigma-aldrich</td><td>90071810</td><td>insan adenokarsinom hücreleri&nbsp; akciğer dokusundan</td></tr><tr><td>Fosfat tamponlu salin (PBS)</td><td>Gibco</td><td>10010023</td><td></td></tr><tr><td>Phusion Yüksek Sadakatli DNA Polimeraz</td><td>New England Biolabs</td><td>&nbsp; F-553S</td><td>yüksek kaliteli DNA polimeraz</td></tr><tr><td>Scotch bant Scotch</td><td></td><td></td><td>yapışkan bant</td></tr><tr><td>Sodyum dodesil sülfat çözeltisi</td><td>Sigma-aldrich</td><td>05030</td><td></td></tr><tr><td>Süper yapıştırıcı</td><td>Goril</td><td></td><td>siyanoakrilat tutkal</td></tr><tr><td>Ti2-E ters</td> mikroskop <td>Nikon</td><td>MEA54000</td><td></td></tr><tr><td>TI2-S-SE-E Enkoderli Motorlu Sahne</td><td>Nikon</td><td>MEC56120</td><td></td></tr><tr><td>&mu; Manager</td><td></td><td>sürüm 2.0 gama</td><td>açık kaynaklı mikroskopi yazılımı (https://micro-manager.org/)</td></tr></tbody></table>

Çok fonksiyonlu bir sistem kullanarak İnsan kanseri ve normal hücrelerde evet İlişkili proteinin tamamen optik mekanobiyoloji sorgulaması

All-optical Mechanobiology Interrogation of Yes-associated Protein in Human Cancer and Normal Cells using a Multi-functional System

Canlı hücrelerin uzun süreli çok fonksiyonlu görüntüleme ve analizi, çeşitli donanım ve yazılım platformlarının kolaylaştırılmış, işlevsel koordinasyonunu gerektirir. Bununla birlikte, farklı üreticiler tarafından üretilen çeşitli ekipmanların manuel kontrolü emek yoğun ve zaman alıcıdır ve elde edilen verilerin doğruluğunu, tekrarlanabilirliğini ve kalitesini potansiyel olarak azaltır. Bu nedenle, otomatik, çok işlevli ve uzun süreli görüntü alımını sağlayan ve çoğu floresan mikroskopi platformuyla uyumlu, hepsi bir arada ve kullanıcı tarafından programlanabilir bir sistem bilim camiasına fayda sağlayabilir. Bu makale, (1) otomatik çok kanallı görüntüleme alımını sağlayan "Otomatik Çok fonksiyonlu Entegrasyon Programı (AMFIP)" başlıklı ev yapımı bir yazılım programından ve (2) nicel görüntüleme analizi ve hücre çekiş hesaplama paketlerinden oluşan yeni bir entegre yazılım sisteminin kullanılmasının tam çalışma protokollerini tanıtır. 
Bu entegre sistem, CRISPR/Cas9 tarafından tasarlanmış insan normal hücrelerinde (B2B) ve akciğer kanseri hücrelerinde (PC9) mechano duyarlı Evet ilişkili proteinin (YAP) mekansal-zamansal dağılımı ile hücre yayılımı ve çekiş dahil hücre mekaniği arasındaki daha önce bilinmeyen ilişkiyi ortaya çıkarmak için uygulanmaktadır. Bu sistemin çok kanallı kontrol ve okuma yeteneğinden yararlanan sonuç şunları göstermektedir: (1) B2B normal hücreler ve PC9 kanser hücreleri, hücre yayma ve geçiş işlemleri sırasında YAP ekspresyonu, çekiş ve hücre dinamikleri arasında ayrı bir ilişki gösterir; ve (2) PC9 kanser hücreleri substratlara gözle görülür peri-nükleer kuvvetler uygular. Özetle, bu makale, YAP mekano duyarlılığını aydınlatmak için otomatik çok fonksiyonlu görüntüleme ve analiz sağlayan entegre bir kullanıcı programlanabilir sistemin nasıl kullanılabileceğine dair ayrıntılı bir adım adım protokol sürmektedir. Bu araçlar, hücre fizyolojisi ve patolojisi bağlamında çok yönlü sinyal dinamiklerinin ayrıntılı keşfine imkan açar.

Bu makalede, Otomatik çok kanallı görüntüleme ve mekanobiyolojik analizin Evet ilişkili proteinin (YAP) mekano duyarlılığını aydınlatmasını sağlayan entegre çok fonksiyonlu ve kullanıcı tarafından programlanabilir bir sistemin nasıl kullanılabileceğine dair ayrıntılı bir adım adım protokol sunulmaktadır.

Çok Fonksiyonlu Bir Sistem Kullanarak İnsan Kanseri ve Normal Hücrelerde Evet İlişkili Proteinin Tamamen Optik Mekanobiyoloji Sorgulaması

Long-term multi-functional imaging and analysis of live cells require streamlined, functional coordination of various hardware and software platforms. ...

Bu yöntem, çok yönlü bir biyolojik fenomenin moleküler mekanizmalarını göstermeye yardımcı olacaktır. Mekanobiyoloji, optik elektrofizyoloji ve otomatik canlı hücre görüntüleme tekniklerini kullanarak süper çözünürlüklü DNA/RNA protein görüntüleme gibi. Bu protokol otomatik, çok işlevli, yüksek aktarım hızı, kendi kendine sürüklenen düzeltme ve uzun vadeli görüntü alımını sağlar.NYCOM gibi floresan mikroskobik platformların çoğuyla uyumludur. Bu tekniği ilk kez deneyen herkes, başarılı bir deneme sağlamak için yalnızca protokolü kesinlikle takip etmek yerine her adımın işlevini anlamalıdır. Çevre odasını ters mikroskobun motorlu aşamasına yerleştirerek başlayın.CO2 akış hızını dakikada 160 mililitreye ayarlayın ve haznenin sıcaklığını ayarlayın. Daha sonra odanın banyosuna 40 mililitre arıtılmış su ekleyin. Cam tabanlı Petri kabını inkübatörden hücrelerle dışarı çıkar ve çevre odasına yerleştirin.Konfokal denetleyiciyi ve ters mikroskobu açın. Işık yolunu sağa doğru değiştirin. Mikro Yönetici'yi kullanarak takılan hücreleri gözlemleyin.Jel için yeterli hücre tutturulmuşsa, Petri kabını inkübatöre geri aktarın. Değilse, hücre inkübasyonuna B2B için 30 dakika, akciğer kanseri veya PC-9 hücreleri için 60 dakika daha devam edin. 2 küçük yapışkan bant parçası kesin ve dairesel deliğin etrafındaki hazneye yapıştırın.Daha sonra Petri kabının kaplayacağı bant alanına biraz yapışkan yapıştırıcı uygulayın. Petri kabını inkübatörden çıkar. Petri kabını yavaşça hazneye yerleştirin ve kabın tabanının tutkalla temas edelim.Yapıştırıcının Petri kabıyla tam temas etmesini ve katılaşması için Petri kabının kapağına 1 dakika bastırın. Tutkalın katılaştığından ve Petri kabının hareket etmediğine emin olmak için Petri kabını yatay olarak hafifçe itin. Sonra odanın kapağını kapatın.IntelliJ'i açın ve dosya elements_script.java 93. Bu değerin makronun çalışma süresinden ve bir görüş alanının konfokal görüntülemesi için kullanılan öğelerden daha büyük olduğundan emin olun. AMFIP IntelliJ projesini başlatmak için Çalıştır düğmesini tıklatın.Micro Manager'ın ana arabiriminde canlı ve çoklu deakquisition düğmesine tıklayın, ardından parlak alan görüntüleme için ters mikroskobun ışık yolunu sağa çevirin. 10 kez hedefe geçin ve LED ışığını % 5'te ayarlanan yoğunlukla açın TI2 panel elemanlarındaki ışık yolu mikroskop hedefine ve LED lamba düğmesine tıklayın. Petri kabındaki jelin doğru konumunu ve odak düzlemini bulmak için XY joystick'i ve Z düzleminin düğmesini ayarlayın.Jel bağlı birden fazla tek hücrenin uygun görüş alanlarını bulmak için 10 kez amacını kullanın. Çok boyutlu edinme penceresinde birden çok konum XY kutusunu işaretleyin. Konum listesini düzenle düğmesine tıklayın ve açılan sahne alanı konum listesi penceresini gözlemleyin.Hedefi 40 kez değiştirin, LED ışığının yoğunluğunu % 15'e çıkarın Görünüm alanlarını bulmak ve sahne konumu listesi penceresindeki işaretle düğmesine tıklayarak koordinatları kaydetmek için XY motorlu sahneyi yeniden düzenleyin. İstenen 6 ila 7 görüş alanını kaydedin. Çok boyutlu alım penceresindeki zaman noktası bölümünde T1'e görüntüleme alımının zaman aralığı bölümü olarak koordinatları ve giriş T1'i kaydetmek için sahne alanı konum listesi penceresindeki Farklı Kaydet düğmesini tıklatın.Öğeleri açın, konfokal görüntüleme için ışık yolunu sağa değiştirin ve LED ışığını kapatın. Ardından kilitlemeyi kaldır düğmesine tıklayın ve FITC kutusunu işaretleyerek YAP görüntüleme için FITC lazer kanalını açın. Tarama hızını 2 saniyede 1 kareye ayarladıktan sonra, bağlı hücrelerin Z konumunu hızlı bir şekilde bulmak için Z düzleminin düğmesini döndürün.Z yığını için alt ve üst sınırları kaydedin. Üst şeritteki makroyu tıklatın, makro açılır menüsünün altında makro düzenleyicisini seçin ve Z yığınının alt ve üst sınırlarını bir makro dosyasına girin. Boncukların odaklanmış Z konumunu bulmak ve kaydetmek için DAPI kutusunu işaretleyerek boncuk görüntüleme için DAPI lazer kanalını açın.Makro düzenleyicisine gidin ve kaydedilen değerleri makro dosyasına girin. AMFIP kullanarak motorlu sahneyi taşıma görevini ayarlamak için Mikro Yönetici'ye gidin, AMFIP'nin grafik kullanıcı arayüzünü açmak için eklenti otomasyonu tıklayın. Ardından, seçilen görünüm alanlarının tam sayısını elde etmek için nokta ekle'ye tıklayın veya nokta düğmelerini kaldırın.Görünüm alanlarının kaydedilen koordinatlarını koordinatlar paneline girin. Toplam deneme süresi metin alanında toplam deneme süresini tanımlayın. Ek zaman yapılandırma düğmesine tıklayın ve motorlu sahneyi her FOV'a taşımanın zaman aralığı T2'yi tanımlayın.Öğelerin pencere boyutunu en üst düzeye çıkarın ve GUI'nin imlecin otomatik işlemlerini rahatsız etmesini önlemek için AMFIP'nin GUI'sini ekranın sağ tarafına sürükleyin ve ardından enter düğmesine tıklayın. İlk makro bittikten sonra. çok boyutlu edinme penceresindeki edinme düğmesine tıklayın.Uzun süreli görüntülemeyi bitirdikten sonra, otomasyon eklenti penceresindeki duraklat düğmesine ve çok boyutlu alım penceresindeki durdur düğmesine tıklayarak AMFIP görevini durdurun. ND alma penceresindeki üst ve alt düğmeleri tıklatarak öğeleri açın ve Z yığını görüntülemeyi ayarlayın. Işık yolunu sağa doğru değiştirin ve LED ışığını açın.Görüş alanının herhangi bir sürüklenmesi için parlak alan görünümünü izlerken odanın ve Petri kabının kapaklarını yavaşça ve dikkatlice çıkarın. 0,5 mililitre SDS çözeltisi almak için plastik bir pipet kullanın. Plastik pipetleri Petri kabındaki kültür ortamının biraz üzerinde dikkatlice tutun ve kültür ortamına SDS çözeltisinin 1 ila 2 damlacığı ekleyin.Hücreler ve parlak alan görünümü çözüldükten sonra LED ışığını kapatın, ışık yolunu sola geçirin, kilitlemeyi kaldır düğmesine tıklayın. Z yığını görüntülemesini çalıştırın ve görüntü yığınını reference_N olarak kaydedin; Çok boyutlu alım penceresindeki birden fazla konum XY düğmesine tıklayın.Ardından bir sonraki görüş alanını seçin ve motorlu sahneyi ikinci FOV'a taşımak için git düğmesine tıklayın. Her görünüm alanı için bu adımı yineleyin. Nükleer lokalizasyon, B2B ell'lerde yea ilişkili protein veya YAP'ın artan substrat sertliği ile artarken, PC-9 hücreleri çekirdekte benzer YAP konsantrasyonu ve değişen sertlikteki substratlarda sitoplazma göstermiştir.B2B hücre monoton olarak zaman içinde yayılma alanını artırdı, YAP nükleer ila sitoplazmik oranında bir azalma ile birlikte, PC-9 hücresi 10 saatlik yayılma süreci boyunca nispeten değişmeyen bir hücre yayılma alanı, oryantasyon ve YAP nükleer sitoplazmik oranını korudu. Erken yayılmanın 10 saatlik süresi boyunca, temsili B2B hücresi, substrat yüzeyini tam olarak deforme etti ve tüm hücre alanı boyunca hücre çekişini geliştiren zaman uyguladı. Buna karşılık, temsili PC-9 hücresi sadece hücre gövdesinin 2 ucunda yer değiştirme ve çekiş geliştirdi ve çekişi 7,5 saat sonra azaldı.B2B hücrelerinin YAP nükleer to sitoplazmik oranı ve dipol çekişi iki farklı eğilimi takip ediyor gibi görünüyordu, bu da deneyde bir arada bulunan iki grup B2B hücresi olabileceğini düşündürmektedir. İlk grupta, YAP nükleer ila sitoplazmik oran ve dipol çekişi, hücre yayılma alanının genişlemesi ile birlikte artmış ve yaklaşık 1.000 kare mikrometrede maksimalarına ulaşmıştır. İkinci grupta ise yap nükleer to sitoplazmik oran ve dipol çekişi hücre yayılma alanının genişlemesi ile daha yavaş bir hızda artmış ve hücre yayılma alanı artmaya devam ettiğinde neredeyse sabit değerler korunmuştır.Uzun süreli görüntülemede sahne hareketi sırasında görüş alanının potansiyel sürüklenmesinin üstesinden gelmek için tüm lazer kanalları için Z yığın aralıklarının dikkatlice belirlenmesi gerekir. Bu yeni teknik, otomatik, non-invaziv uzun süreli ve çoklupozisyon görüntülemeyi mümkün kılabilir ve hücrelerin ve organellerin zamansal ve mekansal takibini gerektiren moleküler biyoloji mekanizmasının aydınlatılmasına yardımcı olabilir.

all-optical-mechanobiology-interrogation-yes-associated-protein-human

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Biyomühendislik

Bu kağıt kültürü canlı hücreleri mekanik uyarılması için entegre bir atom operasyon okuyucu kuvvet optik görüntüleme mikroskop öğretmeyi hedefliyor. Bir adım-adım protokol sunulmuştur. Mekanik stimülasyonu canlı hücre yanıtı gösteren bir temsilci veri seti sunulmaktadır.

Tümleşik Optik ve Atomik Kuvvet Mikroskobu eğitimi Mekanik Uyarım Canlı Hücre Tepki

Optik Projeksiyon Tomografi İnsan Meme Kanseri Örnekler ve Analiz Uzun vadeli Kültür

Parlak alan ve diferansiyel girişim kontrast görüntülerinin bir kombinasyonu aracılığıyla hücresel kütle, hacim ve yoğunluğun kantitatif ölçümlerini gerçekleştirmek için standart bir optik mikroskobun kullanımını açıklıyoruz.

Nicel Optik Mikroskopi: Hücresel biyofizik ölçümü Standart Optik Mikroskop ile Özellikleri

Açıklanan, yapışık hücreler ve mikroyapılı substratlar arasındaki mekanik etkileşimleri ölçmek için kullanılan protokollerdir. Bu etkileşimler, göç, proliferasyon, farklılaşma ve apoptoz dahil olmak üzere temel hücre davranışlarıyla yakından bağlantılıdır. Protokoller, her bir mikro direk için ilgili kuvvetlerin belirlenmesini sağlayan MechProfiler adlı açık kaynaklı bir görüntü analiz yazılımı sunar.

Micropost Diziler Kolay ve Doğru Mekanik-profil

Yüzeysel doku görüntü verilerini hemoglobin konsantrasyonu, melanin konsantrasyonu ve oksijen satürasyonu dahil olmak üzere doku fizyolojik parametreleriyle birlikte kaydedebilen multimodal bir mikroendoskopun montajı ve kullanımı açıklanmıştır. Bu teknik, doku yapısını ve perfüzyonu değerlendirmek için yararlı olabilir ve araştırmacının bireysel ihtiyaçları için optimize edilebilir.

Multimodal Görüntüleme ve Non-invaziv için Spektroskopisi Fiber paket Mikroendoskopi Platformu,<em&gt; İn Vivo</em&gt; Doku Analizi

Burada konfokal ve atomik kuvvet mikroskobu tek bir enstrüman platformu nda birleştiren Conpokal tekniğinin protokolü sunulmuştur. Conpokal aynı hücre, aynı bölge, eşzamanlı konfokal görüntüleme ve canlı biyolojik örneklerin mekanik karakterizasyonu yakın sağlar.

Canlı Hücrelerde Eşzamanlı Lazer Tarama Konfokal ve Atomik Kuvvet Mikroskobu (Conpokal) Yakınında

Bu çalışma, sitoplazmaya verilen manyetik mikroboncuklar yoluyla hücre çekirdeğine doğrudan mekanik kuvvet uygulamak ve eşzamanlı canlı hücre floresan görüntülemesi yapmak için yeni bir protokol sunmaktadır.

Çekirdek Mekanobiyolojisini Incelemek için 3D Manyetik Kuvvet Aktüatörü ve Çok Fonksiyonlu Floresan Görüntülemeyi Birleştirmek

Burada sunulan, mekano-düğüm-gözenek algılama (mekano-NPS) adı verilen elektronik tabanlı bir mikroakışkan platform kullanarak tek hücreleri mekanik olarak fenotiplemek için bir yöntemdir. Bu platform, hücrelerin hem elastik hem de viskoz biyofiziksel özelliklerini ölçerken 1-10 hücre / s'nin ılımlı verimini korur.

Mekano-Düğüm-Gözenek Algılama: Çok Parametreli Tek Hücreli Viskoelastik Ölçümler için Hızlı, Etiketsiz Bir Platform

Bu protokol, kanserli ve kanserli olmayan hücre hatlarının mekanik özelliklerinin in vitro olarak ölçülmesini özetlemektedir. Kanserli ve normal hücrelerin mekaniğindeki korunmuş farklılıklar, prognoz ve tanıda etkileri olabilecek bir biyobelirteç görevi görebilir.

Tek Hücreli Malzeme Özelliklerinin Belirlenmesi için Kesme Testi Protokolü

Bu protokol, canlı insan meme kanseri hücrelerinin etiketsiz, non-invaziv fenotiplemesi için Raman spektroskopisi ve tomografik faz mikroskobunu birleştiren multimodal bir yaklaşım sunar. Hızlı, kantitatif morfo-kimyasal analiz için kullanıcı dostu, insan yanlılığı içermeyen bir analiz hattı içerir ve kanser araştırmaları ve hücre biyolojisindeki uygulamalarla ayrıntılı moleküler ve yapısal bilgiler sağlar.

Canlı Etiketsiz Meme Kanseri Hücrelerinin Fenotiplemesini Geliştirmek için Multimodal Bir Görüntüleme Çerçevesi

Bu protokol, formalin sabit parafine gömülü doku kesitlerinde protein görüntüleme kütle sitometrisi ile multipleks mRNA tespiti için bir metodolojiyi detaylandırır.

Çift modaliteli Moleküler Kartografi: Multipleks mRNA Tespitinin Protein Görüntüleme Kütle Sitometrisi ile Entegre Edilmesi

Keşfedin YAP proteininin mekanobiyolojik hassasiyetini açıklamak için çok fonksiyonlu otomatik görüntüleme ve mekanobiyolojik analiz protokolünü. Bu yöntem, canlı hücre görüntüleme teknikleri kullanarak moleküler mekanizmaları ortaya koyar.

Çok Fonksiyonlu Bir Sistem Kullanarak İnsan Kanseri ve Normal Hücrelerde Evet İlişkili Proteinin Tamamen Optik Mekanobiyoloji Sorgulaması (Video) | JoVE Journal

Çok Fonksiyonlu Bir Sistem Kullanarak İnsan Kanseri ve Normal Hücrelerde Evet İlişkili Proteinin Tamamen Optik Mekanobiyoloji Sorgulaması

Daha fazla video keşfet