Name: İnsan Pluripotent Kök Hücre Sferoidlerini Taşıyan Core-Shell Mikrokapsüllerinin Mikroakışkan İmalatı (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-10-13T14:30:00.000+00:00
Duration: 10 min 51 s
Description: Keşfedin, mikroakışkan teknoloji ile insan pluripotent kök hücre sferoidlerini koruyan core-shell mikrokapsül üretimini. Bu yöntem, ölçeklenebilir hücre tedavileri için yüksek verimli 3D kültür sağlar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Bu çalışma kısmen Mayo Clinic Rejeneratif Tıp Merkezi, J. W. Kieckhefer Vakfı, Al Nahyan Vakfı, Rejeneratif Tıp Minnesota (RMM 101617 TR 004) ve NIH (DK107255) tarafından desteklenmiştir.

1. Cihaz imalatı
<ol><li>CAD yazılımı10,11'i kullanarak mikrokapsülleme cihazı ve ayrışma cihazı için tasarımlar yapın.</li>
	<li>İstenilen yüksekliklere sahip yapılar elde etmek için SU-8 fotodirencinin üç katmanını silikon gofret üzerinde sırayla (Şekil 2A) spin-co'layın: 60, 100 ve 150 μm. NOT: Üst ve alt kalıplar için işlem aynıdır.<ol>
<li>İlk 60 μm katmanı oluşturmak için 1.100 rpm'de SU-8 2025 negatif fotorezistli temiz bir 10 cm'lik silikon gofret kaplayın. Sıcak plaka üzerinde 3 dakika boyunca 65 °C'de ve 10 dakika boyunca 95 °C'de yumuşak bir fırınlamadan sonra, çekirdek kanal deseninin tasarım dosyasını μPG 101 PC'ye yükleyerek maskesiz bir hizalayıcı kullanarak kalıbı ortaya çıkarın. Ardından, maruz kalma sonrası 3 dakika boyunca 65 ° C'de ve 10 dakika boyunca 95 ° C'de pişirmeye devam edin.</li>
		<li>İkinci SU-8 2025 katmanını (40 μm) 1.500 rpm'de döndürün ve kabuk kanalı deseni için uygun CAD dosyasını yükleyerek pozlayın. NOT: Yumuşak ve pozlama sonrası fırınlar önceki adıma benzerdi.</li>
		<li>50 μm yüksekliğe ulaşmak için üçüncü SU-8 2025 katmanını 1.400 rpm'de döndürün ve yukarıdaki işlemi tekrarlayın, ancak yağ fazı için yapıları açığa çıkarın.</li>
		<li>Maruz kalmayan tüm fotodirenç çıkarılana kadar SU-8 geliştiricisine daldırarak kalıbı üç katmanla birlikte tek bir adımda geliştirin.</li>
		<li>Yapışmayı iyileştirmek ve geliştirmeden sonra ortaya çıkabilecek küçük çatlakları kapatmak için kalıbı 160 ° C'de sıcak bir plakada 10 dakika boyunca sert bir şekilde pişirin.</li>
		<li>Bir sonraki adımda elastomer yapışmasını önlemek için kalıbı klorotrimetilsilana maruz bırakın ve kullanıma kadar 15 cm Petri kaplarına yerleştirin.</li>
	</ol></li>
	<li>Ayrışma cihazı kalıbını Şekil 1D ve Şekil 2B'de açıklandığı gibi hazırlayın. İstenilen yüksekliğe sahip yapılar elde etmek için 1.2.3 adımında daha önce açıklandığı gibi, bir silikon gofret üzerinde bir kat SU-8 fotodirenci döndürün: 50 μm. Yumuşak ve maruz kalma sonrası pişirme, geliştirme ve sert pişirmeyi önceki adıma benzer şekilde yapın. NOT: Bir dizi üçgen şekilli direk tüm odayı kapladı ve oda genişliği çıkışa doğru azaldıkça direkler arasındaki boşluk azaldı. Üçgen direkler, 400 μm (girişte) ila 30 μm (çıkışta) arasında değişen bir aralıkla yan başına 200 μm idi.</li>
	<li>Kalıpları polidimetilsiloksan (PDMS) kullanarak yumuşak litografi ile hazırlayın.<ol>
<li>PDMS elastomer baz ve elastomer kürleme maddesini gezegensel bir santrifüjde 10:1 w/w oranında karıştırın. 3-4 mm'lik bir tabaka oluşturmak için karışımı hem mikrokapsülleme ana kalıplarına hem de ayrışma ana kalıbına dökün. NOT: 50 g elastomer baz ile 5 g kürleme maddesi karışımı, 3 mm kalınlığındaki bir ana kalıbı örtmek için yeterlidir.</li>
		<li>Kürlenmemiş PDMS'nin gazını gidermek için kalıpları içeren Petri kaplarını 15 dakika boyunca vakumlu bir kurutucuya yerleştirin.</li>
		<li>Petri tabaklarını bir fırına taşıyın ve en az 60 dakika boyunca 80 ° C'de pişirin.</li>
		<li>Ana kalıpları fırından çıkarın ve soğumalarını bekleyin. Hassas bir bıçak kullanarak, gofret şeklini takip ederek PDMS'yi dikkatlice kesin ve PDMS parçalarını ana kalıptan çıkarın.</li>
		<li>Her cihazın kenarlarını bir neşterle keserek PDMS plakalarını kesin, ardından ayrışma cihazındaki ve yalnızca üst mikroakışkan cihazdaki giriş/çıkış akışkan portlarını paslanmaz çelik iğneler kullanarak delin. Kirlenmeyi önlemek için cihazları sihirli bantla örtün. NOT: İğne ölçer, giriş ve çıkış portları için sırasıyla 14 G ve 15 G'dir.</li>
		<li>Yapıştırma için, üst ve alt PDMS parçalarının desenli taraflarını2 dakika boyunca bir plazma kazıyıcı üzerinde O2 plazma ile tedavi edin.</li>
		<li>Doğrudan mikro kanallara (2 μL) ince bir ayırıcı damıtılmış su tabakası ekledikten sonra her iki PDMS parçasını da bir stereoskop altında hizalayın.</li>
		<li>Yapıştırmayı tamamlamak ve PDMS'yi orijinal hidrofobik durumuna geri yüklemek için hizalanmış PDMS cihazını gece boyunca 80 ° C'de fırına yerleştirin. Daha fazla kullanana kadar cihazları saklayın. NOT: Bu, çekirdek için 120 μm, kabuk için 200 μm ve yağ kanalları için 300 μm olmak üzere üç farklı yüksekliğe sahip koaksiyel akış odaklama cihazı ile sonuçlanır.</li>
		<li>Plazma bağlanmasından hemen sonra cihazı kullanmak için, hidrofobik kaplama elde etmek için sıvı kanallara dikkatli ama sıkı bir şekilde 30 μL hidrofobik kaplama çözeltisi enjekte edin. Daha sonra, cihazda hidrofobik kaplama çözeltisinin kalıntıları gözlenmeyene kadar havayı derhal kanallara boşaltın.</li>
		<li>Ayrışma cihazını, önce cihazın desenli tarafını ve temizlenmiş bir slayt camınıO2 plazma ile 2 dakika boyunca işlemden geçirerek bağlayın ve daha sonra gece boyunca 80 ° C'de fırında daha fazla kürlenme için birleştirin. NOT: Cihazlar daha fazla kullanıma kadar saklanabilir.</li>
	</ol></li>
</ol>2. Çözeltilerin hazırlanması
<ol><li>Stok çözümleri. İlk olarak, gerçek kullanım için daha düşük konsantrasyonlara seyreltilecek stok çözeltileri (konsantre çözeltiler) hazırlayın. NOT: Stok çözümleri, hazırlık süresinden tasarruf etmek, malzemeleri korumak, depolama alanını azaltmak ve daha düşük konsantrasyonlarda bir çalışma çözeltisi hazırlarken doğruluğu artırmak için kullanılır.<ol>
<li>30 mL 2x çekirdek çözeltisi (%16 PEG ve %34 yoğunluk gradyan ortamı) hazırlayın: 4,8 g 35 kDa PEG, 10,2 mL yoğunluk gradyan ortamı ve 19,8 mL DMEM/F12 ortam karıştırın. Bu çekirdek çözeltiyi 0,22 μm şırınga filtresi kullanarak filtreleyin.</li>
		<li>% 3 yüzey aktif madde ile 50 mL mineral yağ hazırlayın: 48.5 mL mineral yağ ve 1.5 mL yüzey aktif madde karıştırın. 0,22 μm şırınga filtresinden filtrasyondan sonra steril bir durumda tutun.</li>
		<li>% 0.5 yüzey aktif madde ile 50 mL mineral yağ hazırlayın: 49.75 mL mineral yağ ve 0.25 mL yüzey aktif madde karışımı. Steril bir durumda tutun.</li>
		<li>1 M Ditiyoteritol (DTT) hazırlayın: 1.5425 g DTT'yi 10 mL damıtılmış suda çözün. Steril bir durumda tutun.</li>
		<li>1 M Trietanolamin (TEA) hazırlayın: 433.6 μL damıtılmış suya 66.4 μL çay ekleyin. Steril bir durumda tutun.</li>
		<li>% 1 Pluronik F127 (PF127) hazırlayın: 10 mL damıtılmış suda 100 mg PF127 çözün. Steril bir durumda tutun.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Çalışma çözümleri<ol>
<li>4,5 mL mineral yağı% 3 yüzey aktif madde ve 300 μL 1 M DTT (1:15 oranı) ile karıştırarak bir çapraz bağlayıcı emülsiyonu hazırlayın. 2 dakika boyunca çözeltiyi vorteks edin ve 20 ° C'de ultrasonik bir banyoda 45-60 dakika boyunca sonikat. Bu çözeltiyi 27 G iğneli 5 mL'lik bir şırıngaya yükleyin. NOT: Emülsiyon, sonikasyon yağı / su karışımı ile üretilir.</li>
		<li>Mineral yağı% 0,5 yüzey aktif madde ile 27 G iğneli 5 mL'lik bir şırıngaya yükleyerek koruyucu yağ çözeltisi hazırlayın.</li>
		<li>% 8 w / v çözeltisi oluşturmak için 400 μL 1x DPBS'ye 32 mg PEG-4-Mal ekleyerek kabuk (% 8 w / v PEG-4-Mal ve 15 mM TEA) çözeltisi hazırlayın ve çözeltiyi 2 dakika boyunca vorteksleyin. Daha sonra, 6 μL 1 M TEA ekleyin (son konsantrasyon 15 mM TEA). Son olarak, bir spin filtresinden 5 dakika boyunca 13.000 x g'de santrifüj yapın ve 30 dakika boyunca rocker üzerinde karanlıkta tutun. Ardından, bu çözeltiyi 27 G'lik bir iğne ile 1 mL'lik bir şırıngaya yükleyin. NOT: Kapağı açmadan önce PEG-4-Mal kabını oda sıcaklığında 10 dakika bekletin ve kapağı kapatmadan önce O2'yi N2 ile değiştirmek içinN2 gazını üfleyin. Çözüme eklemeden önce Vortex TEA.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Çekirdek çözeltide hücre süspansiyonunu hazırlayın<ol>
<li>hPSC'lere 37 °C'de 5 ila 10 dakika boyunca tripsin uygulayın. Sonra onları plakalardan toplayın. Tripsini hücre ayrılmasından sonra ortamla söndürün ve ardından hücreleri 15 mL'lik bir konik tüpe aktarın.</li>
		<li>Toplu hücre süspansiyonunu santrifüj edin (400 x g, 5 dakika). Süpernatantı dikkatlice aspire edin ve daha sonra minimum hacimli bir büyüme ortamı kullanarak hücre peletini yeniden askıya alın. Otomatik bir hücre sayacı kullanarak hücreleri sayın. NOT: Tipik hücre alikotları 12-20 x 106 hücre içerir ve çekirdek çözeltinin 400 μL'sini yapmak için yeterlidir.</li>
		<li>Toplu hücre süspansiyonundan 12-20 x 106 hücre alın ve hücre/ortam süspansiyonunu santrifüj edin (400 x g, 5 dakika).</li>
		<li>Hücre peletinden medyayı dikkatlice aspire edin. Ardından, 200 μL ortam ve 200 μL 2x PEG çözeltisi (son konsantrasyon 30-50 x 106 hücre / mL) ekleyin ve yavaşça karıştırın. NOT: Düşük hücre konsantrasyonları (20 x 106 hücre / mL'den az) birçok boş kapsülle sonuçlandı.</li>
		<li>Çözeltiye 30 μL% 1 PF127 ekleyin.</li>
		<li>1 mL'lik bir şırıngaya bir mikro karıştırıcı çubuğu (2 mm x 7 mm) yerleştirin ve ardından çekirdek çözeltisi içeren hücreyi 27 G'lik bir iğne ile şırıngaya yükleyin. Tüm kapsülleme işlemi sırasında çözeltiyi buzla soğuk tutun.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. Deney düzeni
<ol><li>Yapıştırılmış PDMS damlacık cihazını, dört adet 20 cm uzunluğunda ve bir parça 5 cm uzunluğunda giriş mikro tüpleri (0,38 mm ID. x 1,1 mm O.D.), bir parça 10 cm çıkış tüpü (0,5 mm ID x 1,5 mm O.D.) ve altı adet 0,5 cm bağlantı tüpünü (1 mm ID. x 1,8 mm O.D.) mikrop öldürücü bir ışık kaynağının (tipik olarak biyolojik güvenlik dolaplarına yerleştirilmiş) altına yerleştirin ve 30 adet sterilize edin min.</li>
	<li>Boruyu akışkan giriş portlarına ve ayrışma portlarına sığdırmak için forseps kullanın.</li>
	<li>Kabuk, yağ, çapraz bağlayıcı emülsiyon girişleri için üç adet 20 cm uzunluğunda giriş mikrotüpü ve ayrışma cihazının girişi için bir parça kullanın. Ardından, tüplerin karşı ucunu ilgili çözelti ile şırınganın iğnesine yerleştirin. Bu arada, mikroakışkan cihazın çekirdek girişini ve ayrışma cihazının çıkışını 5 cm'lik bir mikrotüp ile bağlayın (Şekil 1C). NOT: Giriş mikrotüpleri, son adımda yerleştirilen bağlantı tüplerinin içine sıkıca sabitlenmelidir.</li>
	<li>Akışkan çıkış portuna bir çıkış tüpü yerleştirin ve karşı ucu bir toplama haznesine yerleştirin.</li>
	<li>Cihazı mikroskop aşamasına yerleştirin ve hareket etmesini önlemek için boruyu takın. Akış denetimi için mikroskobu cihaz nozuluna hizalayın ve odaklayın.</li>
	<li>Her şırıngayı farklı şırınga pompalarına yerleştirin ve düzgün bir şekilde sabitleyin (Şekil 1B). Her pompayı üreticinin protokollerine göre aşağıdaki akış hızlarına göre programlayın: çekirdek (3-5 μL/dak), kabuk (3-5 μL/dak), koruyucu yağ (20-80 μL/dak) ve çapraz bağlama yağı (40-60 μL/dak). Tüm pompalarda akışı başlatın.</li>
	<li>Her sıvının cihaza girmesini bekleyin ve kalan havayı dışarı iterken kanalları doldurun. NOT: Giriş borusunda çok miktarda hava varsa, hava tamamen çıkarılana kadar her akış hızını geçici olarak artırın. Aşırı akış hızının PDMS'den PDMS'ye bağ hatasına yol açabileceğini unutmayın.</li>
	<li>Kapsül oluşumu stabilize edildiğinde (Şekil 3), toplama tüpünün karşı ucunu 5 mL mTeSR ortamına sahip yeni bir konik tüpe yerleştirin. NOT: Ortam 10 μM ROCK inhibitörü, 100 U/mL penisilin ve 100 μg/mL streptomisin içerir.</li>
	<li>Yeterli sayıda kapsül toplandıktan sonra, 10 dakika boyunca% 5 CO2 ile 37 ° C'de inkübe edin. Yağ fazında bulunan kapsüller tüpün tepesinde olacaktır (bkz. Şekil 4A). Tüpe hafifçe dokunmak, kapsüllerin dibe çökelmesine neden olur. Bundan sonra, yağ ve ortamın çoğu aspire edilebilir.</li>
	<li>Kapsülleri konik tüpün dibinden toplayın, bir hücre süzgecine (100 μm gözenek boyutu) yerleştirin ve bol miktarda ortamla yıkayın. Daha sonra, 6 delikli bir kültür plakasında 2 mL medya kullanarak mikrokapsülleri toplayın ve medyayı kuyu plakasının üzerine ters çevrildiği için filtreden geçirin (bkz. Şekil 4A).</li>
</ol>4. Mikrokapsüllerde hPSC kültürü ve analizi
<ol><li>Temel kültür<ol>
<li>Kök hücre kapsüllerini, 37 ° C'de% 5 CO 2 ile 6 delikli bir tabak kültür kabındainkübe edin.</li>
		<li>Kapsülleri bir hücre süzgeci filtresinde toplayarak, fazla medya ile yıkayarak ve adım 3.10'da yapıldığı gibi 2 mL ortama sahip 6 delikli plakalarda yeni bir kuyuya geri döndürerek medyayı her gün değiştirin.</li>
		<li>Kapsülleri en az 10 gün boyunca kültürleyin.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Kapsüllenmiş kök hücrelerin yaşayabilirliğini belirlemek için canlı / ölü tahlilini yapın.<ol>
<li>Canlı / ölü tahlil çözeltilerini (ethidium homodimer-1 ve calcein AM) çözün.</li>
		<li>2 mL steril DPBS'ye 2 μM ethidyum homodimer-1'in 4 μL'sini ve 4 μM kalsein çözeltilerinin 1 μL'sini ekleyin. Tam karıştırma sağlamak için vorteks.</li>
		<li>Bir hücre süzgeci üzerinde yaklaşık 100 mikrokapsül toplayın ve ortamın kapsüllerden dışarı difüzyonuna izin vermek için steril DPBS ile durulayın.</li>
		<li>Adım 4.2.2'de hazırlanan çözeltinin 1 mL'sini kullanarak bunları tekrar 12 kuyucuklu bir kültür plakasına toplayın. 20 dakika boyunca 37 ° C'de inkübe edin.</li>
		<li>Hücreleri floresan mikroskobu altında görselleştirin. NOT: Hücre canlılığı, yeşil olarak görselleştirilen canlı hücrelerin toplam hücre sayısı içindeki yüzdesinin hesaplanmasıyla ölçülür.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Küresel boyut karakterizasyonu.<ol>
<li>İstenildiğinde, kuyu plakasını mikrokapsüllerle mikroskop altına yerleştirin ve ilgili yazılımda gösterilen sferoidlerin çapını uygun ölçek çubuklarıyla ölçün.</li>
		<li>Küresel boyutu ölçün ve analiz edin.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol><li>Zhu, Z., Huangfu, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+pluripotent+stem+cells%3A+an+emerging+model+in+developmental+biology%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Human pluripotent stem cells: an emerging model in developmental biology.</a> Development. 140 (4), 705-717 (2013).</li>
<li>Liu, G., David, B. T., Trawczynski, M., Fessler, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Advances+in+pluripotent+stem+cells%3A+history%2C+mechanisms%2C+technologies%2C+and+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Reviews+and+Reports%22%5BJournal%5D)">Advances in pluripotent stem cells: history, mechanisms, technologies, and applications.</a> Stem Cell Reviews and Reports. 16 (1), 3-32 (2020).</li>
<li>Chan, S. W., Rizwan, M., Yim, E. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Emerging+methods+for+enhancing+pluripotent+stem+cell+expansion%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Cell+and+Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Emerging methods for enhancing pluripotent stem cell expansion.</a> Frontiers in Cell and Developmental Biology. 8, 70(2020).</li>
<li>Lei, Y., Schaffer, D. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+fully+defined+and+scalable+3D+culture+system+for+human+pluripotent+stem+cell+expansion+and+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">A fully defined and scalable 3D culture system for human pluripotent stem cell expansion and differentiation.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (52), 5039-5048 (2013).</li>
<li>Olmer, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Suspension+culture+of+human+pluripotent+stem+cells+in+controlled%2C+stirred+bioreactors%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Engineering+Part+C%3A+Methods%22%5BJournal%5D)">Suspension culture of human pluripotent stem cells in controlled, stirred bioreactors.</a> Tissue Engineering Part C: Methods. 18 (10), 772-784 (2012).</li>
<li>Kraehenbuehl, T. P., Langer, R., Ferreira, L. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-dimensional+biomaterials+for+the+study+of+human+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Three-dimensional biomaterials for the study of human pluripotent stem cells.</a> Nature Methods. 8 (9), 731-736 (2011).</li>
<li>Fattahi, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Core-shell+hydrogel+microcapsules+enable+formation+of+human+pluripotent+stem+cell+spheroids+and+their+cultivation+in+a+stirred+bioreactor%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Core-shell hydrogel microcapsules enable formation of human pluripotent stem cell spheroids and their cultivation in a stirred bioreactor.</a> Scientific Reports. 11 (1), 1-13 (2021).</li>
<li>Siltanen, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microfluidic+fabrication+of+bioactive+microgels+for+rapid+formation+and+enhanced+differentiation+of+stem+cell+spheroids%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Biomaterialia%22%5BJournal%5D)">Microfluidic fabrication of bioactive microgels for rapid formation and enhanced differentiation of stem cell spheroids.</a> Acta Biomaterialia. 34, 125-132 (2016).</li>
<li>Agarwal, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((One-step+microfluidic+generation+of+pre-hatching+embryo-like+core-shell+microcapsules+for+miniaturized+3D+culture+of+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+on+a+Chip%22%5BJournal%5D)">One-step microfluidic generation of pre-hatching embryo-like core-shell microcapsules for miniaturized 3D culture of pluripotent stem cells.</a> Lab on a Chip. 13 (23), 4525-4533 (2013).</li>
<li>Siltanen, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((One+step+fabrication+of+hydrogel+microcapsules+with+hollow+core+for+assembly+and+cultivation+of+hepatocyte+spheroids%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Biomaterialia%22%5BJournal%5D)">One step fabrication of hydrogel microcapsules with hollow core for assembly and cultivation of hepatocyte spheroids.</a> Acta Biomaterialia. 50, 428-436 (2017).</li>
<li>Rahimian, A., Siltanen, C., Feyzizarnagh, H., Escalante, P., Revzin, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microencapsulated+immunoassays+for+detection+of+cytokines+in+human+blood%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Sensors%22%5BJournal%5D)">Microencapsulated immunoassays for detection of cytokines in human blood.</a> ACS Sensors. 4 (3), 578-585 (2019).</li>
<li>Kim, M., Lee, J., Jones, C. N., Revzin, A., Tae, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Heparin-based+hydrogel+as+a+matrix+for+encapsulation+and+cultivation+of+primary+hepatocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Heparin-based hydrogel as a matrix for encapsulation and cultivation of primary hepatocytes.</a> Biomaterials. 31, 3596-3603 (2010).</li>
<li>Shin, D. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Photodegradable+hydrogels+for+capture%2C+detection%2C+and+release+of+live+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Angewandte+Chemie+International+Edition%22%5BJournal%5D)">Photodegradable hydrogels for capture, detection, and release of live cells.</a> Angewandte Chemie International Edition. , (2014).</li>
<li>You, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bioactive+photodegradable+hydrogel+for+cultivation+and+retrieval+of+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Advanced+Functional+Materials%22%5BJournal%5D)">Bioactive photodegradable hydrogel for cultivation and retrieval of embryonic stem cells.</a> Advanced Functional Materials. , (2015).</li>
</ol>

Yazarların açıklayacak hiçbir şeyleri yoktur.

Burada açıklanan kapsülleme işlemi, hPSC sferoidlerinin tekrarlanabilir oluşumu ile sonuçlanır. Mikrokapsül formatı, farklılaşma protokollerini iyileştirmeyi / optimize etmeyi veya tedavileri test etmeyi amaçlayan deneyler için sferoidlerin bir mikrotitre plakasının kuyucuklarına dağıtılmasını kolaylaştırır. Kapsüllenmiş kök hücre sferoidleri, hidrojel kabuğun hücreleri kesme kaynaklı hasara karşı koruduğu süspansiyon kültürlerinde de kullanılabilir7.
Protokol içinde bi...

İnsan pluripotent kök hücrelerinin (hPSC'ler) 3D kültürlerine, bu kültür formatı 1,2,3'ün sağladığı gelişmiş pluripotens ve farklılaşma potansiyeli nedeniyle büyük ilgi vardır. hPSC'ler tipik olarak biyoreaktörler, mikrokuyular, hidrojeller ve polimerik iskeleler 4,5,6 aracılığıyla sferoidler veya diğer 3D kültür formatları halinde oluşturulur. Kapsülleme, tek hPSC'leri sferoidler halinde düzenlemek için başka bir yol sunar. Kapsüllendikten sonra hPSC sferoidleri kolaylıkla ele alınabilir ve farklılaşma, hastalık modelleme veya ilaç testi deneyleri için mikrotitre plakalarına aktarılabilir. hPSC'lerin bir hidrojel tabakası içinde muhafaza edilmesi ayrıca hücreleri kesme hasarına karşı korur ve sferoidlerin bir biyoreaktörde yüksek karıştırma oranlarındakültürlenmesine izin verir 7.
Kök hücre kapsülleme metodolojimiz zamanla gelişti. İlk olarak, katı hidrojel mikropartiküllerine odaklandık ve fare embriyonik kök hücrelerinin (mESC'ler) başarılı bir şekilde kapsüllendiğini ve yetiştirildiğini gösterdik8. Bununla birlikte, insan embriyonik kök hücrelerinin (hESC'ler), muhtemelen bu hücrelerin kapsüllemeden sonra hücre-hücre temaslarını yeniden kurmalarına duyulan ihtiyaç nedeniyle, bu tür hidrojel mikropartiküllerde kapsüllendiğinde düşük canlılığa sahip oldukları belirtildi. Sulu bir çekirdeğe sahip heterojen mikrokapsülün, hücre-hücre temaslarının hızlı bir şekilde yeniden kurulmasına dayanan hücrelerin kapsüllenmesi için daha uygun olabileceğini düşündük. Sulu çekirdek / hidrojel kabuk mikrokapsülleri yapmak için mikroakışkan cihaz odaklı koaksiyel akış kavramı He ve ark.9'dan uyarlanmıştır, ancak orijinal yaklaşımda kullanılan aljinat yerine, PEG bazlı bir hidrojel kabuğa dahil edilmiştir. İlk olarak çekirdek-kabuk mikrokapsüllerinde primer hepatositin başarılı kapsüllenmesi ve sferoid oluşumu10 gösterdik ve en son olarak hES ve iPS hücrelerinin kapsüllenmesini tanımladık7. Şekil 1A'da belirtildiği gibi, kapsüller, kabuk ve çekirdek akış akışlarının yağ fazına atılmadan önce bir yandan diğer yana koaksiyel akışa geçtiği bir akış odaklama cihazında üretilir. Çekirdek akışı, çözeltinin viskozitesini artıran hücreler ve katkı maddeleri içerir (reaktif olmayan PEG MW 35kD ve iyodiksanol - ticari adı OptiPrep), kabuk akışı ise reaktif moleküller (PEG-4-Mal) içerir. Sürekli koaksiyel akış akışı, çekirdek-kabuk mimarisini koruyan damlacıklar halinde ayrıklaştırılır. Çekirdek-kabuk yapısı, tıklama kimyası yoluyla PEG-4-Mal ile reaksiyona giren ve ince (~ 10 μm) bir hidrojel cilt veya kabuk oluşumuna neden olan di-tiol çapraz bağlayıcıya (DTT) maruz kalınarak kalıcı hale getirilir. Emülsiyon kırıldıktan ve kapsüller sulu bir faza aktarıldıktan sonra, PEG molekülleri çekirdekten yayılır ve su molekülleri ile değiştirilir. Bu, sulu çekirdek ve hidrojel kabuk mikrokapsülleri ile sonuçlanır.
Aşağıda, mikroakışkan cihazların nasıl yapılacağı, hücrelerin nasıl hazırlanacağı ve hPSC'lerin kapsüllenmesinin nasıl gerçekleştirileceği hakkında adım adım talimatlar verilmiştir.

<table><tbody><tr><td>0.22 ve mikro; m Şırınga Filtreleri</td><td>Genesee Scientific</td><td>25-244</td><td></td></tr><tr><td>1 ml şırınga luer-kilit ucu</td><td>BD</td><td>309628</td><td></td></tr><tr><td>1x DPBS</td><td>Corning</td><td>23220003</td><td></td></tr><tr><td>4 kollu PEG maleimid, 10kDa</td><td>Laysan Inc.</td><td>164-68</td><td></td></tr><tr><td>5 ml şırınga luer-kilit ucu</td><td>BD</td><td>309646</td><td></td></tr><tr><td>6 KUYULU İŞLEM GÖRMEMIŞ PLAKA</td><td>ABD Scientific</td><td>CC7672-7506</td><td></td></tr><tr><td>Aquapel Aplikatör Paketi</td><td>Aquapel Cam Tedavisi</td><td>47100</td><td></td></tr><tr><td>CAD yazılımı</td><td>Autodesk</td><td>AutoCAD v2020</td><td></td></tr><tr><td>HÜCRE SÜZGECİ 100 & m gözenek boyutu</td><td>kardinal</td><td>335583</td><td></td></tr><tr><td>Klorotrimetilsilan</td><td>Aldrich</td><td>386529-100mL</td><td></td></tr><tr><td>Kontes II FL Otomatik Hücre Sayacı Yaşam</td><td>teknolojisi</td><td>A27974</td><td></td></tr><tr><td>Dijital sıcak plaka</td><td>Dataplate</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Dijital girdap karıştırıcı</td><td>Fisher Scientific</td><td>215370</td><td></td></tr><tr><td>Damıtılmış su</td><td>Gibco</td><td>15230-162</td><td></td></tr><tr><td>Ditiotheritol (DTT)</td> <td>Sigma</td><td>D0632-10G</td><td></td></tr><tr><td>DMEM / F12 medya</td><td>gibco</td><td>11320-033</td><td></td></tr><tr><td>Falcon 15 mL Konik Santrifüj Tüpleri</td><td>Fisher scientific</td><td>14-959-53A</td><td></td></tr><tr><td>Fisherbrand accuSpin Micro 17 Mikrosantrifüj</td><td>canlı</td><td>13-100-675</td><td></td></tr><tr><td>HERACELL VIOS 160i CO2 İnkübatör</td><td>Thermo Scientific</td><td>50144906</td><td></td></tr><tr><td>Ters Floresan Motorlu Mikroskop</td><td>Olympus</td><td>Olympus IX83</td><td></td></tr><tr><td>Laurell Spin Kaplayıcılar</td><td>Laurell Technologies</td><td>WS-650MZ-23NPPB</td><td></td></tr><tr><td>Canlı/Ölü memeli boyama kiti</td><td>Fisher</td><td>L3224</td><td></td></tr><tr><td>Sihirli bant</td><td>Zımba</td><td>483535</td><td></td></tr><tr><td>Mikro Tıbbi Boru (0.015 "ID x 0.043" OD)</td><td>Scientific Commodities, Inc</td><td>BB31695-PE / 2</td><td></td></tr><tr><td>Mikro karıştırma çubuğu</td><td>Daigger Scientific</td><td>EF3288E</td><td></td></tr><tr><td>MilliporeSigma Filtre Forseps</td><td>Fisher bilimsel</td><td>XX6200006P</td><td></td></tr><tr><td>Mineral yağ</td><td>Sigma</td><td>M8410-1L</td><td></td></tr><tr><td>mTeSR 1 Bazal Orta</td><td>KÖK HÜCRE TEKNOLOJİSİ</td><td>85850</td><td></td></tr><tr><td>İğneler-Paslanmaz Çelik&nbsp; 14 Gauge</td><td>CML kaynağı</td><td>901-14-025</td><td></td></tr><tr><td>İğneler-Paslanmaz Çelik&nbsp; 15 Gauge</td><td>CML kaynağı</td><td>901-15-050</td><td></td></tr><tr><td>OptiPrep</td><td>STEMCELL TEKNOLOJİSİ</td><td>7820</td><td></td></tr><tr><td>Fırın</td><td>Thermo Scientific</td><td>HERA THERM Fırın Penisilin</td><td></td></tr><tr><td>:Streptomisin (10.000 U/mL Penisilin G, 10mg/mL Streptomisin)</td><td>İkizler</td><td>400-109</td><td></td></tr><tr><td>Petri Çanak 150X20 Steril Havalandırma</td><td>Sarstedt, Inc.</td><td>82.1184.500</td><td></td></tr><tr><td>Plazma Temizleme Sistemi</td><td>Verim Mühendislik Sistemi, Inc.</td><td>EVET-G500</td><td></td></tr><tr><td>Pluronic F-127</td><td>Sigma</td><td>P2443-250G</td><td></td></tr><tr><td>Poli (etilen glikol) 35kDa</td><td>Sigma</td><td>94646-250G-F</td><td></td></tr><tr><td>PrecisionGlide İğne 27G</td><td>BD</td><td>305109</td><td></td></tr><tr><td>Kaya inhibitörü Y-27632 dihidroklorit</td><td>SELLECK CHEM</td><td>S1049-10mg</td><td></td></tr><tr><td>Silikon gofret 100mm</td><td>Üniversite Gofret</td><td>452</td><td></td></tr><tr><td>Sürgülü cam (75 mm ve akut; 25 mm)</td><td>CardinalHealth</td><td>M6146</td><td></td></tr><tr><td>Açıklık 80</td><td>Sigma</td><td>S6760-250ML</td><td></td></tr><tr><td>SpeedMixer</td><td>Thinky</td><td>ARE-310</td><td></td></tr><tr><td>Spin-X Santrifüj Tüp Filtresi (0.22 ve mikro; m)</td><td>Costar</td><td>8160</td><td></td></tr><tr><td>SU-8 2025</td><td>Kayaku İleri Malzemeler</td><td>Y111069 0500L1GL</td><td></td></tr><tr><td>SU-8 geliştirici</td><td>Kayaku İleri Malzemeler</td><td>Y020100 4000L1PE</td><td></td></tr><tr><td>Cerrahi Tasarım Royaltek Paslanmaz Çelik Cerrahi Neşter Bıçakları</td><td>fisher scientific</td><td>22-079-684</td><td></td></tr><tr><td>SYLGARD TM 184 Silikon Elastomer Kiti (PDMS)</td><td>Dow Corning</td><td>2065622</td><td></td></tr><tr><td>Şırınga pompası</td><td>New Era Pump System, Inc</td><td>NE-4000</td><td></td></tr><tr><td>Trietanolamin</td><td>Sigma-aldrich</td><td>T58300-25G</td><td></td></tr><tr><td>TrypLE Express</td><td>Gibco</td><td>12604-013</td><td></td></tr><tr><td>Tygon Boru (0.02 "ID x 0.06" OD)</td><td>Cole-Parmer</td><td>06419-01</td><td></td></tr><tr><td>Tygon Boru (0.04" ID x 0.07" OD)</td><td>Cole-Parmer</td><td>06419-04</td><td></td></tr><tr><td>Ultrasonik temizleyici FS20D</td><td>Fisher Scientific</td><td>CPN-962-152R</td><td></td></tr><tr><td>Vakumlu kurutucu</td><td>Bel-Art</td><td>F42025-0000</td><td></td></tr><tr><td>Zeiss Stemi DV4 Stereo Mikroskop 8x-32x</td><td>ZEISS</td><td>435421-0000-000</td><td></td></tr><tr><td>&mu; PG 101 lazer yazıcı</td><td>Heidelberg Instruments</td><td>HI 1128</td><td></td></tr></tbody></table>

İnsan pluripotent kök hücre sferoidlerini taşıyan core-shell mikrokapsüllerinin mikroakışkan İmalatı

Microfluidic Fabrication of Core-Shell Microcapsules carrying Human Pluripotent Stem Cell Spheroids

İnsan pluripotent kök hücrelerinin (hPSC'ler) üç boyutlu (3D) veya sferoid kültürleri, gelişmiş farklılaşma sonuçlarının ve ölçeklenebilirliğin faydalarını sunar. Bu yazıda, hPSC'leri çekirdek kabuklu mikrokapsüllerin içine hapsetmek için bir ko-eksenel akış odaklama cihazının kullanıldığı hPSC sferoidlerinin sağlam ve tekrarlanabilir oluşumu için bir strateji açıklanmaktadır. Çekirdek çözelti, hPSC'lerin tek hücreli süspansiyonunu içeriyordu ve yüksek moleküler ağırlıklı poli (etilen glikol) (PEG) ve yoğunluk gradyan ortamının dahil edilmesiyle viskoz hale getirildi. Kabuk akışı, PEG-4 kol-maleimid veya PEG-4-Mal'dan oluşuyordu ve çekirdek akışı boyunca iki ardışık petrol kavşağına doğru akıyordu. Damlacık oluşumu, ilk yağ kavşağında, kabuk çözeltisinin çekirdeğin etrafına sarılmasıyla meydana geldi. Kabuğun kimyasal çapraz bağlanması, ikinci yağ kavşağında, bu damlacıklara bir di-tiyo çapraz bağlayıcı (1,4-ditiyotreitol veya DTT) eklenerek meydana geldi. Çapraz bağlayıcı, tıklama kimyası yoluyla maleimid fonksiyonel gruplarıyla reaksiyona girer ve mikrokapsüllerin etrafında bir hidrojel kabuğunun oluşmasına neden olur. Enkapsülasyon teknolojimiz, saniyede 10 kapsül hızında 400 μm çapında kapsüller üretti. Ortaya çıkan kapsüller, bir hidrojel kabuğa ve tek hücrelerin agregalara hızla toplanmasına ve sferoidler oluşturmasına izin veren sulu bir çekirdeğe sahipti. Kapsülleme işlemi, hPSC'lerin yaşayabilirliğini olumsuz yönde etkilemedi, kapsüllemeden 3 gün sonra% >95 canlılık gözlendi. Karşılaştırma için, katı jel mikropartiküllerinde (sulu bir çekirdek olmadan) kapsüllenmiş hPSC'ler sferoidler oluşturmadı ve kapsüllemeden 3 gün sonra% <50 canlılığa sahipti. Çekirdek-kabuk mikrokapsülleri içindeki hPSC'lerin küresel oluşumu, kapsüllemeden sonraki 48 saat içinde meydana geldi ve sferoid çap, hücre aşılama yoğunluğunun bir fonksiyonuydu. Genel olarak, bu protokolde açıklanan mikroakışkan kapsülleme teknolojisi, hPSC'lerin kapsüllenmesi ve sferoid oluşumu için çok uygundu.

Yukarıda belirtilen protokolü izleyerek, okuyucu mikroakışkan cihazlar üretebilecek ve hücre taşıyan mikrokapsüller üretebilecektir. Şekil 3A , mikroakışkan damlacık üretimi kullanılarak üretilen optimal ve yetersiz mikrokapsüllerin örneklerini göstermektedir. PEG-4-Mal'ın farklı formülasyonları, farklı morfolojilere sahip kapsüllerle sonuçlandı - buruşuk kapsüller zayıf jelasyon, düşük mekanik bütünlük ile ilişkiliydi ve karıştırılmış bir biyoreaktörde ekime dayanamadı. PEG içeriğinde gözle...

Bu makalede, insan pluripotent kök hücrelerinin (hPSC'ler) koaksiyel akış odaklama cihazı kullanılarak kapsüllenmesi açıklanmaktadır. Bu mikroakışkan kapsülleme teknolojisinin hPSC sferoidlerinin verimli bir şekilde oluşturulmasını sağladığını gösteriyoruz.

İnsan Pluripotent Kök Hücre Sferoidlerini Taşıyan Core-Shell Mikrokapsüllerinin Mikroakışkan İmalatı

Three-dimensional (3D) or spheroid cultures of human pluripotent stem cells (hPSCs) offer the benefits of improved differentiation outcomes and ...

Alan, bu kültürün oluşturduğu gelişmiş pluripotens ve farklılaşma potansiyeli nedeniyle insan pluripotent kök hücrelerinin 3D kültürlerine ilgi duyduğu düşünülmektedir. İnsan pluripotent kök hücre sferoidlerinin tekrarlanabilir oluşumuna yol açan kapsülleme stratejimizi tanımladık. Kapsüllendikten sonra, bu kök hücre sferoidleri, çok kuyulu plakalarda veya karıştırılmış biyoreaktörlerde ekime uygundur.Kapsülleme stratejimiz, pestilansın hayatta kalma kabiliyetini ve küresel oluşumun yüksek verimliliğini optimize etmektir. Kapsüllenmiş sferoidler, karıştırma veya sallanma ile ilişkili kesme veya mekanik enerjiye karşı korunur. Hücresel tedaviden türetilen kök hücrelerin geliştirilmesi, kısmen istenen hücresel ürünü ölçeklenebilir, verimli ve uygun maliyetli bir şekilde üretme yeteneğine bağlıdır.Burada açıklanan kapsülleme teknolojisi bu yönde atılmış bir adımı temsil etmektedir. Burada açıklanan kapsülleme teknolojisi muhtemelen diğer hücrelerden diğer pluripotent kök hücrelere kadar çeşitli hücre tiplerinin 3D yetiştirilmesi için geçerli olacaktır. 4,8 gram 35 kilodalton PEG, 10,2 mililitre yoğunluk gradyanı ortamı ve 19,8 mililitre DMEM/F-12 ortamını karıştırarak 30 mililitre iki kat çekirdek stok çözeltisi hazırlayarak başlayın.Ardından bu çekirdek çözeltiyi 0,22 mikrometrelik bir şırınga filtresi kullanarak filtreleyin. Daha sonra, 48.5 mililitre mineral yağ ve 1.5 mililitre yüzey aktif maddeyi karıştırarak yüzde 3 yüzey aktif madde ile 50 mililitre mineral yağ hazırlayın. Daha sonra çözeltiyi 0.22 mikrometrelik bir şırınga filtresinden geçirerek sterilize edin.Daha sonra, metin makalesinde açıklandığı gibi 1 molar DTT, 1 molar TEA ve yüzde 1 PF127 çözeltileri hazırlayın. Daha sonra 4.5 mililitre mineral yağı yüzde 3 yüzey aktif madde ve 300 mikrolitre 1 molar DTT ile karıştırarak bir çapraz bağlayıcı emülsiyonu hazırlayın. Çözeltiyi iki dakika boyunca vorteksledikten sonra, 20 santigrat derecede ultrasonik bir banyoda 45 ila 60 dakika boyunca sonikasyon yapın ve 27 gauge iğne ile 5 mililitrelik bir şırıngaya yükleyin.Daha sonra, mineral yağı yüzde 0,5 yüzey aktif madde ile 27 gauge iğneli 5 mililitrelik bir şırıngaya yükleyerek koruyucu yağ çözeltisi hazırlayın. Kabuk çözeltisini hazırlamak için, 400 mikrolitre DPBS'ye 32 miligram PEG4 maleimid ekleyin. Ardından, 6 mikrolitre 1 molar TEA ekleyin.Çözeltiyi 2 dakika boyunca vorteksleyin ve bir sıkma filtresinden santrifüj yapın. 27 gauge iğne ile 1 mililitrelik bir şırıngaya yüklemeden önce çözeltiyi rocker üzerinde 30 dakika karanlıkta tutun. Son olarak, 200 mikrolitrelik ortamda 20 milyon hPSC'yi yeniden askıya alarak nihai çekirdek çözümünü hazırlayın ve 30 mikrolitre yüzde 1 PF127 ve 200 mikrolitre 2X çekirdek çözeltisi ile karıştırın.1 mililitrelik bir şırıngaya küçük bir karıştırıcı çubuğu yerleştirin. Ardından, çekirdek çözeltisi içeren hücreyi 27 gauge iğne ile şırıngaya yükleyin. Bağlı PDMS damlacık cihazını, 4 adet 20 santimetre uzunluğunda ve 1 adet 5 santimetre uzunluğunda giriş mikrotüpünü, 1 adet 10 santimetre çıkış tüpünü ve 6 adet 0,5 santimetre montaj tüpünü mikrop öldürücü ışık kaynağının altına sterilizasyon için 30 dakika boyunca yerleştirerek başlayın.Şimdi 4 adet 20 santimetre uzunluğundaki giriş mikrotüplerini forseps kullanarak kabuğa, yağa, çapraz bağlayıcı emülsiyonuna ve ayrışma cihazı girişlerine sığdırın. Ardından, tüplerin karşı ucunu karşılık gelen çözelti ile şırınga iğnesine yerleştirin. Bu arada, mikroakışkan cihazların çekirdek girişini ve ayrışma cihazlarının çıkışını 5 santimetrelik bir mikrotüp ile bağlayın.Akışkan çıkış portuna 1 çıkış tüpü yerleştirin ve karşı ucu bir toplama haznesine yerleştirin. Ardından, cihazı mikroskop aşamasına yerleştirin ve herhangi bir hareketi önlemek için boruyu takın. Akış denetimi için mikroskobu cihaz nozuluna hizalayın ve odaklayın.Her şırıngayı farklı şırınga pompalarına yerleştirin ve uygun şekilde sabitleyin. Her pompayı üreticinin protokollerine göre metin yazısında belirtilen akış hızlarına göre programlayın ve tüm pompalarda akışı başlatın. Her sıvının cihaza girmesini bekleyin ve kalan havayı dışarı iterken kanalları doldurun.Kapsül oluşumu stabilize edildiğinde, toplama tüpünün karşı ucunu 5 mililitre mTeSR ortamı içeren yeni bir konik tüpe yerleştirin. Yeterli kapsül toplandıktan sonra, 10 dakika boyunca inkübe edin. Yağ fazında bulunan kapsüller, tüpün tepesinde olacak ve tüpe hafifçe dokunulduğunda dibe çökelecektir.Kapsülleri almak için, toplama tüpünden yağı çıkararak başlayın. Ardından, kapsülleri 100 mikrometre gözenek boyutunda bir hücre süzgeci üzerine yerleştirin ve süzgeci bol miktarda ortamla yıkayın. Filtreyi 6 delikli bir kültür plakasının bir kuyucuğunun üstüne ters çevirin ve filtreden 2 mililitre ortam geçirerek mikrokapsülleri toplayın.Kök hücre kapsüllerini, yüzde 5 karbondioksit ile 37 santigrat derecede 6 kuyucuklu bir kültür kabında inkübe edin. Kapsülleri bir hücre süzgeci filtresinde toplayarak, fazla medya ile yıkayarak ve 2 mililitrelik ortama sahip 6 delikli plakalarda yeni bir kuyuya yeniden askıya alarak medyayı her gün değiştirin. 2 mililitre steril DPBS'ye 2 mikromolar Ethidium Homodimer-1'in 4 mikrolitresini ve 4 mikromolar Calcein-AM çözeltisinin 1 mikrolitresini ekleyerek canlılık testi yapın.Tam karıştırma sağlamak için vorteks. Bir hücre süzgeci üzerinde yaklaşık 100 mikrokapsül toplayın ve kapsüllerden orta difüzyona izin vermek için steril DPBS ile durulayın. Ethidium Homodimer-1 ve kalsein içeren hazırlanmış çözeltinin 1 mililitresini kullanarak 12 kuyucuklu bir kültür plakasında tekrar toplayın ve 20 dakika boyunca 37 santigrat derecede inkübe edin.Hücreleri floresan mikroskobu altında görselleştirin. Mikroakışkan damlacık üretimi kullanılarak üretilen optimal ve yetersiz mikrokapsüller, kabuktaki PEG4-Maleimide içeriğinin bir fonksiyonu olarak kapsül morfolojisinde farklılıklar göstermiştir. Parlak kenarlı pürüzsüz kapsüller, istenen mekanik bütünlük ile ilişkilidir.Boncukların kapsüllerin merkezinde toplanması, çekirdeğin sulu olduğunu ve boncukların hareket etmekte serbest olduğunu gösterir. Floresan anulus, bir hidrojel kabuğun varlığını gösterdi ve kabuk kalınlığını belirlemek için kullanıldı. H9 hücrelerinin kapsüllenmesinden 6 saat sonra canlı veya ölü boyamalar, hücrelerin kapsülleme çalışmaları sırasında rutin olarak yüzde 95'ten fazla canlılık elde ettiğini göstermiştir.Enkapsüllenmiş ve kapsüllenmemiş sferoidlerin büyüme hızı ve farklılaşma potansiyeli karşılaştırıldığında. Kapsülleme işleminin hPSC'ler üzerinde herhangi bir olumsuz etkisinin olmadığı belirlenmiştir. Lütfen unutmayın, çekirdek kabuk ve yağ akışları arasında optimum akış hızı oranının belirlenmesi önemlidir.Bunu yapmamak, mekanik olarak güçlü olmayacak ve kullanım sırasında yırtılabilecek kapsüllere neden olabilir. Bu kapsülleme tekniğinin insan pluripotent kök hücreleri dışındaki hücre tipleri için olduğunu belirtmek isteriz. Benzer bir strateji kullanarak, öncelikle hipotezleştirilmiş, kanser hücre hatlarını ve mezenkimal kök hücreleri kapsülledik.Şu anda, ekibimiz yeni nesil mikro yakalamaları geliştiriyor. Bu mikro yakalamalar biyoaktiftir ve kök hücrelerin kapsüllenmiş farklılaşması için çapraz faktörlerle yüklenebilir.

microfluidic-fabrication-core-shell-microcapsules-carrying-human

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Biyomühendislik

Biz, üç-boyutlu hücre kültürü için gözenekli polimer cips mikroimalat için iki süreç sunuyoruz. Bunlardan birincisi, solvent buhar kaynak işlemi ile birlikte sıcak kabartma. Ikincisi ise, kısa bir süre önce geliştirilen iyon izleme teknolojisi ile üretim önemli bir basitleştirme giden kombine microthermoforming süreci kullanır.

Üç boyutlu Hücre ekimi için Chip-ölçekli Yapı iskeleleri mikroimalat

Kanser kök hücre göçü araştırılması için bir bölme oluşturan mikroakışkan cihaz tarif edilmektedir. Bu yeni platform canlı hücresel mikroçevrede oluşturur ve canlı hücre lokomosyon mikroskobik görselleştirme sağlar. Son derece hareketli kanser hücrelerinin potansiyel olarak daha etkin gelecekteki tedaviler neden agresif infiltrasyon moleküler mekanizmaları, çalışma izole edilmiştir.

Bölümlere Mikroakışkan Cihazlar ve Canlı Hücre Görüntüleme kullanma Kanser Kök Hücre Göç Değerlendirilmesi

Pluripotent kök hücreleri (PS hücreleri) bir koaksiyel nozul kullanarak aljinat hidrojel kapsüllerine kapsüllemek için bir yöntem oluşturduk.  Bu, hücrelerin aşırı toplanmasını önler ve süspansiyon kültüründeki hücrelerin yaşadığı kesme stresini sınırlar.  Teknik, PS hücrelerinin seri üretiminin yanı sıra kök hücre nişi üzerine yapılan araştırmalara da uygulanabilir.

Bir Koaksiyel Memesini kullanma Pluripotent Kök Hücre Aljinat Encapsulation

Bu el yazması karmaşık yüksek maliyetli İmkanları için gerek kalmadan içbükey microwells imalatı, sağlam bir yöntem sunar. Manyetik kuvvet, çelik boncuk ve bir delik aracılığıyla dizi kullanarak, birkaç yüz microwells 3 cm x 3 cm polydimethylsiloxane (PDMS) substrat kuruldu.

Eşleştirilmiş boncuk ve mıknatıs dizi Microwells değişken içbükey geometrileri ile kalıplama için

Biz hücre küresel leri yetiştirmek için bir motor destekli santrifüj mikroakışkan cihaz satıyoruz. Bu cihazı kullanarak, tek veya birden fazla hücre tiplerinin küresel leri yüksek yerçekimi koşullarında kolayca cokültüre edilebilir.

Çok Hücreli Üç Boyutlu Spheroidler Üretmek için Lab-on-a-CD Platformu

Burada, önceden ayırt edilmiş insan kaynaklı pluripotent kök hücre türevli kardiyomiyositler, kardiyak fibroblastlar ve endotel hücrelerinden oluşan 3D kendi kendine monte edilmiş kardiyak mikrotissue dizileri oluşturmak için kullanımı kolay bir metodolojiyi açıklıyoruz. Kardiyak mikrotissues üretmek için teknik gerektiren bu kullanıcı dostu ve düşük hücre, hastalık modellemesi ve ilaç gelişiminin erken aşamaları için uygulanabilir.

İnsan iPSC Türevli Kardiyomiyositler, Kardiyak Fibroblastlar ve Endotel Hücreleri Kullanılarak 3D Kardiyak Mikrotissue Dizilerinin İmalatı

Protokol, standart bir floresan mikroskobunda oksijenasyonlarının ve hücre ölümlerinin çok parametrik analizini kullanarak biyobaskı için yüksek verimli sferoid üretimini tanımlar. Bu yaklaşım, sferoidlerin yaşayabilirliğini kontrol etmek ve 3D doku, tümör mikroçevresi ve başarılı (mikro) doku biyofabrikasyonunun modellenmesinde önemli olan standardizasyonu gerçekleştirmek için uygulanabilir.

Çok Hücreli Sferoidlerin Uygun Fiyatlı Oksijen Mikroskobu Destekli Biyofabrikasyonu

Burada, hücre süspansiyonunu tohumlamak için otomatik bir pipetleme sistemi kullanarak adipoz türevli stromal/kök hücre (ASC) sferoidlerinin büyük ölçekli üretimini açıklıyoruz, böylece küresel boyut ve şeklin homojenliğini sağlıyoruz. Bu ASC sferoidleri, 3D biyobaskı yaklaşımları için yapı taşları olarak kullanılabilir.

3D Biyobaskı için Adipoz Türevi Kök Hücre Sferoidlerinin Büyük Ölçekli, Otomatik Üretimi

Mevcut protokol, 3D baskılı damga benzeri bir cihaz kullanarak uygun maliyetli bir şekilde büyük ölçekte doku sferoidleri üretmek için bir tekniği açıklamaktadır.

3D baskılı damga benzeri bir cihaz aracılığıyla doku sferoidlerinin üretilmesi

Burada, yüksek verimli, çok boyutlu bir formatta kültürlenmiş, insan kaynaklı pluripotent kök hücre kaynaklı kardiyomiyositlerden kardiyak sferoidlerin (CSs) üretilmesi ve kriyoprezervasyonu için bir dizi protokol sunulmaktadır. Bu üç boyutlu model, hastalık modellemesi, yüksek verimli taramalar için sağlam bir platform olarak işlev görür ve kriyoprezervasyondan sonra işlevselliğini korur.

İnsan Kaynaklı Pluripotent Kök Hücre Kaynaklı Kardiyak Sferoidlerin Üretimi, Yüksek Verimli Taraması ve Biyobankacılığı

Burada, tümör sferoidlerinin hızlı, sağlam ve ucuz bir şekilde üretilmesini ve ardından hidrojel kapsüllenmesini sağlayan bir protokol sunuyoruz. Özel ekipman gerektirmediği için yaygın olarak uygulanabilir. Sferoid-matriks etkileşimlerini araştırmak ve in vitro doku fizyolojisi veya patoloji modelleri oluşturmak için özellikle yararlı olacaktır.

Sferoid-Matriks Etkileşimlerini İncelemek için Polietilen Glikol Hidrojellerde Tümör Sferoid Üretimi ve Kapsüllenmesi

Keşfedin, mikroakışkan teknoloji ile insan pluripotent kök hücre sferoidlerini koruyan core-shell mikrokapsül üretimini. Bu yöntem, ölçeklenebilir hücre tedavileri için yüksek verimli 3D kültür sağlar.

İnsan Pluripotent Kök Hücre Sferoidlerini Taşıyan Core-Shell Mikrokapsüllerinin Mikroakışkan İmalatı

Daha fazla video keşfet