DNA Metiltransferaz İnhibitörlerini Taramak için Sürekli Floresan Bazlı Endonükleaz Bağlantılı DNA Metilasyon Testi
August 5th, 2022
DNA metiltransferazlar potansiyel kanser ilaç hedefleridir. Burada, DNA metiltransferaz inhibisyonu için küçük molekülleri değerlendirmek için bir protokol sunulmaktadır. Bu tahlil, DNA metilasyonunu floresan üretimine bağlamak için bir endonükleaz kullanır ve enzim aktivitesinin gerçek zamanlı olarak izlenmesini sağlar.
Bizimki gibi sağlam bir plaka okuyucu testi, potansiyel metiltransferaz inhibitörlerinin ilk taraması için çok yararlıdır. Gerçek zamanlı olarak veri toplama yeteneği, sürekli endonükleaz bağlantılı tahlilin büyük bir avantajıdır. Buz üzerindeki mikrosantrifüj tüplerinde ayrı ayrı 20 mikromolar ve 50 mikromolar bileşik içeren tahlil koşullarının 600 mikrolitresini hazırlayarak başlayın.
Bunu yapmak için, son 1X metilasyon tamponu konsantrasyonunu elde etmek için her tüpe çift damıtılmış su ve 5X metilasyon tamponu ekleyin. Daha sonra, her numuneye mililitre sığır serum albümini veya BSA başına 3.15 mikrolitre 20 miligram ekleyin. Daha sonra, her numuneye iki mikrolitre 3.15 mikromolar saç tokası DNA substratı ve 1.33 mikrolitre 4.75 mikromolar S-adenosilmetiyonin veya SAM ekleyin.
21 mikromolar veya 52.5 mikromolar nihai konsantrasyon ve eşdeğer miktarda dimetil sülfoksit veya DMSO elde etmek için uygun numunelere inhibitör ekleyin ve çözeltileri üç saniye boyunca dakikada 3.000 rotasyonda vorteksleme ile karıştırmadan önce bir kontrol numunesine ekleyin. Ardından, çözeltinin tüpün dibinde toplandığından emin olmak için numuneleri bir masa masası mini santrifüjünde 1.200 kat G'de birkaç saniye döndürün. Aliquot Her tahlil çözeltisinin 95 mikrolitresi, siyah bir yarım alan 96 kuyu plakasında altı ardışık kuyuya dönüşür.
Mikrosantrifüj tüplerinde 75 mikrolitre Gla I veya DNMT1 artı Gla I enzim çözeltisini, daha önce açıklandığı gibi bir kerelik tamponun son konsantrasyonuna hazırlayın. Daha sonra, mikrolitre başına 0.16 birimlik bir nihai konsantrasyon elde etmek için her çözeltiye mikrolitre Gla I başına 1.2 mikrolitre 10 birim ekleyin. 40 nanomolar'lık son konsantrasyon için DNMT1 artı Gla I çözeltisine DNMT1'den yoksun beş mikromolar RFTS'den 0.6 mikrolitre ekleyin.
Nazik karıştırmadan sonra, çözeltinin tüpün dibinde toplandığından emin olmak için numuneleri 1.200 G'de bir masa üstü mini santrifüjde birkaç saniye döndürün. Daha sonra, her enzim çözeltisinin 12 mikrolitresini, konik tabanlı 96 kuyucuklu bir plakada altı kuyucuk içine aliquot. DNA örneğinin metilasyon testi için, plaka okuyucuyu 37 santigrat dereceye kadar önceden ısıtın.
Ardından, tahlil çözeltilerini içeren siyah plakayı plaka okuyucuya yerleştirin. Plakayı 425 CPM'de salladıktan sonra, floresanı 485 nanometre uyarma dalga boyu ve 528 nanometre emisyon dalga boyu ile ölçün. Ardından, plakayı beş dakika boyunca 37 santigrat derecede inkübe edin.
Tahlil plakasını plaka okuyucusundan çıkarın ve her bir oyuğa beş mikrolitre enzim çözeltisi ekleyin, ardından çözeltiyi yukarı ve aşağı pipetleyerek karıştırın. Plakayı plaka okuyucuya yerleştirin ve floresanı 30 dakika boyunca her 53 saniyede bir kaydetmeden önce plakayı sallayın. Her koşul için üçlü Gla I kontrol tahlillerinin ortalama floresansını elde edin ve RFTS eksikliği olan DNMT1 varlığında elde edilen üçlü izlerden kontrol reaksiyonu tepsileri içeren ortalama Gla I değerini çıkarın.
Ardından, düzeltilen çoğaltmalar için ortalamanın ortalama ve standart hatasını belirleyin. Ortalama düzeltilmiş reaksiyon izini çizin ve başlangıç hızını belirlemek için ilk doğrusal kısmı bir çizgiye sığdırın. Bir bileşiğin varlığında gözlenen hızı, kontrol reaksiyonunu içeren DMSO'da gözlenen hıza bölerek ve 100 ile çarparak yüzde aktivitesini belirleyin.
Süreksiz bir endonükleaz kuplajlı tahlilin sonuçları, tamamen metillenmiş ürün DNA'sının bölünmeden korunduğunu ve RFTS'den yoksun DNMT1'in aktif olduğunu ve hemimetillenmiş substrat DNA'sını metilleştirebildiğini doğruladı. Floresan bazlı tahlilde, Gla I'in yokluğunda, DNMT1 veya tamponun eklenmesi tek başına arka plan floresansını etkilemedi. Gla I'in tüm tahlillere daha sonra eklenmesi, yalnızca DNMT1 içeren tahlillerde floresan üretimi ile sonuçlandı.
RFTS eksikliği olan DNMT1 ve Gla I'in üç tahlil için eşzamanlı olarak eklenmesi, sağlam floresan üretimi ile sonuçlandı. Gla I'in eklenmesi tek başına floresan üretmedi. Potansiyel inhibitörleri taramak için, RFTS'den yoksun DNMT1'in DNA metilasyon aktivitesi, 20 ve 50 mikromolar konsantrasyonlarda DMSO, bileşik bir, bileşik iki veya bileşik üç varlığında incelenmiştir.
Bu birleştirilmiş tahlilde floresan üretimini azaltan bileşikler daha da doğrulanmalıdır. Bileşiklerin bağlantı enzimini inhibe etmediğinden emin olmak önemli bir sonraki adımdır.
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
Genel Bakış
Bu makale, kanser tedavisinde önemli hedefler olan DNA metiltransferazlarının potansiyel inhibitörlerini değerlendirmek için bir protokol sunmaktadır. Test, DNA metilasyonunu floresans ile bağlamak için bir endonükleaz kullanır ve enzim aktivitesinin gerçek zamanlı izlenmesini sağlar.
Çalışmanın Temel Bileşenleri
Bilim Alanı
- Sinirbilim
- Biyokimya
- Kanser Araştırmaları
Arka Plan
- DNA metiltransferazları, gen regülasyonu ve kanserde kritik bir rol oynar.
- Bu enzimlerin inhibisyonu, kanser tedavisinde terapötik faydalar sağlayabilir.
- Gerçek zamanlı testler, potansiyel inhibitörler için tarama sürecini geliştirir.
- Floresans temelli yöntemler, enzim aktivitesinin hassas tespiti için izin verir.
Çalışmanın Amacı
- DNA metiltransferaz inhibitörlerini taramak için güçlü bir test geliştirmek.
- Gelişmiş test performansı için gerçek zamanlı veri toplamayı kullanmak.
- DNA metiltransferaz aktivitesini inhibe edebilen küçük moleküllerin tanımlanmasını kolaylaştırmak.
Kullanılan Yöntemler
- Spesifik konsantrasyonlarda bileşiklerin kullanıldığı test koşullarının hazırlanması.
- Test kurulumunda sığır serum albümini (BSA) kullanımı.
- Saç tokası DNA substratı ve S-adenosilmetionin (SAM) eklenmesi.
- Floresans oluşumu yoluyla enzim aktivitesinin izlenmesi.
Ana Sonuçlar
- Test, DNA metiltransferaz aktivitesinin sürekli izlenmesini sağlar.
- Gerçek zamanlı veri toplama, geleneksel yöntemlere göre önemli bir avantaj sağlar.
- Bilekşitlerin ilk taraması, potansiyel inhibitörlerin tanımlanmasında umut verici sonuçlar gösterir.
- Yöntem, çeşitli küçük molekül kitaplıkları için uyarlanabilir.
Sonuçlar
- Geliştirilen test, DNA metiltransferaz inhibitörlerini taramak için etkilidir.
- Gerçek zamanlı izleme, sonuçların güvenilirliğini artırır.
- Bu yaklaşım, yeni kanser tedavilerinin keşfini hızlandırabilir.
Sıkça Sorulan Sorular
Executive Industry Relevance
This continuous fluorescence-based endonuclease-coupled assay enables real-time monitoring of DNA methyltransferase activity, supporting early-stage screening of small molecule inhibitors. By providing quantitative initial velocity measurements in a microtiter plate format, the method reduces reagent consumption and increases throughput for target validation campaigns. The assay’s ability to detect concentration-dependent inhibition aids in prioritizing compounds with mechanistic relevance to epigenetic dysregulation in cancer.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of DNMT1 inhibition kinetics to validate epigenetic targets in oncology pipelines.
- Operational Value: Supports rapid assessment of small molecule effects on enzyme activity using fluorescence readouts in a plate-based format.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates real-time, continuous data to distinguish true inhibitors from assay artifacts in primary screens.
- Operational Value: Compatible with standard plate readers and microtiter plates, enabling scalable screening of compound libraries.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Links biochemical inhibition of DNMT1 to downstream epigenetic effects, supporting mechanistic de-risking of lead candidates.
- Operational Value: Provides a reproducible platform for hit-to-lead progression where target engagement is a key decision criterion.
Pipeline & Workflow Integration
The assay fits within the early discovery workflow, positioning after target confirmation and before lead optimization, where biochemical validation of target modulation is essential.
- Discovery Biology: Facilitates hypothesis testing of DNMT1 inhibition as a mechanism for altering DNA methylation patterns in disease models.
- Screening: Enables primary screening of compound libraries with real-time kinetic readouts to identify active molecules.
- Analytics: Delivers initial velocity and percent activity outputs that allow quantitative comparison of inhibitor potency across conditions.
- Translational Research: Supports continuity from enzymatic inhibition to cellular epigenetic outcomes when paired with downstream validation assays.
- Enterprise Reuse: Can be adapted for screening other DNMT isoforms or methyltransferase targets using the same endonuclease-coupled fluorescence principle.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in target modulation by providing direct, real-time measurement of enzyme activity changes.
- Operational Value: Reduces reagent use and assay time through miniaturized, continuous monitoring in a 96-well format.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions by distinguishing specific DNMT1 inhibitors from non-specific fluorescence interferents early in screening.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of compounds demonstrating concentration-dependent, mechanism-consistent inhibition.
Implementation Considerations
- Requires expertise in enzymology and fluorescence-based assay design to interpret kinetic traces and control for background signals.
- Dependent on access to a plate reader capable of temperature control and timed fluorescence excitation at 485 nm and emission at 528 nm.
- Necessitates standardization of reagent preparation, including hemimethylated DNA substrate, SAM, BSA, and Gla I endonuclease, to ensure assay reproducibility.
- Requires validation that test compounds do not inhibit the coupling enzyme Gla I or interfere with fluorescence independently.
- Limited to methyltransferase activity assessment and does not directly report on cellular permeability, metabolic stability, or off-target effects.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:05
Introduction
0:24
Prepare Assay Solutions for the Screen
1:48
Prepare Enzyme Solutions for the Screen
2:52
Run the Methylation Assay and Analyze the Data
4:29
Results: Determination of Initial Velocities of DNA Methylation in the Presence and Absence of Potential Inhibitors
5:40
Conclusion
