E3 Ligases için Ubiquitin Varyant Modülatörleri Geliştirmek için Faj Ekran Kullanma
27 Ağustos 2021
Her yerde, disrrengülasyonu çok sayıda insan hastalığına karışmış kritik bir protein post-translational modifikasyondur. Bu protokol, faj ekranının, her yerde bulunmanın özgüllüğünü, verimliliğini ve kalıplarını kontrol eden E3 ligaslarının aktivitesini bağlayabilen ve modüle edebilen yeni ubiquitin varyantlarını izole etmek için nasıl kullanılabileceğini açıklar.
Faj görüntüleme sadece klinik olarak önemli enzimlerin bağlayıcı özelliklerini araştırmamıza yardımcı olmakla kalmaz, aynı zamanda bu enzimler ve ilgili hastalıklar için modülatörler geliştirir. Faj ekranı, çok çeşitli hedef proteinler için yeni bağlayıcılar geliştirmek için kullanılabilir ve diğer geleneksel görüntüleme yöntemlerine göre daha kolaydır. Bu prosedür çok fazla tekrarlayan eylem içeriyordu, bu nedenle anahtar otomatik pilot olmamak ve boyunca odaklanmak.
Tohum kültürünün 200 mikrolitresi ile 30 mililitre 2YT tetrasiklin suyu aşılayarak başlayın. Bakteriler orta kütük evresinde olana kadar 200 RPM yörünge sarsıntısı ile 37 santigrat derecede yaklaşık üç saat kuluçkaya yatırın. Kaplama solüsyonunun plakadan bir lavaboya atılması.
Kağıt havlularla hafifçe kurulayın. Ardından, iyi kaplanmış her bir kuyuya 200 mikrolitre PB arabelleği ekleyin. PB tamponu tabaktan atın ve kağıt havlularda kurulayın.
Plakanın her kaplamalı kuyusuna 200 mikrolitre pb tampon daha ekleyin. 300 RPM yörünge sarsıntısı ile oda sıcaklığında bir saat kuluçkaya yatır. Faj kütüphanesini buz üzerinde çözün, sonra PBS'deki kütüphane çeşitliliğinin 100 katını seyreltin.
Polietilen glikol sodyum klorür çözeltisini seyreltilmiş kütüphane hacminin beşte birine ekleyin ve çözeltiyi 30 dakika boyunca buz üzerinde kuluçkaya bırakın. Daha sonra, çözeltiyi 11.000 kez G'de dört santigrat derecede 30 dakika santrifüjleyin. Süpernatantı atın ve kalan süpernatantı aşağı çekmek ve faj peletini konsantre etmek için iki dakika daha santrifüjleyin.
Faj peletini analiz edilecek hedef protein başına bir mililitre PBT tamponunda hafifçe yeniden diriltin, genellikle toplamda dört. Kontrol plakasındaki her bir iyi kaplanmış faj kütüphanesine 100 mikrolitre ekleyin. 300 RPM yörünge sarsıntısı ile oda sıcaklığında bir saat kuluçkaya yatır.
PB tamponu hedef plakadan lavaboya atın ve plakayı kağıt havlularda kurulayın. Kontrol plakasındaki faj kütüphanesinin 100 mikrolitresinin tamamını hedef plakanın her kaplamalı kuyusuna aktarın. 300 RPM yörünge sarsıntısı ile oda sıcaklığında bir saat kuluçkaya yatır.
Ardından, faj kütüphanesini plakadan çıkarın ve kaplanmış kuyuları PT tamponu ile dört kez yıkayın. Plakayı ters çevirin ve son tampon damlalarını çıkarmak için bir kağıt havluya dokunun. Fajı elute etmek için her bir kaplamalı kuyuya 100 mikrolitre 0,1 molar hidroklorik asit ekleyin.
Plakayı oda sıcaklığında 300 RPM yörünge sarsıntısı ile beş dakika kuluçkaya yatırın. Bundan sonra, her iyi kaplanmış kuyuya 12,5 mikrolitre pH 11 molar tris hidroklorür ekleyerek pH'ı nötralize edin. Elde edilen fajı sekiz kuyudan tek bir 1,5 mililitrelik mikrosantrifüj tüpüne aktarın.
Çözeltileri homojen hale getirmek ve kuyulardan gelen tüm sıvıyı aspire etmek için aktarım sırasında pipet yukarı ve aşağı. Son konsantrasyonu yapmak için elde edilen fajlara%10 BSA ekleyin %1 Mikrosantrifüj tüpünü dört santigrat derecede saklayın. Bu birinci raunt çıktısı.
Bir ağar plakasından izole edilmiş bir E.coli kolonisi ile beş mililitre 2YT tetrasiklin tohum kültürünü aşılayarak bir sonraki seçim turu için faj girişini kültleme için bir tohum kültürü hazırlayın. 200 RPM yörüngesel sarsıntı ile 37 santigrat derecede bir gecede kuluçkaya yatır. Hedef proteini uygun miktarda PBS ile iki ve üç tüplü turlarda seyreltin.
İkinci ve üç tüplü mermilerin içeriğinin yarısını alın ve hedef protein başına dört kuyuyu bir sonraki tur için 96 kuyu bağlama plakasında kapla. Daha sonra, üç mililitre orta kütük faz hücresini aşılamak için yuvarlak bir çıkışın yarısını kullanın. 200 RPM yörüngesel sarsıntı ile 30 dakika boyunca 37 santigrat derecede kuluçkaya yatır.
Mililitre başına 10 milyar PFU'luk son konsantrasyona M13KO7 yardımcı faj ekleyin. 200 RPM yörünge sarsıntısı ile bir saat boyunca 37 santigrat derecede tekrar kuluçkaya yatır. Bir saat sonra, kültürün üç mililitresinin tamamını 30 mililitre 2YT karbenisilin kanamycin çözeltisine aktarın.
200 RPM yörünge sarsıntısı ile 37 santigrat derecede bir gecede büyüyün. UBE4B'ye karşı her yerde bulunan varyant seçimi için temsili sonuçlar burada gösterilmiştir. UBV'ler en yüksek frekanstan en düşük frekansa sipariş edildi.
Diziler, UBV'deki çeşitlendirilmiş ubiquitin bölgesini tüm randomize kalıntılarla temsil eder. Bağlayıcıların yabani tip hedef proteine, mutasyona uğramış hedef proteine ve hedef dışı proteinlere göreli bağlayıcılığı enzime bağlı immünorbent tahlilleri veya ELISA ile ölçülür. Tüm ELISA absorbansları 96 ortalama BSA ELISA puanına ve 96 ortalama GST ELISA puanına göre normalleştirildi.
Koyu yeşil, daha güçlü bağıl bağlamayı temsil eder. Hedef protein GST etiketli olduğundan GST spesifik olmayan bağlama için bir kontrol olarak dahil edildi. ELISA sonuçları grafiksel olarak burada sunulmaktadır.
x ekseni UBV'leri, y ekseni ise karşılık gelen normalleştirilmiş absorbansı temsil eder. Bu prosedürü denerken, hidroklorik asidi ekledikten sonra çözeltiyi plakaya atmamanız önemlidir. Fajlar artık çözelti içinde askıya alınmıştır ve bunları saklamak istersiniz, böylece sonraki zenginleştirme son analizlerini veya her ikisini de gerçekleştirebilirsiniz.
Bu işlemi takiben UBV frekanslarını belirlemek için sıralama yapılmalıdır. ELISAs ve IC50 tahlilleri sırasıyla bağlayıcı etkileri ve inhibitör etkileri belirlemek ve ayrıca hangi UBV'lerin daha fazla karakterize edileceğini belirlemeye yardımcı olmak için yapılabilir.
Tam transkripti görüntüleyin ve binlerce bilimsel videoya erişin
Genel Bakış
Bu makale, ubikuitinasyonda yer alan E3 ligazlarını modüle edebilen yeni ubikuitin varyantlarını izole etmek için faj gösterimi kullanımını ele almaktadır. Ubikuitinasyon, çeşitli insan hastalıkları ile bağlantılı önemli bir post-translasyonel modifikasyondur.
Çalışmanın Temel Bileşenleri
Bilim Alanı
- Sinirbilim
- Biyokimya
- Protein Mühendisliği
Arka Plan
- Ubikuitinasyon, protein bozunumu ve hücresel süreçleri düzenlemek için esastır.
- Ubikuitinasyonun bozulması çeşitli hastalıklar ile ilişkilidir.
- Faj gösterimi, protein etkileşimlerini keşfetmek için güçlü bir tekniktir.
- Bu yöntem, enzimler için spesifik modülatörlerin geliştirilmesine olanak tanır.
Çalışmanın Amacı
- Faj gösterimi kullanarak yeni ubikuitin varyantlarını izole etmek.
- Bu varyantların E3 ligaz aktivitesini nasıl etkileyebileceğini anlamak.
- Hastalık bağlamlarında ubikuitinasyon modülasyonunun etkilerini keşfetmek.
Kullanılan Yöntemler
- 2YT tetrasiklin suyunda bakteri kültürlerinin aşılanması.
- Orbital çalkalama ile 37 derece Celsius'ta inkübasyon.
- Bağlanma testleri için faj gösterimi tekniklerinin kullanımı.
- Ubikuitin varyantlarının izolasyonu ve karakterizasyonu.
Ana Sonuçlar
- Yeni ubikuitin varyantlarının başarılı izolasyonu.
- E3 ligazlarına bağlanma özelliklerinin gösterilmesi.
- Bu varyantların ubikuitinasyon paternlerini modüle etme potansiyeli.
- Hastalık mekanizmalarında ubikuitinasyonun rolüne dair görüşler.
Sonuçlar
- Faj gösterimi, ubikuitin varyantlarını keşfetmek için etkili bir yöntemdir.
- E3 ligaz aktivitesini modüle etmek tedavi edici etkilere sahip olabilir.
- Bu bulguların klinik uygulamalarını keşfetmek için daha fazla araştırmaya ihtiyaç vardır.
Sıkça Sorulan Sorular
Executive Industry Relevance
Phage display-driven engineering of ubiquitin variants (UbVs) enables precise modulation of E3 ligases, a critical inflection point for target validation in ubiquitin-proteasome system research. This approach enhances predictive confidence in early discovery by generating high-affinity, specific binders for mechanistic de-risking and functional interrogation of E3 ligase biology. The resulting UbVs support portfolio triage and prioritization by providing robust tools for downstream assay development and translational research.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables systematic interrogation of E3 ligase function using engineered UbVs with improved affinity and specificity.
- Supports biological de-risking by isolating variants that discriminate between wildtype and mutant or off-target proteins.
- Facilitates predictive confidence in target engagement and mechanistic studies through iterative selection and enrichment.
Screening & Assay Development
- Provides validated UbVs for use in ELISA and IC50 assays to quantify binding and inhibitory efficacy.
- Enables reproducible, quantitative assessment of UbV-target interactions across multiple rounds of selection.
- Supports assay standardization and scalability for reliable compound evaluation and screening workflows.
Translational & Preclinical Research
- Aligns engineered UbVs with disease-relevant E3 ligases for translational biomarker studies when supported by downstream characterization.
- Maintains continuity from discovery through preclinical validation by enabling further functional and inhibitory profiling of selected UbVs.
- Reduces mechanistic ambiguity in preclinical models by providing specific molecular tools for pathway interrogation.
Pipeline & Workflow Integration
This phage display platform integrates from early discovery through lead identification, supporting both hypothesis testing and quantitative assay development for E3 ligase modulators.
- Discovery Biology: Iterative selection and enrichment clarify E3 ligase binding pathways and validate target engagement.
- Screening: ELISA and IC50 assays with UbVs deliver reproducible, quantitative outputs for downstream evaluation.
- Analytics: Sequencing and absorbance normalization enable robust comparison of UbV binding profiles and selection frequencies.
- Translational Research: Characterized UbVs can be advanced for further disease-relevant studies as supported by binding and inhibition data.
- Enterprise Reuse: The phage display workflow is adaptable for diverse E3 ligases and other protein targets, supporting platform scalability.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in E3 ligase target validation.
- Operational Value: Standardizes binder selection and assay development for reproducibility and scalability.
- Strategic Value: Enables informed go/no-go decisions and capital-efficient advancement of validated targets.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization and advancement of E3 ligase modulators across discovery programs.
Implementation Considerations
- Requires expertise in phage display, protein engineering, and quantitative binding assays.
- Demands access to bacterial culture, phage handling, and ELISA instrumentation.
- Necessitates cross-team standardization of selection, washing, and analytical protocols.
- Adaptable to various E3 ligases and target proteins with appropriate library design.
- Dependent on rigorous washing and selection to avoid enrichment of weak or promiscuous binders.
