E3 Ligases için Ubiquitin Varyant Modülatörleri Geliştirmek için Faj Ekran Kullanma

Faj görüntüleme sadece klinik olarak önemli enzimlerin bağlayıcı özelliklerini araştırmamıza yardımcı olmakla kalmaz, aynı zamanda bu enzimler ve ilgili hastalıklar için modülatörler geliştirir. Faj ekranı, çok çeşitli hedef proteinler için yeni bağlayıcılar geliştirmek için kullanılabilir ve diğer geleneksel görüntüleme yöntemlerine göre daha kolaydır. Bu prosedür çok fazla tekrarlayan eylem içeriyordu, bu nedenle anahtar otomatik pilot olmamak ve boyunca odaklanmak.

Tohum kültürünün 200 mikrolitresi ile 30 mililitre 2YT tetrasiklin suyu aşılayarak başlayın. Bakteriler orta kütük evresinde olana kadar 200 RPM yörünge sarsıntısı ile 37 santigrat derecede yaklaşık üç saat kuluçkaya yatırın. Kaplama solüsyonunun plakadan bir lavaboya atılması.

Kağıt havlularla hafifçe kurulayın. Ardından, iyi kaplanmış her bir kuyuya 200 mikrolitre PB arabelleği ekleyin. PB tamponu tabaktan atın ve kağıt havlularda kurulayın.

Plakanın her kaplamalı kuyusuna 200 mikrolitre pb tampon daha ekleyin. 300 RPM yörünge sarsıntısı ile oda sıcaklığında bir saat kuluçkaya yatır. Faj kütüphanesini buz üzerinde çözün, sonra PBS'deki kütüphane çeşitliliğinin 100 katını seyreltin.

Polietilen glikol sodyum klorür çözeltisini seyreltilmiş kütüphane hacminin beşte birine ekleyin ve çözeltiyi 30 dakika boyunca buz üzerinde kuluçkaya bırakın. Daha sonra, çözeltiyi 11.000 kez G'de dört santigrat derecede 30 dakika santrifüjleyin. Süpernatantı atın ve kalan süpernatantı aşağı çekmek ve faj peletini konsantre etmek için iki dakika daha santrifüjleyin.

Faj peletini analiz edilecek hedef protein başına bir mililitre PBT tamponunda hafifçe yeniden diriltin, genellikle toplamda dört. Kontrol plakasındaki her bir iyi kaplanmış faj kütüphanesine 100 mikrolitre ekleyin. 300 RPM yörünge sarsıntısı ile oda sıcaklığında bir saat kuluçkaya yatır.

PB tamponu hedef plakadan lavaboya atın ve plakayı kağıt havlularda kurulayın. Kontrol plakasındaki faj kütüphanesinin 100 mikrolitresinin tamamını hedef plakanın her kaplamalı kuyusuna aktarın. 300 RPM yörünge sarsıntısı ile oda sıcaklığında bir saat kuluçkaya yatır.

Ardından, faj kütüphanesini plakadan çıkarın ve kaplanmış kuyuları PT tamponu ile dört kez yıkayın. Plakayı ters çevirin ve son tampon damlalarını çıkarmak için bir kağıt havluya dokunun. Fajı elute etmek için her bir kaplamalı kuyuya 100 mikrolitre 0,1 molar hidroklorik asit ekleyin.

Plakayı oda sıcaklığında 300 RPM yörünge sarsıntısı ile beş dakika kuluçkaya yatırın. Bundan sonra, her iyi kaplanmış kuyuya 12,5 mikrolitre pH 11 molar tris hidroklorür ekleyerek pH'ı nötralize edin. Elde edilen fajı sekiz kuyudan tek bir 1,5 mililitrelik mikrosantrifüj tüpüne aktarın.

Çözeltileri homojen hale getirmek ve kuyulardan gelen tüm sıvıyı aspire etmek için aktarım sırasında pipet yukarı ve aşağı. Son konsantrasyonu yapmak için elde edilen fajlara%10 BSA ekleyin %1 Mikrosantrifüj tüpünü dört santigrat derecede saklayın. Bu birinci raunt çıktısı.

Bir ağar plakasından izole edilmiş bir E.coli kolonisi ile beş mililitre 2YT tetrasiklin tohum kültürünü aşılayarak bir sonraki seçim turu için faj girişini kültleme için bir tohum kültürü hazırlayın. 200 RPM yörüngesel sarsıntı ile 37 santigrat derecede bir gecede kuluçkaya yatır. Hedef proteini uygun miktarda PBS ile iki ve üç tüplü turlarda seyreltin.

İkinci ve üç tüplü mermilerin içeriğinin yarısını alın ve hedef protein başına dört kuyuyu bir sonraki tur için 96 kuyu bağlama plakasında kapla. Daha sonra, üç mililitre orta kütük faz hücresini aşılamak için yuvarlak bir çıkışın yarısını kullanın. 200 RPM yörüngesel sarsıntı ile 30 dakika boyunca 37 santigrat derecede kuluçkaya yatır.

Mililitre başına 10 milyar PFU'luk son konsantrasyona M13KO7 yardımcı faj ekleyin. 200 RPM yörünge sarsıntısı ile bir saat boyunca 37 santigrat derecede tekrar kuluçkaya yatır. Bir saat sonra, kültürün üç mililitresinin tamamını 30 mililitre 2YT karbenisilin kanamycin çözeltisine aktarın.

200 RPM yörünge sarsıntısı ile 37 santigrat derecede bir gecede büyüyün. UBE4B'ye karşı her yerde bulunan varyant seçimi için temsili sonuçlar burada gösterilmiştir. UBV'ler en yüksek frekanstan en düşük frekansa sipariş edildi.

Diziler, UBV'deki çeşitlendirilmiş ubiquitin bölgesini tüm randomize kalıntılarla temsil eder. Bağlayıcıların yabani tip hedef proteine, mutasyona uğramış hedef proteine ve hedef dışı proteinlere göreli bağlayıcılığı enzime bağlı immünorbent tahlilleri veya ELISA ile ölçülür. Tüm ELISA absorbansları 96 ortalama BSA ELISA puanına ve 96 ortalama GST ELISA puanına göre normalleştirildi.

Koyu yeşil, daha güçlü bağıl bağlamayı temsil eder. Hedef protein GST etiketli olduğundan GST spesifik olmayan bağlama için bir kontrol olarak dahil edildi. ELISA sonuçları grafiksel olarak burada sunulmaktadır.

x ekseni UBV'leri, y ekseni ise karşılık gelen normalleştirilmiş absorbansı temsil eder. Bu prosedürü denerken, hidroklorik asidi ekledikten sonra çözeltiyi plakaya atmamanız önemlidir. Fajlar artık çözelti içinde askıya alınmıştır ve bunları saklamak istersiniz, böylece sonraki zenginleştirme son analizlerini veya her ikisini de gerçekleştirebilirsiniz.

Bu işlemi takiben UBV frekanslarını belirlemek için sıralama yapılmalıdır. ELISAs ve IC50 tahlilleri sırasıyla bağlayıcı etkileri ve inhibitör etkileri belirlemek ve ayrıca hangi UBV'lerin daha fazla karakterize edileceğini belirlemeye yardımcı olmak için yapılabilir.