Sahada Mitokondriyal Enerjileri Ölçmek için Mobil Mitokondriyal Fizyoloji Laboratuvarının Geliştirilmesi
27 Ağustos 2021
Tarla lokasyonlarında yakalanan vahşi hayvanların izole mitokondrilerindeki solunum hızlarını ölçmek için mobil bir laboratuvar tasarladık ve inşa ettik. Burada, mobil bir mitokondriyal laboratuvarın tasarımını ve donanımını ve ilgili laboratuvar protokollerini açıklıyoruz.
Mobil bir mitokondriyal laboratuvarın geliştirilmesi, fizyologların çalışmalarını sahaya taşımalarına olanak tanır ve sonuç olarak, hayvanların sergilediği büyüleyici çeşitlilikteki enerjik zorlukları değerlendirebilirler. Esaret birçok hayvan için streslidir, bu nedenle mobil bir laboratuvarla artık hayvanları laboratuvara geri getirmek yerine laboratuvarı hayvanlara götürebiliriz. Sahada mitokondriyal solunumu izole etme ve ölçme yeteneği ile, öncelikle biyotıp tarafından kullanılan teknikler artık ekolojik ve evrimsel bağlamda kullanılabilir.
Mobil laboratuvarı düz bir zemine park ederek başlayın, ardından jeneratörü çalıştırın ve aracı düzleştirin. Ekipmanı kurmadan önce sürgüyü uzatın. Mitokondriyal solunum odalarını, üreticinin talimatlarına göre istenen deney sıcaklığına ve mevcut barometrik basınca göre kurmaya ve kalibre etmeye devam edin.
Kıyılmış dokuyu 50 mililitrelik bir santrifüj tüpüne aktarmak için beş mililitrelik bir pipet ucu kullanın ve dokuyu beş saniye boyunca% 50 güçte bir bıçakla homojenize edin. Dokuyu sindirmek için, yedi dakika boyunca ıslak kasın gramı başına beş miligram proteaz ekleyin ve çözeltiyi her 30 saniyede bir karıştırın. BSA içeren eşit hacimde izolasyon tamponu ekleyerek reaksiyonu sonlandırın.
Daha sonra, homojenatı 500 G'de 10 dakika santrifüjleyin, daha sonra süpernatanı kesilmiş beş mililitrelik bir pipet ucu kullanarak çift katmanlı tülbentten temiz bir 50 mililitrelik santrifüj tüpüne aktarın, ardından filtrelenmiş süpernatanı 3.500 G'de 10 dakika santrifüjleyin kahverengi bir mitokondriyal peleti çökeltmek için. Süpernatanı attıktan sonra, santrifüj tüpüne BSA içeren aynı hacimde izolasyon tamponu ekleyin ve mitokondriyal peleti santrifüj tüpünün duvarlarından nazikçe çalıştırarak mitokondriyal peleti esnek bir kazıyıcı ile yeniden süspanse edin, ardından tüpü 3, 500 G'de 10 dakika santrifüjleyin. Santrifüjleme adımını daha önce açıklandığı gibi tekrarlamak için peleti BSA olmadan izolasyon tamponunda yeniden süspanse edin.
İkinci santrifüjlemeden sonra, mitokondriyal peleti temiz, esnek bir kazıyıcı ile yeniden süspansiyon tamponunda yeniden süspanse edin ve yeniden süspanse edilmiş mitokondriyi kesilmiş bir mililitre pipet ucuna sahip bir Dounce homojenizatöre aktarın. Homojenizatör ile mitokondriyal süspansiyonu dört ila beş geçişle dikkatlice homojenize edin. Homojenize mitokondriyal süspansiyonu etiketli iki mililitrelik bir mikrosantrifüj tüpüne aktarmak için yeni kesilmiş bir mililitrelik pipet ucu kullanın.
Kompleks bir substratın mitokondriyal solunum ölçümleri için, mitokondriyal solunum odasına 945 mikrolitre solunum tamponu ekleyin. Tampon sıcaklığı 37 santigrat derecede tutulduğunda karıştırıcının döndüğünden emin olun. Hazneyi üst kısmıyla kapatın ve ardından veri toplamayı kaydetmeye başlayın.
Oksijen konsantrasyonu stabilize olduktan sonra, hazneye 20 mikrolitre mitokondriyal süspansiyon ekleyin ve kapağı yerleştirin. Yazılımda, mitokondrinin odaya eklendiğini belirtin. Tek tek şırıngalarla hazneye her biri bir molar glutamat, 200 milimolar malat ve 200 milimolar piruvattan 10 mikrolitre ekleyin ve yazılımda eklenen substratları belirtmeden önce sinyalin stabilize olmasını bekleyin.
Hazneye beş mikrolitre adenozin difosfat veya ADP eklemek için ayrı bir şırınga kullanın. Yazılımda eklenen ADP'yi belirtin ve üçüncü durumun hızlı oksijen tüketimini gözlemleyin. Üçüncü durum solunumu ve mitokondriyal oksijen tüketimi, dördüncü durum solunumunu belirtmek için dört dakika boyunca yavaşladıktan sonra, kaydı sonlandırın ve veri dosyasını kaydedin.
Karmaşık iki substrat için, odaya 963 mikrolitre solunum tamponu ekleyerek prosedürü tekrarlayın. 20 mikrolitre mitokondriyal süspansiyon ekledikten sonra, ayrı şırıngaları kullanarak odaya sırayla mikrolitre rotenon başına iki mikrolitre dört mikrogram ve 10 mikrolitre 500 milimolar süksinat ekleyin. Sinyal stabilize olduğunda, yazılımdaki alt tabaka ilavesini belirtin.
Beş mikrolitre ADP ilavesiyle, üçüncü durumun hızlı oksijen tüketimini gözlemleyin ve yazılımda ADP ilavesini belirtin. Üçüncü durum solunumu ve mitokondriyal oksijen tüketimi, dördüncü durum solunumunu belirtmek için dört dakika boyunca yavaşladıktan sonra, kaydı sonlandırın ve veri dosyasını kaydedin. Temsili sonuçlar ham mitokondriyal solunum verilerini gösterir.
Karmaşık bir alt tabakadaki üçüncü adımın dik eğimi, yüksek maksimum solunum hızını temsil eder. Mitokondrinin arka bacak iskelet kasından başarılı bir şekilde izole edilmesi, keskin dönüş ve dördüncü durumun yeni bir eğiminin stabilizasyonu ile gözlendi. Benzer bir model, karmaşık iki tahrikli mitokondriyal solunum için de gözlemlenebilir.
Mitokondrinin zayıf işleyişi, mitokondrinin karmaşık tahrikli mitokondriyal solunum için bağlanmasına neden oldu. Bununla birlikte, zayıf mitokondri işleyişinin bir başka tipik örneği, ADP'nin eklenmesinden sonra düz bir çizgi ile bağlanmamış kompleks iki mitokondriyal solunumu gösterdi ve durum dört verisini üretmek için dönüş yapmadı. Hem kompleks bir hem de kompleks iki için durum üç, durum dört ve solunum kontrol oranının veya RCR'nin sayısal değerleri, solunum ölçüm verilerinden belirlendi Toplama sırasında, gelecekte mitokondriyal yoğunluğu veya oksidatif hasarı ölçmek için kullanılmak üzere ek dokular dondurulabilir.
Ek olarak, işlemden sonra, elektron taşıma ve zincir komplekslerinin aktivitelerini ölçmek için izole edilmiş mitokondri de dondurulabilir. Sahada mitokondriyal solunumu izole etme ve ölçme kapasitesi, karmaşık yaşamın evriminde mitokondrinin rolüne ilişkin anlayışımızı geliştirmenin yolunu açacaktır.
Tam transkripti görüntüleyin ve binlerce bilimsel videoya erişin
Genel Bakış
Bu çalışma, doğal habitatlarında yabani hayvanların izole mitokondrilerindeki solunum hızlarını ölçmek için tasarlanmış bir mobil laboratuvarı tanıtmaktadır. Mobil yaklaşım, hayvanlar üzerindeki esaret stresini hafifleterek, ekolojistlerin biyomedikal teknikleri ekolojik bağlamlarda uygulamalarını sağlamaktadır.
Çalışmanın Temel Bileşenleri
Araştırma Alanı
- Fizyoloji
- Ekoloji
- Evrimsel biyoloji
Arka Plan
- Hayvan enerjetiğini anlamadaki mitokondriyal solunumun önemi
- Esaretle ilişkili stres
- Biyomedikal tekniklerin ekolojik araştırma ile birleştirilmesi
Kullanılan Yöntemler
- Alan deneyleri için mobil laboratuvar kurulumu
- Hayvan dokularından mitokondrinin izolasyonu
- Spesifik substratlar kullanılarak mitokondriyal solunum hızlarının ölçülmesi
Ana Sonuçlar
- Çeşitli koşullarda mitokondriyal solunumun başarılı izolasyonu ve ölçümü
- Substrat kullanımına dayalı mitokondriyal fonksiyondaki farklılıkların belirlenmesi
- Ekolojik anlayışa katkıda bulunan mitokondriyal davranışın kanıtı
Sonuçlar
- Mobil laboratuvar modeli, yabani hayvanlarda mitokondriyal fonksiyonları inceleme yeteneğini artırmaktadır.
- Bu yaklaşım, ekolojik ve evrimsel süreçlerde mitokondriyal rollerin daha derin anlaşılmasına katkıda bulunmaktadır.
Sıkça Sorulan Sorular
Executive Industry Relevance
Field-based measurement of mitochondrial energetics enables direct assessment of metabolic function in wild animal tissues, overcoming the confounding effects of captivity-induced stress. This mobile laboratory approach expands the translational potential of mitochondrial assays from controlled biomedical settings to ecologically relevant environments. The capability supports more predictive and representative data for early discovery and mechanistic de-risking in metabolic research pipelines.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables interrogation of metabolic pathways in physiologically relevant, non-laboratory conditions.
- Supports functional validation of mitochondrial targets in diverse biological systems.
- Improves predictive confidence by minimizing artifacts from animal transport and captivity.
Screening & Assay Development
- Facilitates preparation of validated mitochondrial samples for quantitative respiration assays.
- Enables reproducible measurement of state three and state four respiration rates in the field.
- Provides standardized outputs such as respiratory control ratio (RCR) for comparative analysis.
Translational & Preclinical Research
- Aligns metabolic measurements with disease-relevant or stress-adapted animal models.
- Supports continuity from ecological discovery to preclinical metabolic validation.
- Enables risk-adjusted advancement of mitochondrial targets based on field-validated function.
Pipeline & Workflow Integration
This mobile mitochondrial physiology workflow bridges early discovery and preclinical research by enabling direct, quantitative assessment of mitochondrial function in situ.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing on metabolic adaptation and pathway function in wild populations.
- Screening: Delivers reproducible, quantitative respiration data for assay development and compound evaluation.
- Analytics: Provides state three, state four, and RCR measurements for robust statistical comparison across conditions.
- Translational Research: Connects field-based metabolic phenotypes to preclinical model selection and biomarker alignment.
- Enterprise Reuse: Establishes a portable, scalable platform for mitochondrial energetics studies across diverse research settings.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in metabolic target validation.
- Operational Value: Standardizes mitochondrial assays for reproducibility and scalability in field and laboratory settings.
- Strategic Value: Enables more informed go/no-go decisions by providing representative metabolic data early in the pipeline.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization of metabolic targets and models for downstream development.
Implementation Considerations
- Requires expertise in mitochondrial isolation and respiration assay setup.
- Demands specialized instrumentation for field-based sample processing and measurement.
- Necessitates cross-team standardization of protocols and data analysis workflows.
- May require adaptation for different tissue types or animal models based on field conditions.
- Limited by the need for rapid processing of fresh samples to ensure data integrity.
