Name: Herpes Simpleks Virüslerinin Plaklaşması (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-11-05T13:00:00.000+00:00
Duration: 4 min 41 s
Description: Öğrenin, herpes simpleks virüslerinin plaklaşma yöntemiyle viral titreyi güvenilir şekilde nasıl kantifiye edeceğinizi. Bu teknik, antiviral tedavilerin etkinliğini değerlendirmek için kullanılır.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Laboratuvarlarımızdaki (PJD ve BJM) bu yöntemleri geliştiren yıllar boyunca bizimle birlikte çalışan sayısız öğrenciye teşekkür ederiz. Vesayeti altında bu metodolojinin ilk geliştirildiği Stan Person'a özel bir teşekkür. Bu çalışma kısmen Towson Üniversitesi Fisher Bilim ve Matematik Lisans Araştırma Destek Fonu ve NIGMS Bridges to the Baccalaureate grant 5R25GM058264 tarafından desteklenmiştir. Bu içerik yalnızca yazarların sorumluluğundadır ve Ulusal Sağlık Enstitüleri'nin Ulusal Genel Tıp Bilimleri Enstitüsü'nün resmi görüşlerini temsil etmek zorunda değildir.

Vero hücreleri ve canlı herpes virüsleri ile ilgili tüm prosedürler Towson Üniversitesi Kurumsal Biyogüvenlik Komitesi tarafından onaylanmıştır. Bu prosedürlerin genelleştirilmiş bir şeması Şekil 1'de gösterilmiştir.
1. Vero hücrelerinin tohumlanması
<ol><li>Plak tahlilini başlatmadan bir gün önce, Vero hücrelerini tripsinize edin ve bunları normal Dulbecco'nun Modifiye Kartallar Ortamında (DMEM) yeniden askıya alın ve standart hücre kültürü metodolojisine göre takviye edin19. Tripsinize olmuş hücreleri, akan Vero hücrelerinin (~ 107 hücre) T-75 şişesi başına 10 mL DMEM'de yeniden askıya alın. NOT: DMEM, alfa-MEM yerine plak tahlilleri için kullanılır, çünkü hücre büyüme hızını biraz yavaşlatır ve daha iyi plak testi sonuçlarını destekler.</li>
	<li>Hücreleri tercih edilen yöntemle sayın (örneğin, Trypan Blue dışlamalı standart bir hemositometre)19.</li>
	<li>Hücreleri 4 x 106 hücre / plakada tohumlayın; HSV-2 için, kuyu başına 2,5 mL DMEM (takviyeli) içeren 6 kuyucuklu plakalar kullanın; ve HSV-1 için, kuyu başına 1.25 mL DMEM (takviyeli) içeren 12 delikli plakalar kullanın. NOT: Kullanılan plakadan bağımsız olarak hücre sayısı sabit olmalıdır, ancak kuyucukların büyüklüğü plak tahlilindeki doğrulukla ilgilidir. Hücrelerin eşit olarak dağıtılması esastır, bu da plakayı dairesel bir şekilde değil, ileri geri hareket ettirerek en etkili şekilde gerçekleştirilebilir.</li>
	<li>Hücrelerin nemlendirilmiş bir inkübatörde gece boyunca 37 °C / % 5 CO2'de büyümesine izin verin. NOT: Nem, inkübatörün dibinde bir algisit içeren bir damıtılmış su tavası ile korunur.</li>
</ol>2. Numune seyreltme
<ol><li>Numune seyreltmesini ve hücrelere virüs eklenmesini tek bir laboratuvar oturumunda tamamlayın. DİKKAT: HSV-1 ve -2 insanlar için bulaşıcıdır ve uygun biyogüvenlik koruması (BSL-2) altında ele alınmalıdır. Virüsle temas eden tüm malzemeleri ayrı tutun ve biyogüvenlik kabininden çıkarmadan önce 1/256 seyreltmede ( Malzeme Tablosuna bakınız), iyodofor, ağartıcı veya güçlü iyonik deterjan (örneğin, SDS) ile kuaterner bir ajanla dezenfekte edin.</li>
	<li>Vero hücrelerinin tohumlanmasından sonraki gün, 1x PBS'de plaklanacak her virüs örneğini seri olarak seyreltin; en hassas izleme için genellikle 10 kat seyreltmeler kullanın.</li>
	<li>Bu seyreltmeleri 10-4 (düşük virüs konsantrasyonları için) veya 10-9 (daha yüksek titreli numunelerin beklentileri için) ile plak testinin kendisi için kalan her numuneden en az 1 mL ile yapın.</li>
	<li>Bu seyreltilmiş virüs örneklerini hücrelere eklemeye hazır olana kadar tüm viral seyreltmeleri buz üzerinde (1 saatten fazla değil) tutun.</li>
</ol>3. Hücrelere virüs eklenmesi
<ol><li>Hücre kültürü ortamını pipetle bir veya iki kuyucuktan çıkarın. NOT: Aspiratör kullanmayın, çünkü tek katmanlı hücreden çok fazla sıvı alır ve hücreleri kurutur. Önemli bir husus, hücre tek katmanının deneyin tüm seyri boyunca sulu kalmasını sağlamaktır. Hücreler kurursa, son adımda plakayı yıkar ve kullanılamaz veriler üretirler. Bu nedenle, bu olasılığı azaltmak için bir seferde yalnızca bir veya iki kuyu işleyin.</li>
	<li>Seyreltilmiş virüs örneğini (sırasıyla 6 kuyucuklu ve 12 delikli plakalar için sırasıyla 100-400 μL ve 50-200 μL virüs örneği kullanılır) her bir tek katmana damla damla ekleyin ve damlaları her bir kuyucuğun kenarına ekleyin. Tüm plaka plaklanan virüs örnekleriyle dolana kadar işlemi her bir veya iki kuyucuk için tekrarlayın. NOT: Damlaları kuyunun merkezine eklemek, yanlışlıkla hücreleri substrattan çıkarabilir.</li>
	<li>Virüsü içeren PBS'nin her bir kuyucuktaki tüm tek katmanlı hücreleri kapsadığından emin olmak için tüm plakayı elle hafifçe sallayın, ardından virüsün adsorbe girmesine izin vermek için plakayı 37 ° C'de bir CO2 inkübatörüne yerleştirin.</li>
	<li>Her 10 dakikada bir, 1 saat içinde, plakayı inkübatörden çıkarın, virüsü her bir kuyucuğa daha eşit bir şekilde yaymak için yavaşça tekrar sallayın ve ardından inkübatöre geri yerleştirin. NOT: Her deney, replika sayısını ve hangi seyreltmelerin kullanılacağını belirleyecektir; okuyucunun tercihi bu kararı belirler.</li>
	<li>Emilmemiş inokulumu yanlışlıkla sayma olasılığını azaltmak için, virüs örneğini 1000 μL pipet uçlarıyla kuyucuklardan çıkarın ve bir atık kabına yerleştirin. NOT: Yine, bu prosedür, hücre monokatmanının hidrasyonunu korumak için bir seferde sadece bir veya iki kuyucukla gerçekleştirilir.</li>
	<li>2,5 mL'lik bir metilselüloz bindirmesi yerleştirin (100 mL PBS'de %5 metilselüloz w / w çözün, 121 ° C'de 15 dakika otoklav ve bir sıvı döngüsünde 15 psi, ardından 375 mL DMEM artı 25 mL FBS ekleyin).</li>
	<li>Tüm plaka bindirme içerdiğinde, iki gün boyunca büyümeye izin vermek için plakayı inkübatöre geri yerleştirin. NOT: Virüs ve hücrelerin DMEM artı takviyelerinde bile üç gün boyunca büyümesine izin verilirse, tek katmanda önemli miktarda hücre kaybına neden olabilir ve böylece nihai veriler tehlikeye girebilir.</li>
	<li>Atık kabı, biyogüvenlik kabininden çıkarmadan önce, tipik olarak ağartıcı, iyodofor veya benzeri bir virüsit ilavesiyle dezenfekte edin.</li>
</ol>4. Plaklar için boyama
<ol><li>İki günlük inkübasyondan sonra, metilselüloz kaplamasını bir pipetle, yine bir seferde bir veya iki kuyucukla çıkarın ve bir atık kabına yerleştirin.</li>
	<li>Plakları lekelemek için her bir kuyucuğa% 50 etanol içinde ~2 mL% 1 kristal menekşe ( Malzeme Tablosuna bakınız) ekleyin. NOT: Bindirmenin her damlasını kaldırmak gerekli değildir.</li>
	<li>Plakayı, 37 ° C'de 30 dakika boyunca leke ile doldurulmuş tüm kuyucuklarla inkübe edin. Bu noktada, atık kabı adım 3.8'de yukarıdaki gibi dezenfekte edin.</li>
	<li>Akış temizlenene kadar plakaları musluk suyuyla kuvvetlice yıkayın. NOT: Yumuşak bir su akışı yeterince kuvvetli değildir; Bir laboratuvar lavabo armatüründen tam basınç gereklidir.</li>
	<li>Bu noktada, her seyreltme serisindeki plak sayısında yaklaşık 10 kat fark olduğundan emin olun.</li>
	<li>Plakaların gece boyunca baş aşağı kurumasına izin verin, bundan sonra bireysel plaklar sayılabilir.</li>
</ol>5. Plakların sayılması ve virüs titresinin belirlenmesi
<ol><li>Yaklaşımdan bağımsız olarak (aşağıdaki NOTA bakınız), plak sayısını seyreltme faktörü ile çarpın (örneğin; plaklar 10-4 kuyucuğunda sayılsaydı, plak sayısı 104 ile çarpılırdı). NOT: 10-100 plak aralığında saymak yararlı olsa da5, 30-300 plaklı kuyuların sayılması biraz daha güvenilirdir ve tam log seyreltmeleri yerine yaklaşık 1/2 log seyreltmelerini dikkate alır.</li>
	<li>Bu sayıyı inokulum hacmine bölün (yukarıdaki adım 3.2'de olduğu gibi) ve orijinal numunede HSV'nin en doğru titresini elde etmek için belirtilen aralıkta plakları olan tüm kuyucukların ortalamasını alın.</li>
	<li>Tablo 1'deki sahte verilerin kullanımını göz önünde bulundurarak 5.3.1 ile 5.3.5 arasındaki adımlardaki hesaplamaları gerçekleştirin.<ol>
<li>Sadece 30-300 plakalı kuyuları düşünün (adım 5.1). Bu nedenle, Tablo 1'de, 1, 2 ve 3 numaralı çoğaltmalar için yalnızca 10-5 sütununu kullanın.</li>
		<li>Verilen seyreltmedeki plak sayısını alın ve seyreltme faktörünün karşılığı ile çarpın. Bu nedenle, örnek 1'in 10-5 sütunu, 10-5 seyreltmede 81 plaktan 81 plakaya 105 kez gider.</li>
		<li>Daha sonra bu sayıyı, o kuyucuktaki hücrelere eklenen virüs seyreltmesinin hacmine (mL cinsinden) bölün. Tablo 1'deki HSV-1 ile ilgili verilerin 12 kuyucuklu bir plakadan geldiğini varsayarsak, 0,2 mL en uygun ölçüm olacaktır. Bu nedenle, adım 5.3.2'den itibaren hesaplama, 0,2 mL'ye bölünen 81 x 105 veya HSV-1'in 4,0 x 107 PFU / mL'si olur.</li>
		<li>Tüm yararlı veriler ve ortalamalar için bu işlemi tekrarlayın. Bu nedenle, hesaplamayı 10-5 sütunundaki tüm numuneler üzerinde 5.3.2-5.3.3'te yapın, aynı virüs örneğinden kaynaklandıklarını ve biyolojik replikasyonların en doğru titre ölçümünü elde etmek için yapıldığını varsayarsak. Tablo 1 durumunda, bu örnek için ortalama 4,0 x 107, 2,1 x 107 ve 2,6 x 107 PFU/mL nihai ortalama titre elde etmek için 2,9 x 107 ± 0,98 x 107 PFU/mL'dir.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol><li>Dimmock, N., Easton, A., Leppard, K. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aDimmock%2C+N+%22Introduction+to+Moden+Virology.+6th+end%22">Introduction to Moden Virology. 6th end</a>. , Wiley-Blackwell. (2007).</li>
<li>Mahy, B., Collier, L. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aMahy%2C+B+%22Topley+and+Wilson%27s+Microbiology+and+Microbial+Infections.+9th+edn%22">Topley and Wilson's Microbiology and Microbial Infections. 9th edn</a>. 1, Arnold. (1998).</li>
<li>Anderson, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enumeration+of+bacteriophage+particles%3A+Comparative+analysis+of+the+traditional+plaque+assay+and+real-time+QPCR-+and+nanosight-based+assays%5BTitle%5D)+AND+%22Bacteriophage%22%5BJournal%5D)">Enumeration of bacteriophage particles: Comparative analysis of the traditional plaque assay and real-time QPCR- and nanosight-based assays.</a> Bacteriophage. 1 (2), 86-93 (2011).</li>
<li>Earle, W. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Production+of+malignancy+in+vitro%3B+IV.+The+mouse+fibroblast+cultures+and+changes+seen+in+the+living+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+National+Cancer+Institute%22%5BJournal%5D)">Production of malignancy in vitro; IV. The mouse fibroblast cultures and changes seen in the living cells.</a> Journal of the National Cancer Institute. 4 (2), 165-212 (1943).</li>
<li>Dulbecco, R., Vogt, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Some+problems+of+animal+virology+as+studied+by+the+plaque+technique%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harbor+Symposia+on+Quantitative+Biology%22%5BJournal%5D)">Some problems of animal virology as studied by the plaque technique.</a> Cold Spring Harbor Symposia on Quantitative Biology. 18, 273-279 (1953).</li>
<li>Enders, J. F., Weller, T. H., Robbins, F. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cultivation+of+the+lansing+strain+of+poliomyelitis+virus+in+cultures+of+various+human+embryonic+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Cultivation of the lansing strain of poliomyelitis virus in cultures of various human embryonic tissues.</a> Science. 109 (2822), 85-87 (1949).</li>
<li>Enders, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cytopathology+of+virus+infections%3A+particular+reference+to+tissue+culture+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Cytopathology of virus infections: particular reference to tissue culture studies.</a> Annual Review of Microbiology. 8, 473-502 (1954).</li>
<li>Roizman, B., Knipe, D. M., Whitley, R. J. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aRoizman%2C+B+%22Fields+Virology%22">Fields Virology</a>. Knipe, D. M., et al. 1, Wolters Kluwer-Lippincott Williams & Wilkins. 1823-1897 (2013).</li>
<li>Madavaraju, K., Koganti, R., Volety, I., Yadavalli, T., Shukla, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Herpes+simplex+virus+cell+entry+mechanisms%3A+An+update%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Cellular+and+Infection+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Herpes simplex virus cell entry mechanisms: An update.</a> Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 10, 617578(2020).</li>
<li>Cooper, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+plaque+assay+of+animal+viruses%5BTitle%5D)+AND+%22Advances+in+Virus+Research%22%5BJournal%5D)">The plaque assay of animal viruses.</a> Advances in Virus Research. 8, 319-378 (1961).</li>
<li>Farnham, A. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+formation+of+microscopic+plaques+by+herpes+simplex+virus+in+HeLa+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Virology%22%5BJournal%5D)">The formation of microscopic plaques by herpes simplex virus in HeLa cells.</a> Virology. 6 (2), 317-327 (1958).</li>
<li>Garabedian, G. A., Scott, L. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plaque+assay+for+herpes+simplex+virus+in+L-929+%28Earle%29+mouse+fibroblasts%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+Society+for+Experimental+Biology+and+Medicine%22%5BJournal%5D)">Plaque assay for herpes simplex virus in L-929 (Earle) mouse fibroblasts.</a> Proceedings of the Society for Experimental Biology and Medicine. 126 (2), 568-571 (1967).</li>
<li>Lancz, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Herpes+simplex+viruses+types+1+and+2.+Type+and+strain+specific+characteristics+affecting+virus+plaque+formation%5BTitle%5D)+AND+%22Arch+Gesamte+Virusforsch%22%5BJournal%5D)">Herpes simplex viruses types 1 and 2. Type and strain specific characteristics affecting virus plaque formation.</a> Arch Gesamte Virusforsch. 46 (1-2), 36-43 (1974).</li>
<li>Muratore, O., Tonoli, E. L., Pesce Schito, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+short-term+plaque+assay+for+antiviral+drug+research+on+herpes+simplex+virus+type+2%5BTitle%5D)+AND+%22New+Microbiologica%22%5BJournal%5D)">A short-term plaque assay for antiviral drug research on herpes simplex virus type 2.</a> New Microbiologica. 19 (3), 257-261 (1996).</li>
<li>Sato, S., Kaneki, H., Shirai, J., Takahashi, K., Kawana, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differentiation+of+herpes+simplex+virus+types+1+and+2+by+plaque+appearances+on+semicontinuous+rabbit+lens+epithelial+cells+in+the+clinical+laboratory%5BTitle%5D)+AND+%22Kansenshogaku+Zasshi%22%5BJournal%5D)">Differentiation of herpes simplex virus types 1 and 2 by plaque appearances on semicontinuous rabbit lens epithelial cells in the clinical laboratory.</a> Kansenshogaku Zasshi. 67 (6), 561-573 (1993).</li>
<li>Yazaki, S., Taniguchi, S., Yoshino, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improvement+of+the+plaque+assay+of+herpes+simplex+virus+in+HeLa+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Japanese+Jouranl+of+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Improvement of the plaque assay of herpes simplex virus in HeLa cells.</a> Japanese Jouranl of Microbiology. 10 (3), 133-139 (1966).</li>
<li>Stanners, C. P., Eliceiri, G. L., Green, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two+types+of+ribosome+in+mouse-hamster+hybrid+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+New+Biology%22%5BJournal%5D)">Two types of ribosome in mouse-hamster hybrid cells.</a> Nature New Biology. 230 (10), 52-54 (1971).</li>
<li>Giannasca, N. J., Suon, J. S., Evans, A. C., Margulies, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Matrix-based+controlled+release+delivery+of+acyclovir+from+poly-%28ethylene+co-vinyl+acetate%29+rings%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Drug+Delivery+Science+and+Technology%22%5BJournal%5D)">Matrix-based controlled release delivery of acyclovir from poly-(ethylene co-vinyl acetate) rings.</a> Journal of Drug Delivery Science and Technology. 55, 101391(2020).</li>
<li>Freshney, R. I. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aFreshney%2C+RI+%22Culture+of+Animal+Cells%3A+A+Manual+of+Basic+Technique+and+Specialized+Applications.+7th+edn%22">Culture of Animal Cells: A Manual of Basic Technique and Specialized Applications. 7th edn</a>. , John Wiley & Sons, Inc. (2016).</li>
<li>Dulbecco, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Production+of+plaques+in+monolayer+tissue+cultures+by+single+particles+of+an+animal+virus%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Science%2C+USA%22%5BJournal%5D)">Production of plaques in monolayer tissue cultures by single particles of an animal virus.</a> Proceedings of the National Academy of Science, USA. 38 (8), 747-752 (1952).</li>
<li>Baer, A., Kehn-Hall, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Viral+concentration+determination+through+plaque+assays%3A+using+traditional+and+novel+overlay+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Viral concentration determination through plaque assays: using traditional and novel overlay systems.</a> Journal of Visualized Experiments. (93), e52065(2014).</li>
<li>Matrosovich, M., Matrosovich, T., Garten, W., Klenk, H. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+low-viscosity+overlay+medium+for+viral+plaque+assays%5BTitle%5D)+AND+%22Virology+Journal%22%5BJournal%5D)">New low-viscosity overlay medium for viral plaque assays.</a> Virology Journal. 3, 63(2006).</li>
<li>Culley, S., Towers, G. J., Selwood, D. L., Henriques, R., Grove, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Infection+counter%3A+Automated+quantification+of+in+vitro+virus+replication+by+fluorescence+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Viruses%22%5BJournal%5D)">Infection counter: Automated quantification of in vitro virus replication by fluorescence microscopy.</a> Viruses. 8 (7), 201(2016).</li>
<li>Hudu, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+Hepatitis+B+e+antigen%3A+A+better+predictor+of+Hepatitis+B+virus+DNA+than+quantitative+Hepatitis+B+surface+antigen%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+Laboratory%22%5BJournal%5D)">Quantitative Hepatitis B e antigen: A better predictor of Hepatitis B virus DNA than quantitative Hepatitis B surface antigen.</a> Clinical Laboratory. 64 (4), 443-449 (2018).</li>
<li>Baltimore, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA-dependent+DNA+polymerase+in+virions+of+RNA+tumour+viruses%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">RNA-dependent DNA polymerase in virions of RNA tumour viruses.</a> Nature. 226 (5252), 1209-1211 (1970).</li>
<li>Scolnick, E. M., Aaronson, S. A., Todaro, G. J., Parks, W. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA+dependent+DNA+polymerase+activity+in+mammalian+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">RNA dependent DNA polymerase activity in mammalian cells.</a> Nature. 229 (5283), 318-321 (1971).</li>
<li>Strick, L. B., Wald, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diagnostics+for+herpes+simplex+virus%3A+is+PCR+the+new+gold+standard%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Diagnosis+and+Therapy%22%5BJournal%5D)">Diagnostics for herpes simplex virus: is PCR the new gold standard.</a> Molecular Diagnosis and Therapy. 10 (1), 17-28 (2006).</li>
<li>Ramakrishnan, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Determination+of+50%25+endpoint+titer+using+a+simple+formula%5BTitle%5D)+AND+%22World+Jouranl+of+Virology%22%5BJournal%5D)">Determination of 50% endpoint titer using a simple formula.</a> World Jouranl of Virology. 5 (2), 85-86 (2016).</li>
<li>Kärber, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Beitrag+zue+kollektiven+Behandlung+pharmakologischer+pharmakologischer+Reihenversuche%5BTitle%5D)+AND+%22Archiv+for+Experimentelle+Pathologie+und+Pharmakologie%22%5BJournal%5D)">Beitrag zue kollektiven Behandlung pharmakologischer pharmakologischer Reihenversuche.</a> Archiv for Experimentelle Pathologie und Pharmakologie. 162 (4), 480-487 (1931).</li>
<li>Reed, L. J., Muench, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+simple+method+of+estimating+fifty+percent+endpoints%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Hygiene%22%5BJournal%5D)">A simple method of estimating fifty percent endpoints.</a> American Journal of Hygiene. 27 (3), 493-497 (1938).</li>
<li>Spearman, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Method+of+%27Right+and+Wrong+Cases%27+%28Constant+Stimuli%29+without+Gauss%27s+formula%5BTitle%5D)+AND+%22British+Journal+of+Psychology%22%5BJournal%5D)">The Method of 'Right and Wrong Cases' (Constant Stimuli) without Gauss's formula.</a> British Journal of Psychology. 2 (3), 227-242 (1908).</li>
<li>Ryu, W. -S. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aRyu%2C+W-S+%22Molecular+Virology+of+Human+Pathogenic+Viruses.+1st+edn%22">Molecular Virology of Human Pathogenic Viruses. 1st edn</a>. , Academic Press. (2017).</li>
<li>Burrill, C. P., Strings, V. R., Andino, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Poliovirus%3A+generation%2C+quantification%2C+propagation%2C+purification%2C+and+storage%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Protocols+in+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Poliovirus: generation, quantification, propagation, purification, and storage.</a> Current Protocols in Microbiology. , Chapter 15 Unit 15H 11 (2013).</li>
<li>Karakus, U., Crameri, M., Lanz, C., Yanguez, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Propagation+and+titration+of+influenza+viruses%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Propagation and titration of influenza viruses.</a> Methods in Molecular Biology. 1836, 59-88 (2018).</li>
<li>Baz, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zika+virus+isolation%2C+purification%2C+and+titration%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Zika virus isolation, purification, and titration.</a> Methods in Molecular Biology. 2142, 9-22 (2020).</li>
<li>Coleman, C. M., Frieman, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Growth+and+quantification+of+MERS-CoV+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Protocols+in+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Growth and quantification of MERS-CoV infection.</a> Current Protocols in Microbiology. 37 (1), 1-9 (2015).</li>
</ol>

Yazarlar çıkar çatışması olmadığını beyan ederler.

Plak tahlilleri neredeyse memeli hücre kültürünün kendisi kadar eski olsa da, her laboratuvarın bu temel tahlili yürütmek için kendi protokol setine sahip olduğu görülmektedir5,6,10,11,12,13,14,15,16,20<sup clas...

Virüs plak tahlillerinin başlangıcı, 1890'larda virüslerin ilk keşiflerine kadar uzanır1. Tütün mozaik virüsü ilk önce izole edildi ve tütün yapraklarına geçti, burada bireysel enfeksiyon lekeleri, daha sonra virion2 olarak tanımlanan tek, canlı bir virüs varlığından2 kaynaklandığı ve ölçülebildi. Daha sonra bakteri ve bakteriyofajlarla yapılan seminal çalışmalar, büyümenin orta log fazındaki bakteriler, bakteriyofaj örneklerinin seri seyreltilmesi ve bakteri çimindeki gerçek deliklerin (adlandırılmış plaklar) daha sonra görselleştirilmesiyle üst agar da dahil olmak üzere bu virüsleri plak altına almak için kullanılan teknikleri mükemmelleştirmiştir3.
Hayvan virüslerinin yutulması, bakteriyofajlarla yapılan heyecan verici araştırmaların gerisinde kaldı, çünkü esas olarak kültürde memeli hücrelerinin yetiştirilmesi için gerekli yöntemler 1940'lara kadar geliştirilmedi4. Bununla birlikte, tüm konakçı organizmanın yokluğunda büyüyen murin hücrelerinin ortaya çıkışı4, virüsleri kültürleme ve sayma yeteneğinde yeni bir çağ yarattı. Bu tür çalışmalar, tavuk hücrelerinde Batı Atı Ensefalomiyelit virüsünün ve insan hücrelerinde poliovirüsün yayılması ve kantitasyonu için genişletilmiştir5,6. Kültürlenebilir memeli hücreleri alanı genişledikçe, çeşitli viral enfeksiyonlar için farklı konakçı hücrelerin kıskançlığı, dünyaya her türlü virüsü incelemek için bir dizi olanak sağladı7. Bu, insan herpes virüslerinin, özellikle de mukokutanöz lezyonlara neden olan herpes simpleks virüsü-1 (HSV-1) ve -2'nin (HSV-2) yayılmasını ve miktarını içeriyordu8. Önemli olarak, tüm plak tahlilleri, konakçı hücrelere bir numunede reseptör aracılı bir şekilde girebilen canlı viryonların varlığına bağlıdır9. Plaket tahlillerinin yürütülmesiyle ilgili yayınların yaygınlığı ve çokluğundan bağımsız olarak5,10,11,12,13,14,15,16, HSV-1/-2 için bu yöntemler hem sanatın hem de bilimin bir karışımıdır; Protokoldeki her ayrıntıya dikkat edilmeden tahlil yapılamayacağı gibi, süreçteki incelik için kritikal bir göz olmadan da başarılı bir tahlil yapılamaz. Bu el yazması, HSV-1/-2 plak tahlilleri için en tutarlı tekrarlanabilir yöntemlerden birini, nadiren tartışılan tahlil sanatına yönelik kesin ayrıntılarla tasvir etmektedir.
Bu mevcut protokol, HSV-1 ve -2 için canlı plak oluşturan birimler (PFU) sayımlarını güvenilir bir şekilde elde eder. En iyi sonuçlar, düşük pasajda (pasaj numarası 155'in altında) Vero hücreleri (dönüştürülmüş Afrika yeşil maymun böbrek epitel hücreleri) kullanılarak elde edilir ve% 10 fetal buzağı serumu (FCS), L-alanil-L-glutamin ve bir antibiyotik / antimikotik karışım ile desteklenmiş alfa-MEM17'de rutin olarak yetiştirilir18. Vero hücreleri, bu ortamda haftada iki ila üç kez, her seferinde 1/5 seyreltmede standart olarak çoğaltılır.

<table><tbody><tr><td>12 oyuklu plakalar</td><td>Corning</td><td>3512</td><td></td></tr><tr><td>6 oyuklu plakalar</td><td>Corning</td><td>3516</td><td></td></tr><tr><td>Alpha-MEM</td><td>Lonza</td><td>12169F</td><td></td></tr><tr><td>Antibiyotik/antimikotik</td><td>Gibco</td><td>15240096</td><td></td></tr><tr><td>Kristal menekşe</td><td>Alfa Aesar</td><td>B2193214</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Gibco</td><td>11965092</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco'nun PBS'si (Mg++ veya Ca++)</td><td>Gibco</td><td>14190144</td><td></td></tr><tr><td>Fetal buzağı serumu</td><td>Millipore-Sigma</td><td>TMS-013-B</td><td></td></tr><tr><td>L-alanil-L-glutamin (Glutamax)</td><td>Gibco</td><td>GS07F161BA</td><td></td></tr><tr><td>Hematitometre</td><td>Termo Fisher</td><td>02-671-54</td><td></td></tr><tr><td>Metilselüloz</td><td>Millipore-Sigma</td><td>27-441-0</td><td></td></tr><tr><td>Kuaterner ajan (Lysol I.C.)</td><td>Thermo Fisher</td><td>NC9645698</td><td></td></tr><tr><td>Tripan Mavi</td><td>Corning</td><td>25900CI</td><td></td></tr><tr><td>Tripsin</td><td>Cytiva</td><td>SH30042.01</td><td></td></tr><tr><td>Vero hücreleri</td><td>ATCC</td><td>CCL-81</td><td></td></tr></tbody></table>

herpes simpleks virüslerinin plaklaşması

Plaquing of Herpes Simplex Viruses

Metodoloji için birincil literatürdeki referanslar da dahil olmak üzere, virüsleri rahatsız etmek için çok sayıda yayınlanmış protokol vardır. Bununla birlikte, virüsleri rahatsız etmek zor olabilir, bu da spesifikasyonlarına ve iyileştirilmesine odaklanmayı gerektirir. Yeni öğrencilerin ustalaşması için inanılmaz derecede zor bir yöntemdir, çünkü esas olarak en küçük ayrıntılara titizlikle dikkat edilmesini gerektirir. Herpes simpleks virüslerini rahatsız etmenin bu gösterimi, yıllar boyunca yöntemi, özellikle nüanslarını görselleştirmekle mücadele edenlere yardımcı olmalıdır. Bu makale, standart plaquing metodolojisinin aynı ilkelerine dayanmakla birlikte, (1) işlem sırasında bozulmayı önlemek için konakçı hücrelerin en iyi nasıl ele alınacağı, (2) viryonların difüzyonunu sınırlamak için agarozdan daha kullanışlı bir viskoz ortam ve (3) güvenilir bir şekilde tekrarlanabilir sonuçlar üreten basit bir fiksasyon ve boyama prosedürünün ayrıntılı bir tanımını içermesi bakımından farklıdır. Ayrıca, eşlik eden video, başkalarına plak tahlilleri yapma talimatı verirken sıklıkla gözden kaçırılan süreçteki daha ince ayrımları göstermeye yardımcı olur.

Tablo 1'de en iyi sonuçları veren bir deneme gösterilmektedir. Tüm 10 kat seyreltmeler, plak sayılarında yaklaşık 10 kat azalmayı takip eder. Bu tür veriler, her üç kopya için de sayılabilir plak sayısının 10-4 aralığında düştüğü gerçek bir plak testi olan Şekil 2'de de görülebilir. Aynı şey, sayılabilir plak sayısının 10-3 seyreltmede olduğu en üst sıra olan Şekil 3'te de görülebilir.
Bununla bi...

Plaqueing, bir popülasyondaki canlı virüsleri ölçmek için kullanılan rutin bir yöntemdir. Plaqueing, bakteri ve bakteriyofajlarla çeşitli mikrobiyoloji müfredatlarında sıklıkla öğretilmesine rağmen, memeli virüslerinin veba edilmesi daha karmaşık ve zaman alıcıdır. Bu protokol, herpes simpleks virüsleri ile düzenli çalışma için güvenilir bir şekilde çalışan prosedürleri açıklar.

Herpes Simpleks Virüslerinin Plaklaşması

There are numerous published protocols for plaquing viruses, including references within primary literature for methodology. However, plaquing viruses can ...

Protokol, öğrencilerin bireysel enfeksiyonları net bir şekilde tanımlamasına ve tahlili kolayca yapmasına yardımcı olarak viral titreyi ölçmeyi daha verimli hale getirir. Bu protokol, güvenilir ve tekrarlanabilir sonuçlar üreten basit bir sabitleme ve boyama prosedürü içerir. Bu yöntem, hastalıklara karşı antiviral tedavilerin doğruluğu ve etkinliği hakkında fikir verebilir.Bu veba protokolünün daha zor engelleri, hücrelerin işlem boyunca aşırı kalabalıklaşmamasını, kurumamasını veya çizilmemesini sağlayan tohumlama plakaları için hücre sayımlarıdır. Bu protokolün genel titiz doğasında da zorluklar yaşanabilir. Bununla birlikte, uygulama bu deneyin başarısının önemli bir katkısıdır.Başlamak için, bir laboratuvar oturumunda hücrelere virüs ilavesiyle numune seyreltmesini tamamlayın. PBS'de plak bulunan her virüs örneğini seri olarak seyreltin. En hassas izleme için genellikle 10 kat seyreltmeler kullanın.Bu seyreltilmiş virüs örneklerini hücrelere eklemeye hazır olana kadar tüm viral seyreltmeleri buz üzerinde tutun. Hücre kültürü ortamını bir pipet kullanarak bir veya iki kuyucuktan çıkarın. Seyreltilmiş virüs örneğini, her bir kuyucuğun kenarından damla damla her bir hücre katmanına damla damla dikkatlice ekleyin.Tüm plaka plaklanan virüs örnekleriyle dolana kadar işlemi her bir veya iki kuyucuk için tekrarlayın. Tüm plakayı elle hafifçe sallayın. Daha sonra virüs adsorpsiyonuna izin vermek için plakayı bir saat boyunca 37 santigrat derecede inkübe edin.Her 10 dakikada bir, plakayı inkübatörden çıkarın, virüsü her bir kuyucuğa daha eşit bir şekilde yaymak için yavaşça tekrar sallayın ve ardından inkübatöre geri yerleştirin. Emilmemiş inokulumu yanlışlıkla sayma olasılığını azaltmak için, 1000 mikrolitrelik bir pipet ucu kullanarak virüs örneğini kuyucuklardan çıkarın ve numuneyi bir atık kabına atın. Plakaya 2,5 mililitre metilselüloz kaplama yerleştirin ve inkübatöre geri yerleştirin.Atık kabı, biyogüvenlik kabininden çıkarmadan önce, tipik olarak ağartıcı, iyodofor veya benzeri bir virüsit ilavesiyle dezenfekte edin. İki günlük inkübasyondan sonra, metilselüloz bindirmeyi bir pipet kullanarak bir seferde bir veya iki kuyucuktan çıkarın ve bir atık kabına yerleştirin. Her bir oyuğa% 50 etanol içinde yaklaşık iki mililitre% 1 kristal menekşe ekleyin.Tabağı, 37 santigrat derecede 30 dakika boyunca leke ile doldurulmuş tüm kuyucuklarla inkübe edin. Bu noktada, atık kabı daha önce gösterildiği gibi dezenfekte edin. Akış temizlenene kadar plakaları musluk suyuyla kuvvetlice yıkayın.Her seyreltme serisindeki plak sayısında yaklaşık 10 kat fark olduğundan emin olun. Şekil, plak sayılarında 10 kat azalmayı göstermektedir; burada sayılabilir plak sayısı, her üç kopya için 10'da eksi dört aralığına düşmüştür. Şekildeki ilk üç resim, eksi üç seyreltmeye kadar 10'daki plakları göstermektedir.Bununla birlikte, alt sıra, bir plak testi iyi yapılmadığında sonuçları gösterir. Vero hücrelerinin substrattan tamamen kalktığı üst kısımdaki görünür alanlarda herhangi bir seyreltmeden görülebilen çok az plak vardır. Benzer şekilde, bu şekil plak testi sırasında hücrelerin kuruması veya yanlış kullanımı ile ilgili sorunları göstermektedir.Bununla birlikte, bu rakam kritik olarak zayıf Vero hücresi tohumlamasını göstermektedir. Her kuyu, kuyu boyunca iyi yayılmamış ve kümeler halinde üst üste yığılmış hücrelerin göstergesi olan daha koyu mor lekeler gösterir. En iyi sonuçlar için, topaklanmış plakları önlemek için virüsün plaka boyunca eşit şekilde yayıldığından emin olun Plak tahlilleri diğer nicel yöntemlerden daha etkilidir, çünkü sadece canlı virüsü sayar.Bu şekilde, gerçek antiviral etkinlik oluşturulabilir. Ek olarak, bu teknik, fomitler üzerindeki viral varlığı ölçmemize ve herpes virüsü araştırması sektörümüzdeki yeni tıbbi cihazlardan ilaç dağıtımının etkinliğini keşfetmemize izin vermiştir.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

İmmünoloji ve Enfeksiyon

Akut Epitel Herpes Ex Vivo Organotipik Kornea Model Virüs Tip I Enfeksiyon Simplex

Protokol herpes virüs tip 1 (HSV-1) gecikme ve reaktivasyonu simpleks incelemek için etkin ve tekrarlanabilir model sistemi anlatılmaktadır. Assay homojen sempatik sinir kültürler kullanmaktadır ve RNA etkileşimi ve rekombinant proteinlerin ifadesi de dahil olmak üzere çeşitli araçlar kullanılarak virüs nöron etkileşimlerin moleküler Diseksiyon için olanak sağlar.

Herpes Çalışmaları A Primer Nöron Kültür Sistem Virüs gecikmesi ve Yeniden Simplex

Herpetik kornea hastalığı çalışmaların çoğu birincil enfeksiyon modeli kullanın. Ancak, HSV-1 ile birincil infeksiyon genellikle insan hastalığına yol açmaz. Burada daha yakından insan hastalığı taklit herpetik kornea hastalığı, tekrarlayan modeli açıklamak.

Farelerde Tekrarlayan Herpetik Stromal Keratit, İnsan HSK Eğitim İçin Bir Model

Bu videoda, enfeksiyöz herpes simpleks virüsü veya HSV'nin virüs plak testi açıklanmaktadır. Seyreltilmiş viral partiküller, epitel hücrelerinin tek tabakasına aşılanır. Kuluçka sırasında, virüs plaklar oluşturur ve bulaşıcı virüs titresini belirlemek için görsel olarak sayılır.

Virüs Plak Testi: Virüsle enfekte olmuş hücrelerin tek tabakasında oluşan plakların miktar tayini yoluyla enfeksiyöz herpes simpleks virüsünü ölçmek için bir teknik

Bu videoda, enfekte domuz korneasından elde edilen bir virüs kullanılarak plak testi gerçekleştirme yöntemi gösterilmektedir. Domuz korneası, deneysel ilaçların antiviral etkinliğini test etmek için kullanılır.

Plak Testi ile Deneysel İlaçların Antiviral Etkinliğinin Belirlenmesi

Bu hayvan modellerinin doku bölümleri içinde kalıcı bir DNA virüsü genomunun saptanması için in situ hibridizasyon protokolünde bir floresan kurulmuştur. Bu protokol, viral genomun codetection, kendi RNA ürünleri ve tek bir hücre içinde viral veya hücresel proteinleri tarafından enfeksiyon süreci üzerinde çalışırken sağlar.

Floresan Nöronal Dokularda Kalıcı DNA Virüs Genomu ve Transkriptlerinin Algılama In situ Melezleme immün ile birlikte

Deri, insan patojeni herpes simpleks virüsü tip 1'in (HSV-1) hedef dokularından biridir. HSV-1'in dokuya invazyon yolunu araştırmak için, cildin en dış tabakasını temsil eden murin epidermal tabakalarının ex vivo bir enfeksiyon modeli oluşturduk.

Herpes Simplex virüs tip 1 ile murin Epidermis Ex ​​vivo enfeksiyon

Deneysel ilaçların antiviral etkinliğini test etmek için bir porcine korneasının kullanımını açıklıyoruz.

Herpes Simpleks Virüs-1 Antivirallerinin Etkinliğini İncelemek için Porcine Kornea Dokusu Eksplant

Bu yazıda, klinik öncesi kullanım için onkolitik herpes simpleks virüsünün basit bir büyüme, arınma ve titrasyon yöntemini açıklıyoruz.

Büyüme, Arınma ve Onkolitik Herpes Simpleks Virüs Titrasyon

Bu makale, RNA virüsleri ve doku kültürü aslına Değişiklikleri onaylamak için mutasyon sıklığı verileri kullanmak RNA polimeraz sadakat varyantları izole ve karakterize etmek için gerekli adımları açıklamaktadır.

Virüs mutasyon Frekans RNA Virüsler ve Karakterizasyonu Fidelity Varyantlar izolasyonu

Öğrenin, herpes simpleks virüslerinin plaklaşma yöntemiyle viral titreyi güvenilir şekilde nasıl kantifiye edeceğinizi. Bu teknik, antiviral tedavilerin etkinliğini değerlendirmek için kullanılır.

Herpes Simpleks Virüslerinin Plaklaşması

Daha fazla video keşfet