Birincil Hücre Kültürleri için Yenidoğan Fareden Mikroglial Hücrelerin Manyetik İzolasyonu
25 Temmuz 2022
Primer mikroglia kültürleri, yeni anti-enflamatuar molekülleri değerlendirmek için yaygın olarak kullanılır. Mevcut protokol, mikroglia'yı yenidoğan yavrulardan manyetik olarak izole etmek için tekrarlanabilir ve ilgili bir yöntemi tanımlamaktadır.
Bu protokol, mikroglia'yı in vivo özellikleri yakından taklit eden koşullarda kültürlememizi sağlar. Manyetik hücre sıralama teknolojisini kullanarak, protokolümüz kültür ortamında herhangi bir serum kullanmadan mikroglia'yı sadece iki gün in vitro olarak uyarmamızı sağlar. Başlamak için, 15 ila 20 milimetrelik sagital sütürü takiben, cildi boyundan buruna kesmek için küçük makas kullanın.
Uçları kafatasına paralel foramen magnum ile yerleştirin. Her iki taraftan gözlere kadar kesin. Kafatasını ve beyni kafadan ayırmak için gözler arasında küçük makasla kesin.
İki forseps ile kafatasını koku alma ampullerine yakın tutun ve kafatasını dikkatlice yırtın. Bir tıraş bıçağı ile beyincik ve olfaktif ampulü çıkarın ve beyni iki parçaya bölün. Beyin parçalarını kalsiyum ve magnezyum içermeyen 40 mililitre HBSS içeren bir Petri kabına yerleştirin.
Bu tabloya göre ayrışma karışımını hazırlayın. 12 beyin parçasını, ayrışma tüpü başına toplam 1.2 gram ağırlık için bir C tüpüne aktarın. Daha sonra C tüplerini ısıtıcı ile ayrıştırıcıya yerleştirin.
Optimize edilmiş NTDK programını dissosiyatörde başlatın. 20 saniye santrifüj. Üç kez pipetleme yaparak mekanik ayrışmayı tamamlayın.
Hücreleri, bağlı süzgeçlerle dört adet 15 mililitrelik tüpe aktarın. Süzgeçleri kalsiyum ve magnezyum ile 10 mililitre HBSS ile durulayın. 10 dakika boyunca santrifüj yapın ve süpernatantı 10 mililitrelik bir pipetle çıkarın.
Kalsiyum ve magnezyum ile 10 mililitre HBSS ekleyin ve peleti tekrar askıya alın. Yine, süpernatanı santrifüj yapın ve çıkarın. Peleti altı mililitre ayıklama tamponu ile yeniden askıya alın.
Santrifüjlemeyi tekrarlayın ve süpernatanı atın. Daha sonra 200 mikrolitre CD11b mikroboncuk çözeltisi ekleyin ve tüpleri dört santigrat derecede 15 ila 20 dakika inkübe edin. Kuluçkadan sonra, peleti altı mililitre ayırma tamponu ile yeniden askıya alın.
Santrifüjlemeyi tekrarlayın ve peleti sekiz mililitre ayırma tamponu ile yeniden askıya alın. Ardından, sekiz sütun hazırlamak için ayırıcıdaki Possel programını izleyin. Bir seferde bir mililitre hücre süspansiyonu ekleyerek hücreleri sütundan geçirin.
Bir mililitre ayıklama tamponu ile, CD11b-pozitif hücreleri steril bir elüsyon plakası üzerinde süzün. Hücreleri 50 mililitrelik bir tüpte toplayın. Peleti 10 mililitre soğuk mikroglia ortamı ile santrifüj yapın ve tekrar askıya alın.
CD11b-pozitif hücreleri sayın. Mililitre başına 650.000 ila 700.000 hücrelik bir son konsantrasyon elde etmek için hücreleri soğuk mikroglia ortamında tekrar askıya alın. Süspansiyonu hücre kültürü plakalarına dağıtın.
Plakaları gece boyunca% 5 karbondioksit ile 37 santigrat derecede inkübe edin. Ertesi gün, ortamı önceden ısıtılmış mikroglia ortamı ile değiştirin ve gece boyunca inkübasyonu tekrarlayın. Bu adımdan önce hücreleri uyarın ve stimülasyonun son üç saati boyunca fagositik tahlil yapın.
Bu tabloya göre boncuk sayısını hücre başına 50 boncuk oranında hesaplayın. Boncuk karışımını hazırlayın. Tüpü 37 santigrat derecede bir su banyosunda bir saat boyunca inkübe edin.
Her 10 dakikada bir vorteks. Her bir kuyucuğa, boncuk çözeltisinin hesaplanan hacmini ekleyin ve üç saat boyunca inkübe edin. Bu yaklaşımı kullanarak, mikroglia'nın fagositik aktivitesi, interlökin-1 beta, artı interferon gama veya lipopolisakkaritler gibi pro-inflamatuar faktörler tarafından stimülasyondan sonra değerlendirildi.
Altı ila 24 saat boyunca stimülasyondan sonra, floresan Cy3 mikroglia boncukları konfokal mikroskopla analiz edildi. Altı saat sonra, mikroglia sadece interlökin-1 beta artı interferon gama durumu altında Cy3 boncuklarını fagosit etmeye başlar. 24 saat sonra, her iki stimülasyon türü için de Cy3 floresansında bir artış oldu ve bu da fagositik aktivitenin arttığını vurguladı.
Mikroglial kültürün saflığı, sıralamadan sonra hücre canlılığında bir artış gösteren akış sitometrisi ile yükseltildi. Akış sitometrisi ve RT-qPCR hücre popülasyonu belirteçleri kullanılarak, doğum sonrası sekizinci günde farelerin beyinlerinden CD11b-pozitif hücrelerin ayrılmasından önce ve sonra analiz edildi. Bu analizler, mikroglia için CX3CR135, O4 veya oligodendrositler için OLIG2, nöronlar için NeuN veya sinaptofizin ve astrositler için ACSA-2 veya GFAP gibi çeşitli beyin hücresi popülasyonlarını ayırt etti.
CD11b antikoru kullanılarak hücre sıralama yapıldıktan sonra sadece mikroglia elde edildi. Tıkanmayı önlemek ve mekanik hücre ölümünü önlemek için süspansiyonu kolona eklerken çok nazikçe pipet uygulamak önemlidir. Bu yöntemden sonra, mikroglial stimülasyonun etkisini görmek için batı kanı veya Luminex gibi transkriptomik proteomikler ve hatta immünokimya yapılabilir.
Tam transkripti görüntüleyin ve binlerce bilimsel videoya erişin
Genel Bakış
Bu çalışma, manyetik ayırma teknolojisi kullanarak neonatal farelerden primer mikroglia izole etmek için tekrarlanabilir bir protokol sunmaktadır. Bu metodoloji, mikrogliaların in vivo özelliklerini yakından taklit eden koşullar altında kültüre edilmesine olanak tanıyarak, fagositoz aktiviteleri hakkında içgörüler sağlar.
Temel Çalışma Bileşenleri
Bilim Alanı
- Nörobilim
- Hücre Biyolojisi
- Mikrogliya Araştırmaları
Arka Plan
- Mikroglia, merkezi sinir sisteminde kritik roller oynar.
- Mikroglial yanıtların uyarılara karşı nasıl şekillendiğini anlamak, nöroenflamasyon araştırmaları için önemlidir.
- Manyetik hücre ayırma, mikrogliaların izole edilmesi için uygulanabilir bir strateji sunar.
- Önceki protokoller, tekrarlanabilirlik veya in vivo koşullarla uyumluluk açısından yetersiz kalabilir.
Çalışmanın Amacı
- Primer mikrogliaların verimli bir şekilde izole edilmesi ve kültüre edilmesi için bir protokol geliştirmek.
- Mikrogliaların enflamatuar uyaranlara verdiği yanıtların değerlendirilmesine olanak sağlamak.
- İzole edilen mikrogliaların saflığını ve canlılığını değerlendirmek.
Kullanılan Yöntemler
- Yenidoğan farelerden mikroglia izole etmek için manyetik ayırmayı kullanan hücre kültürü yöntemi.
- Biyolojik model, yenidoğan yavruların kortikal mikroglialarını içermektedir.
- Hücre saflığını değerlendirmek için immünokimya ve akış sitometrisi kullanılmıştır.
- Temel adımlar arasında diseksiyon, enzimatik disosiyasyon ve CD11b mikroboncuklar kullanılarak ayırma işlemleri yer almaktadır.
- Fagositoz analizleri, proinflamatuar faktörlere yanıt olarak mikroglial aktiviteyi değerlendirmiştir.
Ana Sonuçlar
- Mikroglialar, belirli inflamatuar koşullara yanıt olarak artmış fagositik aktivite göstermiştir.
- Sıralama sonrası akış sitometrisi ile artan hücre canlılığı ve saflığı doğrulanmıştır.
- Konfokal mikroskopi, stimülasyon süresine bağlı olarak fagositik aktivitedeki belirgin farkları ortaya koymuştur.
- Yöntem, farklı beyin hücresi popülasyonları arasındaki ayrımları netleştirmiştir.
Sonuçlar
- Bu çalışma, in vitro deneyler için fare mikroglialarının izole edilmesinde güvenilir bir yöntem oluşturmaktadır.
- Bulgular, mikroglial fonksiyonların ve inflamasyona verdikleri yanıtların daha iyi anlaşılmasını sağlamaktadır.
- Bu protokol, nöroinflamatuar süreçlere yönelik daha ileri araştırmalar için bir temel teşkil etmektedir.
Sıkça Sorulan Sorular
Sektörel Uygulama ve Önem
Bu protokol, neonatal farelerden primer mikroglia hücrelerinin izole edilmesi için tekrarlanabilir bir yöntem sunarak, nöroinflamatuar araştırmalar için fizyolojik olarak ilgili in vitro modellerin oluşturulmasına olanak tanır. Manyetik CD11b tabanlı ayırma yoluyla yüksek saflık ve canlılık sağlayarak bu yaklaşım, MSS bozukluklarına yönelik hedef doğrulama ve assay geliştirme süreçlerinde mekanistik risk azaltmayı destekler. Yöntem, mikroglial fonksiyonelliği ve in vivo koşulları yakından taklit eden aktivasyon durumlarını koruyarak, preklinik taramalardaki öngörü güvenilirliğini artırır.
Biyofarma Ar-Ge'de Stratejik Uygulamalar
Erken Keşif ve Hedef Doğrulama
- Bilimsel Değer: Nörogelişimsel ve nörodejeneratif hastalık hipotezleri ile ilgili mikroglial aktivasyon fenotiplerinin ve pro-inflamatuar yanıtların incelenmesine olanak tanır.
- Operasyonel Değer: Biyolojik değişkenliği azaltan ve tutarlı hedef etkileşim çalışmalarını destekleyen, standardize edilmiş, serumsuz bir kültür sistemi sağlar.
Tarama ve Analiz Geliştirme
- Bilimsel Değer: İnflamatuar yolaklarda modülatör bileşiklerin taranması için kantitatif olarak değerlendirilebilir fagositik ve transkripsiyonel çıktılar üretir.
- Operasyonel Değer: Çok kuyucuklu plaka düzenekleri ve zaman serisi stimülasyon analizleri ile uyumlu, ölçeklenebilir vele tekrarlanabilir bir izolasyon iş akışı sunar.
Translasyonel ve Preklinik Araştırmalar
- Bilimsel Değer: Mikroglial kimlik belirteçlerini (örn. CX3CR1) ve IL-1β/IFN-γ ile LPS gibi uyarılara verilen fonksiyonel yanıtları koruyarak hastalığa özgü modellemeyi destekler.
- Operasyonel Değer: Standardize saflaştırma ile akış sitometrisi ve konfokal mikroskopi aracılığıyla gerçekleştirilen fonksiyonel doğrulama sayesinde, keşif aşamasından preklinik doğrulamaya kadar olan translasyonel sürekliliği kolaylaştırır.
Pipeline ve İş Akışı Entegrasyonu
Bu yöntem, hipotez testi, analiz hazırlığı ve öncü bileşik tanımlama ile preklinik risk değerlendirmesine temel oluşturacak veri üretimi için valide edilmiş primer hücreler sağlayarak erken keşif sürecine uyum sağlar.
- Keşif Biyolojisi: Nöroinflamatuar süreçlerdeki yolak katılımını netleştirmek için mikrogliaları izole ederek mekanistik risklerin azaltılmasını sağlar.
- Tarama: Bileşik taraması ve hedef modülasyon çalışmaları için ölçülebilir fagositik ve mRNA çıktılarına sahip, analize hazır hücreler sunar.
- Analitik: Karşılaştırmalı koşul analizleri için fagositik aktivite (Cy3-boncuk alımı) ve gen ekspresyonu (RT-qPCR) dahil olmak üzere kantitatif bağımlı değişken ölçümlerini destekler.
- Translasyonel Araştırma: Fenotipik sadakati ve marker ekspresyonunu koruyarak, preklinik doğrulamada biyobelirteç uyumunu ve sürekliliğini destekler.
- Kurumsal Yeniden Kullanım: MSS hastalık modellerinde mikroglial fonksiyonu inceleyen birden fazla proje genelinde uygulanabilir, yeniden kullanılabilir bir izolasyon platformu oluşturur.
Operasyonel ve Kurumsal Etki
- Bilimsel Değer: Fizyolojik olarak ilgili mikroglial modeller aracılığıyla mekanistik belirsizliği azaltarak hedef doğrulama güvenini artırır.
- Operasyonel Değer: Manyetik ayırma ve tanımlanmış kültür koşullarıyla tekrarlanabilirliği ve standardizasyonu geliştirerek lotlar arası değişkenliği minimize eder.
- Stratejik Değer: Hedef modülasyonu ve inflamatuar yanıt profilleri hakkında güvenilir preklinik veriler sağlayarak karar verme süreçlerini iyileştirir.
- Portföy Etkisi: Doğrulanmış mikroglial etkileşim ve fonksiyonel çıktı verilerine dayanarak, MSS hedeflerinin riskle uyumlu önceliklendirilmesine olanak tanır.
Uygulama Hususları
- Neonatal doku diseksiyonu, enzimatik disosiyasyon ve manyetik hücre ayıklama tekniklerinde uzmanlık gerektirir.
- Hücre ayıklayıcılara (ör. MACS), santrifüjlere ve steril doku kültürü altyapısına erişime bağımlıdır.
- Tutarlı CD11b-pozitif hücre verimi ve canlılığını sağlamak için standartlaştırılmış reaktif hazırlama ve inkübasyon süreleri gereklidir.
- Diğer model sistemlere veya gelişim aşamalarına adaptasyon, disosiyasyon ve ayıklama parametrelerinin optimizasyonunu gerektirebilir.
- Pratik sınırlamalar arasında, kolon geçişi sırasındaki mekanik hassasiyet yer alır; tıkanmayı ve hücre hasarını önlemek için nazik pipetleme yapılması gerekir.
