Name: Peptidomik Çalışmalar için Aminlerin Indirgeyici Metilasyonunu Kullanarak Numune Hazırlama ve Göreli Nicellik (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-11-04T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min
Description: Keşfedin endojen peptidlerin ısı inaktivasyonu ile korunması ve izotopik etiketleme kullanarak LC-MS ile göreli nicelleme yöntemini. Bu teknik, peptidomik çalışmalarda güvenilir ve maliyet etkin analiz sağlar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Burada açıklanan tekniklerin geliştirilmesi ve kullanımı Brezilya Ulusal Araştırma Konseyi hibe 420811/2018-4 (LMC) tarafından desteklendi; Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (www.fapesp.br) 2019/16023-6 (LMC), 2019/17433-3 (LOF) ve 21/01286-1 (MEME) hibeleri verir. Fon sağlayıcılar çalışma tasarımında, veri toplama ve analizinde, yayınlanma kararında veya makalenin hazırlanmasında hiçbir rol oynamamışlardır.

Peptit ekstraksiyonu ve indirgeyici metilasyon için aşağıdaki prosedür daha önce yayınlanan prosedürlerden uyarlanmıştır24,25,26,27. Bu protokol, Ulusal Hayvan Deneyi Kontrol Konseyi'nin (CONCEA) yönergelerine uydu ve Sao Paulo Devlet Üniversitesi Biyobilim Enstitüsü Hayvan Kullanımı Etik Komisyonu (CEUA) tarafından onaylandı. protokol adımları Şekil 1'de gösterilmiştir.
NOT: Tüm sulu çözeltileri ultra saf suda hazırlayın.
1. Peptit ekstraksiyonu
<ol><li>Hücre kültürü<ol>
<li> fetal sığır serumu ve %1 Penisilin-Streptomisin içeren Dulbecco'nun modifiye Eagle's medium'unda %5 CO2'nin altında 37 °C'de 15 cm'lik bir tabakta SHSY5Y hücreleri yetiştirin.</li>
		<li>Her numune için 2-3 plaka kullanın. Hücreleri% 100 birleştiğinde büyütün.</li>
		<li>Amaçlanan tedaviden sonra, hücreleri fosfat tamponlu salin ile iki kez yıkayın. Daha sonra, 10 mL Fosfat tamponlu salin ekleyin, hücreleri kazıyın ve 15 mL'lik bir tüpe toplayın.</li>
		<li>5 dakika boyunca 800 x g'da santrifüj ve süpernatantı çıkarın. Peletin 80 °C'de 1 mL ultra saflaştırılmış deiyonize suda yeniden ıslatılması.</li>
		<li>Tüpün içeriğini (hücresel lisat) 2 mL mikrofuge tüpüne aktarın.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Hayvan dokuları (çoğunlukla sinir dokusu):<ol>
<li>Vahşi tip erkek yetişkin Danio rerio'yu (zebra balığı) ölümcül dozda MS 222 (100 mg/L) ile uyuşturun ve peptidaz ve proteazı devre dışı bırakmak için hemen 8 s mikrodalga radyasyonuna maruz kalın. NOT: Ev tipi mikrodalga fırın kullanılabilir. Tam güçte 8 ila 10 s için 900 W mikrodalga kullanıldı. Kullanılan mikrodalga, beyin sıcaklığını 10 s içinde 80 °C'&gt; çıkarabilmelidir. Numuneler arasında ısıtmada tekrarlanabilirlik, dokuyu mikrodalgada aynı yere yerleştirerek de fayda sağlayacaktır.</li>
		<li>Isı inaktivasyonundan sonra, tüm beyni 2 mL mikrobuj tüpünde toplayın ve analize kadar −80 ° C'de dondurun.</li>
		<li>Doku örneğini 80 °C'de 1 mL ultra saflaştırılmış deiyonize suda yeniden saklayın. 1 sn'lik 30 darbe (4 Hz) kullanarak dokuyu bir probla sonicate edin. NOTLAR: Karaciğer ve böbrek dokuları için 20 sn için 10.000-30.000 rpm'de mekanik bir homojenizatör kullanın. Kas dokuları için, bir porselen pota ve pestle kullanarak sıvı nitrojendeki dokuyu öğütün. Aşağıdaki adımlar hücresel lisat veya homojen doku için aynıdır.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Hücresel lisat veya homojen dokuyu 80 °C'de 20 dakika kuluçkaya yatırın. Sonra, 10-30 dakika buzda soğutun.</li>
	<li>10 mM'lik son konsantrasyon elde etmek için her 1 mL numune hacmi için 10 μL 1 M HCl stok çözeltisi ekleyin. 20 sn boyunca girdap yaparak karıştırın ve 15 dakika boyunca buz üzerinde daha fazla kuluçkaya yatırın. NOT: Asitleşmeden önce, yüksek sıcaklıklarda asitleşmenin neden olduğu peptit bağlarının kırılmasını önlemek için numunenin tamamen soğutulduğuna emin olun.</li>
	<li>Hücresel lisatı veya homojen dokuyu 15 dakika boyunca 4 °C'de 12.000 x g'da santrifüj edin. Süpernatantı düşük bağlayıcı protein mikrosantrifüj tüplerinde toplayın ve -80 ° C'de saklayın.</li>
	<li>Ultrafiltrasyon cihazlarını (10 kDa kesme filtreleri) 3 dakika boyunca 2300 x g'da su ve santrifüj ekleyerek temizleyin. Bu adımı iki kez daha yineleyin.</li>
	<li>Süpernatantı önceden yıkanmış 10 kDa kesme filtrelerine ve santrifüje 2.300 x g'da 4 °C'de 50 dakika boyunca refridgerated santrifüjüne yerleştirin. Akış peptit ekstresini temsil eder.</li>
	<li>Numuneleri, aşağıda açıklandığı gibi asetonitril (ACN) ve trifluoroasetik asit (TFA) çözeltileri kullanarak üreticinin talimatlarına göre ters fazlı temizleme sütunlarındaki tuzdan arındırın:<ol>
<li>Sütunu 0 ACN'nin 1 mL'si ile dengeler.</li>
		<li>Sütunu % 0,1 TFA ile% 5 ACN 1 mL çözelti ile yıkayın.</li>
		<li>Örneğin tüm hacmini sütuna yükleyin.</li>
		<li>Sütunu %0,1 TFA ile %5 ACN 1 mL çözelti ile yıkayın</li>
		<li>Protein düşük bağlayıcı mikrosantrifüj tüplerinde % 0.15 TFA ile% 100 ACN 1.8 mL çözelti ile peptitleri sütundan çıkarın.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Numuneyi tamamen vakumlu santrifüjde kurulayın. Organik çözücüler ve sıcaklık için konsantrasyon yöntemini 30 °C olarak ayarlayın. Konsantrasyon süresi ekranda izlenir.<ol>
<li>Numuneleri bir sonraki adıma kadar −80°C'de saklayın.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. Floresan ile peptit nicelemesi
NOT: Peptit miktarı daha önce açıklandığı gibi pH 6.8'de floresan kullanılarak tahmin edilebilir11,28. Bu yöntem, bir floreskamin molekülünün lizin (K) kalıntılarında ve/veya peptitlerin N-terminalinde bulunan birincil aminlere bağlanmasından oluşur. Reaksiyon pH 6.8'de, floresamin'in serbest amino asitlerle değil, sadece peptitlerin amino gruplarıyla reaksiyona sokulduğunu garanti etmek için gerçekleştirilir. Floresan, 370 nm'lik bir ekscitasyon dalga boyunda ve 480 nm emisyon dalga boyunda bir spektrofluorometre kullanılarak ölçülür.
<ol><li>Standart peptitin farklı konsantrasyonlarını hazırlayın (0.05, 0.1, 0.15, 0.2, 0.3, 0.5 ve 0.7 μg/μL) ve aliquotları -20 °C'de saklayın. NOT: Peptit 5A (LTLRTKL) bilinen bir bileşime ve konsantrasyona sahip olduğu için önerilir.</li>
	<li>Asetonda floresan stok çözeltisi (0,3 mg/mL) hazırlayın. Mikrosantrifüj tüplerde (1 mL) hızlı bir şekilde aliquot, parafilm kullanarak mühürleyin ve karanlıkta -20 °C'de saklayın.</li>
	<li>pH 6.8'de 0.2 M Fosfat tamponu (PB) hazırlayın. NOT: 250 mL suya 0,1 M fosfat tampon pH 6,8 (26,85 mL Na2HPO3 1M) ve 0,1 M fosfat tampon pH 6,8 (23,15 mL NaH2PO3 1M) ekleyerek 0,2 M PB hazırlayın</li>
	<li>Peptit örneklerini 100-200 μL ultra saflaştırılmış suda yeniden sunun.</li>
	<li>Pipet 2.5 μL standart peptit konsantrasyonları ve örnekleri üç taraflı floresan tahlilleri için beyaz 96 kuyu plakası üzerine. 25 μL 0,2 M Fosfat tamponu ekleyin.</li>
	<li>Çok kanallı pipet ile 12,5 μL floresan ekleyin. Yörüngesel rotator çalkalayıcıda 1 dakika boyunca hafifçe homojenize edin.</li>
	<li>Ardından, reaksiyonun durdurulması için çok kanallı pipetli 110 μL su ekleyin. NOT: Floresan stok çözeltisini ve ultra saf suyu, bu çözeltileri çok kanallı bir pipetle pipetle borulamak için iki rezervuara aktarın.</li>
	<li>Spektrofluorometrede aşağıdaki okuma parametrelerini ayarlayın: Örnekleri yukarıdan okuyun, 370 nm'de ekscitasyon dalga boyu ve 480 nm'de emisyon dalga boyu.</li>
	<li>Spektrofluorometredeki plakayı oku.</li>
</ol>3. Aminlerin indirgeyici metilasyonu etiketleme
NOT: Bu izotopik etiketleme yöntemi, formaldehit ve sodyum siyanohidrit reaktiflerinin döterlenmiş ve kısırlaştırılmamış formlarına sahip amin gruplarının dimetilasyonuna dayanmaktadır. Bu reaksiyonun son ürünü, mevcut her etiketleme yerindeki (lizin veya N terminali) her peptitin son kütlesine 28 Da, 30 Da, 32 Da, 34 Da veya 36 Da ekler. Bu reaksiyon MS spektrumunda gözlenen farklı formlarla etiketlenmiş peptitlerde m/z farkı yaratır (Tablo 1).
DİkKAT: Bu bileşikleri işlemek için uygun güvenlik ekipmanları kullanılmalı ve maruziyeti en aza indirmeye özen verilmelidir. Formaldehit ve sodyum siyanoborohidrit reaktifleri ile prosedürler, çok toksik oldukları için (sodyum siyanoborohidritin tartılması dahil) bir duman kaputunda yapılmalıdır. Söndürme reaksiyonu ve asitleşme sırasında toksik bir gaz (hidrojen siyanür) üretilebilir.
<ol><li>İşlem gününde stoktan veya reaktiflerden aşağıdaki taze çözeltileri ultra saf suda hazırlayın:<ol>
<li>% 37 Formaldehit (CH2O) stokunu% 4'e seyreltin.</li>
		<li>% 20 Formaldehit Deuterated (CD2O) stokunu% 4'e seyreltin.</li>
		<li>% 20 Döterlenmiş C13 Formaldehit (13CD2O) stokunu% 4'e seyreltin.</li>
		<li>0,6 M NaBH3CN hazırlayın.</li>
		<li>0,6 m NabD3CN hazırlayın.</li>
		<li>% 1 Amonyum bikarbonat çözeltisi hazırlayın.</li>
		<li>%5 Formik asit çözeltisi hazırlayın. NOT: Peptitlerin bağıl niceliği ile ilgili olarak, kullanılan etiket sayısına bağlı olarak farklı deneysel şemalar yapılabildiğinden, kimyasal etiketleme prosedürü sırasında dikkat edilmesi gerekir. Numune tüplerine yanlış reaktif eklemede insan hatası potansiyelini azaltmak için etiketlerin küçük aliquot'larının ayrı raflarda, etiketlenecek ilgili örneklerle ayrılması önerilir.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Peptit 25 μg'ye kadar olan her numuneyi hazırlayın. Numuneler Tris veya Amonyum Bikarbonat içermemelidir. NOT: Aşağıda açıklanan miktarlar 100 μL hacimdeki her numune için yeterlidir. Duman kaputunda 3.3-3.8 adımlarına devam edin.</li>
	<li>Numunelere 1/10.cilt 1 M TEAB ekleyin (çözeltinin son konsantrasyonu 100 mM TEAB). pH gösterge kağıdı ile pH'ı kontrol edin; 5-8 arasında olmalıdır. Gerekirse HCl veya NaOH ile ayarlayın.</li>
	<li>Belirlenen etiketleme şemasına göre 4 μL döterlenmemiş, döterlenmiş Formaldehit veya C13 döterlenmiş Formaldehit ekleyin. Girdapla 5 sn karıştırın.</li>
	<li>Belirlenen etiketleme şemasına göre 4 μL NaBH3CN (0,6 M) veya NaBD3CN (0,6 M) ekleyin. Girdapla 5 sn karıştırın.</li>
	<li>Her 30 dakikada bir karıştırarak oda sıcaklığında 2 saat boyunca duman kaputunda kuluçkaya yaslanın.</li>
	<li>3.4 ve 3.5. Numuneleri oda sıcaklığında bir gecede duman kaputunda kuluçkaya yatırın.</li>
	<li>16 μL Amonyum bikarbonat (%1) ekleyin ve girdapla karıştırın. Numuneyi buza yerleştirin, 8 μL formik asit ekleyin (%5) ve 5 sn boyunca girdapla karıştırın.</li>
	<li>Örnekleri birleştirin, pH'ı 2-4 olarak ayarlayın ve daha önce adım 1.8'de açıklandığı gibi ters fazlı temizleme sütunlarındaki birleşik örnekleri tuzdan arındırın.</li>
	<li>Numuneyi tamamen vakumlu santrifüjde kurulayın. Organik çözücüler ve sıcaklık için konsantrasyon yöntemini 30 °C olarak ayarlayın. Konsantrasyon süresi ekranda izlenir.</li>
	<li>Numuneleri -20 °C'de saklayın.</li>
</ol>4. Sıvı kromatografisi ve kütle spektrometresi
<ol><li>Metil etiketlerle uyumlu bir MS cihazına bağlı bir nanoHPLC sistemi kullanarak LC-MS analizi yapın. NOT: Çeşitli MS cihazları RMA etiketleme ile uyumludur. Orbitrap ile birleştirilmiş bir nanoHPLC sistemi tipik olarak bir nanoelekrospray iyon kaynağı üzerinden LC-MS analizi yapmak için kullanılır. İlk olarak, örnek analitik bir sütunda ayrılmış bir önkolumna ve peptitlere yüklenir. Peptitlerin elüasyonu, 200 nL / dk'lık bir akışla, 90 dakika boyunca% 0.1 formik asitte% 5-45 asetonitril doğrusal bir gradyan kullanılarak gerçekleştirilir. Kütle spektrometresi veriye bağımlı modda çalışmaya ayarlanır. Her tam tarama 10-30 eV, 2.3 Kv şiddette elde edilir ve daha sonra çarpışmaya bağlı ayrışma (CID) parçalanması için en yüksek on tepe seçilir. Enjeksiyon süresi iyon tuzağına 100 ms olarak ayarlanır ve Fourier Transform (FT)-MS enjeksiyonu m/z 300-1800'de 1000 ms 30.000 çözünürlükte sabitlenir. Parçalanma taraması yapmak için en az 5000 sayım ve 70 s dinamik dışlama kullanılır.</li>
</ol>5. Peptitlerin bağıl niceliği
NOT: MS spektrumları kütle spektrometresi yazılımında analiz edilir. MS spektrumunda farklı etiketlere sahip etiketli peptitlerin tepe grupları tanımlanır. Göreli nicelik, her monoisotopik tepenin yoğunluğu ile hesaplanır. Tedavi edilen her grup ilgili kontrol grubu ile karşılaştırılmıştır.
<ol><li>Spektrum analiz yazılımını açmak için ham örnek dosyaya sağ çift tıklayın. Saklama süresi (RT) ve MS spektrumu (EM) kromatogramlarını sırasıyla üst ve alt olmak üzere iki sekmeye yükleyin.</li>
	<li>Yazılım araç çubuğundaki Görüntü ve Kütle seçenekleri simgelerinde sırayla bir kez sağ tıklatın ve kütle duyarlılığını dört ondalık olarak ayarlayın.</li>
	<li>Fare imlecini RT sekmesinde herhangi bir yere yerleştirin. Analiz edilecek ilgili iyonun saklama süresini arayın ve sağ fare düğmesini tıklatın. Seçilen sürenin MS spektrumu otomatik olarak EM sekmesinde gösterilir.</li>
	<li>Fare imlecini EM sekmesinde herhangi bir yere yerleştirin. Analiz edilecek iyonları arayın.</li>
	<li>Sağ tıklatın ve bu iyonların yakınında soldaki bitişik bir bölgede tutun. Ardından, ilgi çekici bölgeyi yakınlaştırmak için fareyi istediğiniz aralıkta sağa sürükleyin.</li>
	<li>Fareyi EM sekmesinde tutun ve analiz edilecek iyon aralığını tanımlamak için sağ veya sol klavye oklarını tıklatın.</li>
	<li>Fare imlecini RT sekmesini istediğiniz zaman aralığının başına yeniden yerleştirin.</li>
	<li>Fareyi sağ tıklatın ve seçilen saat değerine kadar sürükleyin. Düğmeyi bırak. Iyonların birikmiş yoğunluğu otomatik olarak EM sekmesinde gösterilir.</li>
	<li>Elektronik tablodaki m/z, z ve iyon yoğunluğu verilerini toplayın. NOT: Metil grupları eklenmeden her peptitin monoisotopik kütlesi aşağıdaki formülden hesaplanır: Kütle değiştirilmemiş peptit = (m/z a x z) - (C a x T) - (1.008 x z) m/zais, farklı etiket kombinasyonlarıyla etiketlenmiş her peptit için monoisotopik tepe için değeri şarj etmek için gözlenen kütledir (örnek sayıya karşılık gelen = 1, 2, 3, 4 veya 5). z şarj durumudur. Ca, bir çift metil grubunun monoisotopik kütlesi: a=1 için Ca = 28.0313 (birincil amine iki CH3 grubunun net eklenmesi) a=2 için Ca = iki CHD2 grubu için 30.0439 a=3 için Ca = iki CD2H grubu için 32.0564 a=4 için Ca= iki CD3 grubu için 34.0690 A=5 için Ca = iki 13 CD3 grubu için 36.0757 T , peptide dahil edilen metil gruplarının sayısıdır. Bu, beş etiket kullanıldığında aşağıdaki formülden hesaplanabilir: T=z*(m/z5 - m/z1)/8. Tek bir birincil amin içeren ve bu nedenle bitişik etiketler kullanıldığında MS spektrumunda yalnızca iki metil grubuyla etiketlenen peptitler için tepe örtür. Etiketli her peptitin tepe yoğunluğu Tashima ve Fricker25 tarafından açıklanan denklemler kullanılarak düzeltilebilir.</li>
</ol>6. Peptit Tanımlama
<ol><li>Peptitleri tanımlamak için, ms/ms verilerini bir veritabanı arama motoru kullanarak analiz edin29,30.</li>
	<li>Sahte bulma hızını (FDR) yem füzyon yöntemini kullanarak hesaplamak için bir yem veritabanında arama yapın. NOT: Genellikle kullanılan arama parametreleri enzim özgüllüğü yoktur; öncül kütle toleransı seti 15-50 ppm; 0,5 Da'nın parça iyon kütle toleransı; değişken değişiklikler: Peptit izotopik metillenmiş etiketlerin Lys kalıntılarından ve N-terminusundan reaktif aminler (L1 (+28), L2 (+30), L3 (+). 32), L4 (+34) ve L5 (+36)), oksitlenmiş metiyonin (+15.99 Da) ve asetilasyon (+42.01 Da).</li>
	<li>Ardından, peptitleri yerel güven ortalamalarına göre sıralayarak açıklama eklemek için en iyi spektrumları seçin ve FDR'ye göre filtreleyin ≤5%.</li>
</ol><img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62971/62971fig01.jpg"> Şekil 1: Peptidomik çalışmalar iş akışı. Peptit ekstraksiyonu ve Aminlerin Indirgeyici Metilasyonu adımları. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62971/62971fig01large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>

<ol><li>Kandpal, R., Saviola, B., Felton, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+era+of+%27omics+unlimited%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechniques%22%5BJournal%5D)">The era of 'omics unlimited.</a> Biotechniques. 46 (5), 354-355 (2009).</li>
<li>Farrokhi, N., Whitelegge, J. P., Brusslan, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plant+peptides+and+peptidomics%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Biotechnology+Journal%22%5BJournal%5D)">Plant peptides and peptidomics.</a> Plant Biotechnology Journal. 6 (2), 105-134 (2008).</li>
<li>Schulz-Knappe, P., Schrader, M., Zucht, H. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+peptidomics+concept%5BTitle%5D)+AND+%22Combinatorial+Chemistry+%26+High+Throughput+Screening%22%5BJournal%5D)">The peptidomics concept.</a> Combinatorial Chemistry & High Throughput Screening. 8 (8), 697-704 (2005).</li>
<li>Dallas, D. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Current+peptidomics%3A+applications%2C+purification%2C+identification%2C+quantification%2C+and+functional+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Proteomics%22%5BJournal%5D)">Current peptidomics: applications, purification, identification, quantification, and functional analysis.</a> Proteomics. 15 (5-6), 1026-1038 (2015).</li>
<li>Chard, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+introduction+to+radioimmunoassay+and+related+techniques+%283rd+Ed%29%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+Letters%22%5BJournal%5D)">An introduction to radioimmunoassay and related techniques (3rd Ed).</a> FEBS Letters. 238 (1), 223(1988).</li>
<li>Svensson, M., Sköld, K., Svenningsson, P., Andren, P. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Peptidomics-based+discovery+of+novel+neuropeptides%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Proteome+Research%22%5BJournal%5D)">Peptidomics-based discovery of novel neuropeptides.</a> Journal of Proteome Research. 2 (2), 213-219 (2003).</li>
<li>Baggerman, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Peptidomics%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Chromatography+B%22%5BJournal%5D)">Peptidomics.</a> Journal of Chromatography B. 803, 3-16 (2004).</li>
<li>Theodorsson, E., Stenfors, C., Mathe, A. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microwave+irradiation+increases+recovery+of+neuropeptides+from+brain+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Peptides%22%5BJournal%5D)">Microwave irradiation increases recovery of neuropeptides from brain tissues.</a> Peptides. 11, 1191-1197 (1990).</li>
<li>Che, F. Y., Lim, J., Pan, H., Biswas, R., Fricker, L. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+neuropeptidomics+of+microwave-irradiated+mouse+brain+and+pituitary%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+%26+Cellular+Proteomics%22%5BJournal%5D)">Quantitative neuropeptidomics of microwave-irradiated mouse brain and pituitary.</a> Molecular & Cellular Proteomics. 4, 1391-1405 (2005).</li>
<li>Dasgupta, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+the+yeast+peptidome+and+comparison+with+the+human+peptidome%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Analysis of the yeast peptidome and comparison with the human peptidome.</a> PLoS One. 11 (9), 0163312(2016).</li>
<li>Teixeira, C. M. M., Correa, C. N., Iwai, L. K., Ferro, E. S., Castro, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+Intracellular+Peptides+from+Zebrafish+%28Danio+rerio%29+Brain%5BTitle%5D)+AND+%22Zebrafish%22%5BJournal%5D)">Characterization of Intracellular Peptides from Zebrafish (Danio rerio) Brain.</a> Zebrafish. 16 (3), 240-251 (2019).</li>
<li>Fricker, L. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+mouse+brain+peptides+using+mass+spectrometry-based+peptidomics%3A+implications+for+novel+functions+ranging+from+non-classical+neuropeptides+to+microproteins%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+BioSystems%22%5BJournal%5D)">Analysis of mouse brain peptides using mass spectrometry-based peptidomics: implications for novel functions ranging from non-classical neuropeptides to microproteins.</a> Molecular BioSystems. 6 (8), 1355-1365 (2010).</li>
<li>Gelman, J. S., Sironi, J., Castro, L. M., Ferro, E. S., Fricker, L. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Peptidomic+analysis+of+human+cell+lines%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Proteome+Research%22%5BJournal%5D)">Peptidomic analysis of human cell lines.</a> Journal of Proteome Research. 10 (4), 1583-1592 (2011).</li>
<li>De Araujo, C. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intracellular+peptides+in+cell+biology+and+pharmacology%5BTitle%5D)+AND+%22Biomolecules%22%5BJournal%5D)">Intracellular peptides in cell biology and pharmacology.</a> Biomolecules. 9, 150(2019).</li>
<li>Gewehr, M. C. F., Silverio, R., Rosa-Neto, J. C., Lira, F. S., Reckziegel, P., Ferro, E. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Peptides+from+natural+or+rationally+designed+sources+can+be+used+in+overweight%2C+obesity%2C+and+type+2+diabetes+therapies%5BTitle%5D)+AND+%22Molecules%22%5BJournal%5D)">Peptides from natural or rationally designed sources can be used in overweight, obesity, and type 2 diabetes therapies.</a> Molecules. 25 (5), 1093(2020).</li>
<li>Sakaya, G. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Peptidomic+profiling+of+cerebrospinal+fluid+from+patients+with+intracranial+saccular+aneurysms%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Proteomics%22%5BJournal%5D)">Peptidomic profiling of cerebrospinal fluid from patients with intracranial saccular aneurysms.</a> Journal of Proteomics. 240 (3), 104188(2021).</li>
<li>Fricker, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+peptidomics%3A+General+considerations%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Quantitative peptidomics: General considerations.</a> Methods in Molecular Biology. 1719, 121-140 (2018).</li>
<li>Southey, B. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparing+label-free+quantitative+peptidomics+approaches+to+characterize+diurnal+variation+of+peptides+in+the+rat+suprachiasmatic+nucleus%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Comparing label-free quantitative peptidomics approaches to characterize diurnal variation of peptides in the rat suprachiasmatic nucleus.</a> Analytical Chemistry. 86 (1), 443-452 (2014).</li>
<li>Chen, X., Wei, S., Ji, Y., Guo, X., Yang, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+proteomics+using+SILAC%3A+Principles%2C+applications%2C+and+developments%5BTitle%5D)+AND+%22Proteomics%22%5BJournal%5D)">Quantitative proteomics using SILAC: Principles, applications, and developments.</a> Proteomics. 15 (18), 3175-3192 (2015).</li>
<li>Boonen, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+peptidomics+with+isotopic+and+isobaric+tags%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Quantitative peptidomics with isotopic and isobaric tags.</a> Methods in Molecular Biology. 1719, 141-159 (2018).</li>
<li>Gewehr, M. C. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+relevance+of+thimet+oligopeptidase+in+the+regulation+of+energy+metabolism+and+diet-induced+obesity%5BTitle%5D)+AND+%22Biomolecules%22%5BJournal%5D)">The relevance of thimet oligopeptidase in the regulation of energy metabolism and diet-induced obesity.</a> Biomolecules. 10 (2), 321(2020).</li>
<li>Fiametti, L. O., Correa, C. N., Castro, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Peptide+profile+of+zebrafish+brain+in+a+6-OHDA-induced+Parkinson+model%5BTitle%5D)+AND+%22Zebrafish%22%5BJournal%5D)">Peptide profile of zebrafish brain in a 6-OHDA-induced Parkinson model.</a> Zebrafish. 18 (1), 55-65 (2021).</li>
<li>Boersema, P. J., Raijmakers, R., Lemeer, S., Mohammed, S., Heck, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiplex+peptide+stable+isotope+dimethyl+labeling+for+quantitative+proteomics%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Multiplex peptide stable isotope dimethyl labeling for quantitative proteomics.</a> Nature Protocols. 4 (4), 484-494 (2009).</li>
<li>Dasgupta, S., Castro, L. M., Tashima, A. K., Fricker, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+peptidomics+using+reductive+methylation+of+amines%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Quantitative peptidomics using reductive methylation of amines.</a> Methods in Molecular Biology. 1719, 161-174 (2018).</li>
<li>Tashima, A. K., Fricker, L. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+peptidomics+with+five-plex+reductive+methylation+labels%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Society+for+Mass+Spectrometry%22%5BJournal%5D)">Quantitative peptidomics with five-plex reductive methylation labels.</a> Journal of the American Society for Mass Spectrometry. 29 (5), 866-878 (2018).</li>
<li>Che, F. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimization+of+neuropeptide+extraction+from+the+mouse+hypothalamus%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Proteome+Research%22%5BJournal%5D)">Optimization of neuropeptide extraction from the mouse hypothalamus.</a> Journal of Proteome Research. 6 (12), 4667-4676 (2007).</li>
<li>Lyons, P. J., Fricker, L. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Peptidomic+approaches+to+study+proteolytic+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Protocols+in+Protein+Science%22%5BJournal%5D)">Peptidomic approaches to study proteolytic activity.</a> Current Protocols in Protein Science. , Chapter 18 13(2011).</li>
<li>Udenfriend, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescamine%3A+a+reagent+for+assay+of+amino+acids%2C+peptides%2C+proteins%2C+and+primary+amines+in+the+picomole+range%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Fluorescamine: a reagent for assay of amino acids, peptides, proteins, and primary amines in the picomole range.</a> Science. 178 (4063), 871-872 (1972).</li>
<li>Ma, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PEAKS%3A+powerful+software+for+peptide+de+novo+sequencing+by+tandem+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Rapid+Communications+in+Mass+Spectrometry%22%5BJournal%5D)">PEAKS: powerful software for peptide de novo sequencing by tandem mass spectrometry.</a> Rapid Communications in Mass Spectrometry. 17 (20), 2337-2342 (2003).</li>
<li>Zhang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PEAKS+DB%3A+de+novo+sequencing+assisted+database+search+for+sensitive+and+accurate+peptide+identification%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+%26+Cellular+Proteomics%22%5BJournal%5D)">PEAKS DB: de novo sequencing assisted database search for sensitive and accurate peptide identification.</a> Molecular & Cellular Proteomics. 11 (4), 1-8 (2012).</li>
<li>Sturm, R. M., Dowell, J. A., Li, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rat+brain+neuropeptidomics%3A+tissue+collection%2C+protease+inhibition%2C+neuropeptide+extraction%2C+and+mass+spectrometric+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Rat brain neuropeptidomics: tissue collection, protease inhibition, neuropeptide extraction, and mass spectrometric analysis.</a> Methods in Molecular Biology. 615, 217-226 (2010).</li>
<li>Fricker, L. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Limitations+of+mass+spectrometry-based+peptidomic+approaches%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Society+for+Mass+Spectrometry%22%5BJournal%5D)">Limitations of mass spectrometry-based peptidomic approaches.</a> Journal of the American Society for Mass Spectrometry. 26 (12), 1981-1991 (2015).</li>
<li>Ross,, et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiplexed+protein+quantitation+in+Saccharomyces+cerevisiae+using+amine-reactive+isobaric+tagging+reagents%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+%26+Cellular+Proteomics%22%5BJournal%5D)">Multiplexed protein quantitation in Saccharomyces cerevisiae using amine-reactive isobaric tagging reagents.</a> Molecular & Cellular Proteomics. 3, 1154-1169 (2004).</li>
<li>Thompson, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tandem+mass+tags%3A+a+novel+quantification+strategy+for+comparative+analysis+of+complex+protein+mixtures+by+MS%2FMS%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Tandem mass tags: a novel quantification strategy for comparative analysis of complex protein mixtures by MS/MS.</a> Analytical Chemistry. 75, 1895-1904 (2003).</li>
</ol>

Rakip finansal çıkarlar yok.

Çoğu peptidomik çalışmada, kritik adımlardan biri, şüphesiz, proteazlar tarafından üretilen peptit parçalarının ölümünden birkaç dakika sonra varlığını önlemek için dikkatlice yapılması gereken örnek preparattır. Mikrodalga olmayan örneklerden hazırlanan beyin özleri üzerinde yapılan ilk çalışmalarda, 10 kDa mikrofiltratlarda çok sayıda protein parçasının bulunduğu görüldü. Protein bozulmasından peptit spektrumunu önlemek için farklı yaklaşımlar tanımlanmıştır: odaklanmış mikrodalga ışınlama hayvan kurban <sup class="xre...

"Omics" bilimleri, DNA, RNA, proteinler, peptitler, metabolitler vb. Bu büyük ölçekli veri kümeleri (genomik, transkriptomik, proteomik, peptidomik, metabolomik vb.) biyolojide devrim yaratmış ve biyolojik süreçlerin ileri düzeyde anlaşılmasına yol açmıştır1. Peptidomik terimi 20. Bununla birlikte, peptidomiklerin belirgin özellikleri vardır, burada ana ilgi hücresel süreçler sırasında doğal olarak üretilen peptit içeriğini ve bu moleküllerin biyolojik aktivitesinin karakterizasyonunu araştırmaktır3,4.
Başlangıçta, biyoaktif peptit çalışmaları Edman bozulması ve radyoimmünoassay yoluyla nöropeptitler ve hormon peptitleri ile sınırlandırıldı. Bununla birlikte, bu teknikler, her peptitin yüksek konsantrasyonlarda izolasyonuna, antikorların üretilmesi için zamana bağlı olarak, çapraz reaktivite olasılığının yanı sıra küresel bir analize izin vermez5.
Peptidomik analizi ancak Sıvı kromatografisi kütle spektrometresi (LC-MS) ve proteomik/peptidomik çalışmaları için kapsamlı veri havuzları sağlayan genom projelerinde birkaç ilerlemeden sonra mümkün oldu6,7. Ayrıca, peptidomlar için belirli bir peptit ekstraksiyon protokolünün oluşturulması gerekiyordu, çünkü beyin örneklerinde nöropeptidleri küresel olarak analiz eden ilk çalışmalar, tespitin proteinlerin büyük ölçüde bozulmasından etkilendiğini gösterdi, bu da esas olarak bu dokuda 1 dakika sonra meydana geldi. Bu peptit parçalarının varlığı nöropeptid sinyalini maskeledi ve peptidom in vivo'yu temsil etmedi. Bu sorun esas olarak mikrodalga ışınlama kullanılarak proteazların hızlı ısınma inaktivasyonu uygulaması ile çözüldü, bu da bu eser parçalarının varlığını büyük ölçüde azalttı ve sadece nöropeptid parçalarının tanımlanmasına izin vermedi, aynı zamanda sitosolik, mitokondriyal ve nükleer proteinlerden bir dizi peptidin varlığını ortaya çıkardı, bozulmadan farklı6,8,9.
Bu metodolojik prosedürler, peptidomun, esas olarak proteazomların etkisiyle üretilen yüzlerce hücre içi peptitin maya10, zebra balığı11, kemirgen dokuları12 ve insan hücrelerinde tanımlandığı tanınmış nöropeptitlerin ötesine genişlemesine izin verdi13. Bu hücre içi peptitlerin düzinelercesinin hem biyolojik hem de farmakolojik aktiviteleri olduğu yaygın olarak gösterilmiştir14,15. Ayrıca, bu peptitler intrakraniyal sakküler anevrizması olan hastalardan beyin omurilik sıvısında gösterildiği gibi hastalık biyobelirteçleri olarak kullanılabilir ve muhtemelen klinik öneme sahiptir16.
Şu anda, peptit dizilerinin tanımlanmasına ek olarak, mutlak ve göreceli nicelik verilerini elde etmek için kütle spektrometresi ile mümkündür. Mutlak nicellikte, biyolojik bir numunedeki peptit seviyeleri sentetik standartlarla karşılaştırılırken, göreceli nicelikte peptit seviyeleri iki veya daha fazla örnek arasında karşılaştırılır17. Göreli nicelik aşağıdaki yaklaşımlar kullanılarak gerçekleştirilebilir: 1) "etiketsiz"18; 2) in vivo metabolik etiketleme veya 3) kimyasal etiketleme. Son ikisi peptitlere dahil edilmiş kararlı izotopik formların kullanımına dayanmaktadır19,20. Etiketsiz analizde, peptit seviyeleri LC-MS18 sırasında sinyal gücü (spektral sayımlar) dikkate alınarak tahmin edilir. Bununla birlikte, izotopik etiketleme daha doğru bağıl peptit seviyeleri elde edebilir.
Birçok peptidomik çalışmada trimetilamimonyum bütirat (TMAB) reaktifleri kimyasal etiketleme olarak etiketlenerek ve daha yakın zamanda, Aminlerin (RMA) döterlenmiş ve döterlenmemiş formaldehit ve sodyum siyanoborohidrit reaktif formları ile indirgeyici Metilasyonu kullanılmıştır11,21,22. Bununla birlikte, TMAB etiketleri ticari olarak mevcut değildir ve sentez süreci çok zahmetlidir. Öte yandan, RMA'da, reaktifler ticari olarak mevcuttur, diğer etiketlere kıyasla ucuzdur, prosedürün gerçekleştirilmesi kolaydır ve etiketli peptitler kararlıdır23,24.
RMA kullanımı, peptitlerin formaldehit ile reaksiyona girmesine izin vererek bir Schiff tabanı oluşturmayı ve ardından siyanoborohidrit yoluyla bir azaltma reaksiyonunun oluşturulmasını içerir. Bu reaksiyon, N-terminallerinde ve lizin yan zincirlerinde ve monometrilatlar N-terminal prolines'larında serbest amino grupların dimetilasyonuna neden olur. Prolin kalıntılarının N-terminalinde genellikle nasıl nadir olduğu, pratik olarak N-terminusta serbest aminlere sahip tüm peptitler iki metil grubu ile etiketlenmiştir23,24,25.

<table><tbody><tr><td>10 kDa kesme filtreleri</td><td>Merck Millipore</td><td>UFC801024</td><td>Amicon Ultra-4, PLGC Ultracel-PL Membran, 10 kDa</td></tr><tr><td>Aseton</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>179124</td><td></td></tr><tr><td>Asetonitril</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>1000291000</td><td></td></tr><tr><td>Amonyum bikarbonat</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>11213</td><td></td></tr><tr><td>analitik kolon (EASY-Column)</td><td>EASY-Column</td> <td>(SC200)</td><td>&nbsp; 10 cm, ID75 ve mikro; m, 3 ve mikro; m, C18-A2</td></tr><tr><td>Etil 3-aminobenzoat metansülfonat</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E10521</td><td>MS-222</td></tr><tr><td>Floresidamin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F9015</td><td></td></tr><tr><td>Formaldehit çözeltisi</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>252549</td><td></td></tr><tr><td>Formaldehit-13C, d2, çözelti</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>596388</td><td></td></tr><tr><td>Formaldehit-d2 çözelti</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>492620</td><td></td></tr><tr><td>Formik asit</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>33015</td><td></td></tr><tr><td>Çeker ocak</td><td>Quimis</td><td>Q216</td><td></td></tr><tr><td>Hidroklorik asit - HCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>258148</td><td></td></tr><tr><td>LoBind-Protein tutma tüpleri</td><td>Eppendorf</td><td>EP0030108116-100EA</td><td></td></tr><tr><td>LTQ-Orbitrap Velos</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>LTQ Velos</td><td></td></tr><tr><td>Mikrodalga fırın</td><td>Panasonic</td><td>NN-ST67HSRU</td><td></td></tr><tr><td>n Easy-nLC II nanoHPLC</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>LC140</td><td></td></tr><tr><td>PEAKS Studio</td><td>Biyoinformatik Çözümleri A.Ş.</td><td>VERSİYON 8.5</td><td></td></tr><tr><td>Fosfat tamponlu salin</td><td>Invitrogen</td><td>3002</td><td>tabletler</td></tr><tr><td>ön kolon (EASY-Column)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>(SC001)</td><td>2 cm, ID100 & mikro; M, 5 ve mikro; m, C18-A1</td></tr><tr><td>Konik tüpler için</td><td>soğutmalı santrifüj</td><td>Hermle</td><td>Z326K</td></tr><tr><td>Mikrotüpler için</td><td>soğutmalı santrifüj</td><td>Vision</td><td>VS15000CFNII</td></tr><tr><td>Ters fazlı temizleme kolonları&nbsp; &nbsp; (Oasis HLB 1 cc Kartuş)</td><td>Sular</td><td>186000383</td><td>Oasis HLB 1 cc Kartuş</td></tr><tr><td>Sodyum siyanoborodeuteride - NaBD 3CN</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>190020</td><td></td></tr><tr><td>Sodyum siyanoborohidrit - NaBH 3CN</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>156159</td><td></td></tr><tr><td>Sodyum fosfat dibazik</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S9763</td><td>NOT: 0,2 M PB= 0,1 M fosfat tampon pH 6,8 (26,85 mL Na2HPO<>sub3 1M) artı 0,1 M fosfat tamponu pH 6,8 (23,15 mL NaH2PO3 1M) ila 250 ml su</td></tr><tr><td>Sodyum fosfat monobazik</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S3139</td><td></td></tr><tr><td>Sonikatör</td><td>Qsonica</td><td>Q55-110</td><td></td></tr><tr><td>Standart peptit</td><td>Proteimax</td><td></td><td>amino asit dizisi: LTLRTKL</td></tr><tr><td>Trietilamonyum tamponu - TEAB 1 M</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T7408</td><td></td></tr><tr><td>Trifloroasetik asit - TFA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T6508</td><td></td></tr><tr><td>Ultra arıtılmış su</td><td>Milli-Q</td><td>Direct-Q 3UV</td><td></td></tr><tr><td>Vakumlu santrifüj</td><td>GeneVac</td><td>MiVac DNA yoğunlaştırıcı</td><td></td></tr><tr><td>Su banyosu</td><td>Cientec</td><td>266</td><td></td></tr><tr><td>Xcalibur Yazılım</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>OPTON-30965</td><td></td></tr></tbody></table>

peptidomik Çalışmalar için aminlerin indirgeyici metilasyonunu kullanarak numune hazırlama ve göreli nicellik

Sample Preparation and Relative Quantitation using Reductive Methylation of Amines for Peptidomics Studies

Peptidomik, biyolojik bir örnekteki peptitlerin nitel ve nicel analizi olarak tanımlanabilir. Başlıca uygulamaları arasında hastalık veya çevresel stresin peptit biyobelirteçlerinin tanımlanması, nöropeptidlerin, hormonların ve biyoaktif hücre içi peptitlerin tanımlanması, protein hidrolisatlarından antimikrobiyal ve nutraceutical peptitlerin keşfedilmesi ve proteolitik süreçlerin anlaşılması için yapılan çalışmalarda kullanılabilecektir. Numune hazırlama, ayırma yöntemleri, kütle spektrometresi teknikleri ve protein dizilimi ile ilgili hesaplamalı araçlardaki son gelişmeler, tanımlanan peptit sayısının ve karakterize peptidomların artmasına katkıda bulunmuştur. Peptidomik çalışmalar sıklıkla hücrelerde doğal olarak üretilen peptitleri analiz eder. Burada, ısı inaktivasyonuna dayanan, proteaz aktivitesini ortadan kaldıran ve hafif koşullarla ekstraksiyon yapan bir örnek hazırlama protokolü tanımlanmıştır, bu nedenle peptit bağları bölünmesi yoktur. Ek olarak, aminlerin indirgeyici metilasyonu ile kararlı izotop etiketlemesi kullanılarak peptitlerin bağıl niceliği de gösterilmiştir. Reaktifler ticari olarak mevcut, diğerlerine göre ucuz, kimyasal olarak kararlı ve tek bir LC-MS çalışmasında beş numunenin analizine izin verdiğinden, bu etiketleme yönteminin bazı avantajları vardır.

Kütle spektrometresi üzerinde gerçekleştirilen çalışmalardan elde edilen sonuçlar, kütle spektrometresi yazılımında açılabilen ham veri dosyalarında saklanır. MS spektrumunda, 2-5 etiket arasında değişen etiketli peptitleri temsil eden tepe gruplarını kullanılan etiketleme şemasına göre gözlemlemek mümkündür. Örneğin, Şekil 2'de, kromatografik bir zamanda algılanan tepe çiftleri, aynı çalıştırmada iki farklı örnekte yalnızca iki izotopik etiketin kullanıldığı bir denemede temsil edilir. <str...

Bu makalede, ölüm sonrası bozulmayı önleyen endojen peptitleri korumak için ısı inaktivasyonuna dayanan bir örnek hazırlama yöntemi ve ardından izotopik etiketleme artı LC-MS kullanarak göreli nicelik açıklanmaktadır.

Peptidomik Çalışmalar için Aminlerin Indirgeyici Metilasyonunu Kullanarak Numune Hazırlama ve Göreli Nicellik

Peptidomics can be defined as the qualitative and quantitative analysis of peptides in a biological sample. Its main applications include identifying the ...

Burada, doğal hücre içi peptitleri korumak, hücre ve dokulardaki bozulmayı önlemek ve ardından izotopik etiketleme kullanarak peptitlerin göreceli nicelliğini önlemek için proteazın hızlı ısı inaktivasyonuna dayanan bir öğretim yöntemi açıklıyoruz. Bu etiketleme yönteminin çok fazla avantajı vardır. Reaktifler ticari olarak mevcuttur, ucuzdur, kimyasal olarak kararlıdır ve tek bir serumda beş numunenin analizini sağlar.DMEM'de %15 FBS ve %1 penisilin streptomisin içeren 15 santimetrelik bir tabakta insan nöroblastom hücrelerini yetiştirerek başlayın. Hücreleri %5 karbondioksitin altında 37 santigrat derecede koruyun. Hücreleri PBS ile iki kez yıkayın, ardından 10 mililitre PBS ekleyin, hücreleri kazıyın ve 15 mililitrelik bir tüpe toplayın.Hücreleri beş dakika boyunca 800 kez G'de santrifüjleyin ve üst düğmeyi çıkarın. Peletin bir mililitre ultra saflaştırılmış deiyonize suyunda 80 santigrat derecede yeniden ıslatın, ardından tüpün içeriğini iki mililitrelik bir mikrofuge tüpüne aktarın. Zebra balıklarının ısı inaktivasyonundan sonra, tüm beyni iki mililitrelik bir mikroyakıt tüpünde toplayın ve analize kadar eksi 80 santigrat derecede dondurun.Doku örneğini 80 santigrat derecede ultra saflaştırılmış deiyonize suyun bir mililitresinde yeniden dirilt ve bir saniyede 30 darbe kullanarak bir probla sonicate. Hücresel lisat veya homojen dokuyu 80 santigrat derecede 20 dakika kuluçkaya yatırın, sonra 10 ila 30 dakika buzda soğutun. Her bir mililitre numune hacmi için bir molar hidroklorik asit stok çözeltisinin 10 mikrolitresini ekleyin.20 saniye boyunca girdapla karıştırın ve 15 dakika buzda kuluçkaya yatır. Hücresel lisatı veya homojen dokuyu 15 dakika boyunca dört santigrat derecede 12.000 kez G'de santrifüjleyin. Süpernatantı düşük bağlayıcı protein mikrosantrifüj tüplerinde toplayın ve eksi 80 santigrat derecede saklayın.Ultrafiltrasyon cihazlarını üç dakika boyunca 2.300 kez G'de su ve santrifüj ile temizleyin, ardından suyu ultrafiltrasyon cihazından atın. Süpernatantı önceden yıkanmış 10 kilodalton kesme filtresine pipetleyin ve dört santigrat derecede soğutulmuş bir santrifüjde döndürün. Numunenin pH'ını kontrol edin.Sütunu bir mililitre %100 asetonitrile ile dengele, sonra %0,1 trifluoroasetik asitle %5 asetonitril mililitre ile yıkayın. Numunenin tüm hacmini sütuna yükleyin ve sütunu%0,1 trifluoroasetik asitle bir mililitre %5 asetonitril ile yıkayın. Peptitleri sütundan %1.8 mililitre %1 asetonitril ile %0.15 trifluoroasetik asit ile protein düşük bağlayıcı mikrosantrifüj tüplerine dökün.Numuneyi tamamen 30 santigrat derecede vakumlu santrifüjde kurulayın ve sergilenen konsantrasyon süresini izleyin. Numuneyi eksi 80 santigrat derecede saklayın. Peptit örneklerini 100 ila 200 mikrolitre ultra saflaştırılmış su ve pipet 2,5 mikrolitre standart peptit konsantrasyonlarında ve numunelerde beyaz 96 kuyu plakasına yeniden saklayın.25 mikrolitre 0.2 molar fosfat tamponu ve 12.5 mikrolitre floresan ekleyin. Yörüngesel rotatörde bir dakika boyunca nazikçe homojenize edin. Ardından, reaksiyoni durdurmak için 110 mikrolitre su ekleyin.Spektrofluorometredeki ayarları yapın, ardından plakayı okuyun. Peptit 25 mikrograma kadar olan her peptit örneğine bir azı dişi trimetimmonyum bromürün 1/10'uncu cildini ekleyin. pH'ın beş ila sekiz arasında olduğundan emin olun, gerekirse hidroklorik asit veya sodyum hidroksit ile ayarlayın.Döterlenmemiş, döterlenmiş formaldehit veya karbon-13 döterlenmiş formaldehit dört mikrolitre ekleyin. Girdapla beş saniye karıştırın. Peptit örneğine dört mikrolitre sodyum siyanoborohidrit veya döterlenmiş sodyum siyanoborohidrit ekleyin.Daha sonra örneği girdaplayarak beş saniye karıştırın. Peptit örneğini oda sıcaklığında iki saat boyunca duman kaputunda kuluçkaya yatırın, her 30 dakikada bir girdaplayın. Her eklemeden sonra kısırlaştırılmamış, döterlenmemiş veya karbon-13 döterlenmiş formaldehit ve sodyum siyanoborohidrit veya döterlenmiş sodyum siyanoborohidrit, girdap eklemeyi tekrarlayın.Duman kaputunda numuneleri oda sıcaklığında gece boyunca kuluçkaya yatırın. 16 mikrolitre amonyum bikarbonat ekleyin ve girdapla karıştırın. Örneği buza yerleştirin.Beş saniye daha %5 formik asit ve girdaptan oluşan sekiz mikrolitre ekleyin. Peptit örneklerini birleştirin, pH'ı iki ila dört arasında ayarlayın, ardından daha önce açıklandığı gibi asetonitril ve trifluoroasetik asit kullanarak ters faz temizleme sütunlarındaki kombine numuneleri tuzdan arındırın. Numuneyi tamamen 30 santigrat derecede vakumlu santrifüjde kurulayın, ardından eksi 20 santigrat derecede saklayın.Etiketli peptitler kütle spektra kullanılarak gözlenir. Kırmızı oklar, sırasıyla iki farklı S1 ve S2 örneği arasında karşılaştırma için L1 ve L5 olmak üzere iki izotopik formla etiketlenmiş farklı peptitlerin tepe çiftlerinin varlığını gösterir. Sırasıyla L1, L3 ve L5 etiketleriyle etiketlenmiş S1, S2 ve S3 olmak üzere üç farklı örnekte bulunan bir peptitin kütle spektrumu burada gösterilmiştir.Dört yönlü etiketleme gerçekleştirildi. S1 ve S3 kontrol örnekleri sırasıyla L1 ve L3 ile etiketlenmiş ve L2 ile etiketlenmiş S2 ve S4 olmak üzere iki deneysel örnekle karşılaştırıldığında anlamlı L4.No fark gözlenmiştir. İzotopik etiketleme, belirli bir proteaz veya peptidaz için in vitro ürünlerdeki substratları göstermek için kullanılmıştır.Nörolisin enziminin varlığında değişmeyen bir peptit burada gösterilmiştir. Enzimin varlığında kaybolan veya azaltan peptitler substratlardır, artanlar ise ürün olarak kabul edilir. Şekil, üç farklı etiket biçimiyle etiketlenmiş bir veritabanı arama motoru tarafından gerçekleştirilen bir peptit dizisini tanımlama örneğidir.Tanımlanmadan önce, sert asitleşmenin neden olduğu peptit bağlarının kırılmasını önlemek için numunenin tamamen serin olduğundan emin olun. Ek olarak, ultrafiltrasyon cihazlarının temizlenmesi esastır. kütle spektrometresi, peptitleri farklı deneysel koşullar arasında ölçmek ve peptidaz substratlarını tanımlayarak analiz çalışmaları için mükemmel bir yöntemdir.

sample-preparation-relative-quantitation-using-reductive-methylation

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Biyokimya

İndirgeyici olarak 13C-metillenmiş N-terminal lizinin α- ve ε-dimetilamin nükleer manyetik rezonans sinyallerini atamak için iki yöntem açıklanmıştır. Bir yöntem, indirgeyici metilasyon reaksiyonunun pH ile indüklenen seçiciliğini kullanır ve diğeri, N-terminal lizini seçici olarak uzaklaştırmak için aminopeptidaz kullanır.

İndirgeyici Olarak Metillenmiş Proteinler Üzerindeki 13C-Dimetil N-terminal Amin'in NMR Rezonanslarını Belirleme Yöntemleri

Indirgeyici dimetilasyonu (Redi etiketleme) tarafından peptidlerin kararlı izotop etiketleme doğru kütle spektrometresi tabanlı nicel Proteomikte için hızlı, ucuz bir stratejidir. Burada, hemen hemen her tür örnek uygulanabilir Redi yaklaşım kullanılarak protein karışımlarının hazırlanması ve analizi için güçlü bir yöntem ortaya koymaktadır.

Kararlı İzotop Etiketleme için indirgeyici dimetilasyonu kullanma Sayısal Proteomiks

Bu protokol, seçilen reaksiyon izleme kullanılarak karmaşık biyolojik numuneler içindeki hedef proteinlerin mutlak miktar tayini testlerinin nasıl gerçekleştirileceğini açıklar. Fare makrofaj kemotaksisi sinyal yolunun proteinlerini doğru bir şekilde ölçmek için kullanıldı. Hedef peptit seçimi, tahlil geliştirme ve kalitatif ve kantitatif tahliller ayrıntılı olarak açıklanmaktadır.

Mutlak Protein Niceleme Kütle Spektrometresi İzleme Seçilen Tepki

Kombine ön-madde izotopik etiketleme ve izobarik etiketleme (cPILOT) izobarik etiketlerin örnek çoğullama kabiliyetini arttıran bir sayısal proteomik stratejisidir. Bu protokol bir Alzheimer hastalığı fare modeli ve vahşi tipli kontrollerden dokulara cPILOT uygulanmasını tarif etmektedir.

Geliştirilmiş Numune Kombine Öncül İzotop Etiketleme ve Isobaric Etiketlemeyi Kullanma Dokuların çoğullama (cPILOT)

Burada uzun uzunlukta elektrostatik itme-hidrofilik interaksiyon kromatografisi-tandem kütle spektrometresi (LERLIC-MS / MS) yöntemi bir adım adım protokol mevcut. Bu av tüfeği proteomik tarafından glutamin ve asparajin deamidasyon izoformlarının ilk kez ölçümü ve karakterizasyonu için sağlayan bir roman yöntemdir.

Av tüfeği Proteomics derinlemesine Karakterizasyonu için LERLIC-MS / MS ve Glutamin ölçümü ve Asparajin deamidasyonu

Kombine öncül izotopik etiketleme ve izobarik etiketleme (cPILOT), mevcut izobarik etiketlerle eş zamanlı olarak analiz edilebilen numune sayısını artırabilen gelişmiş bir numune çoklama stratejisidir. Robotik bir platformun dahil edilmesi deneysel iş bilgililiği, tekrarlanabilirliği ve nicel doğruluğu büyük ölçüde artırmıştır.

Kombine Öncül İzotopik Etiketleme ve İzobarik Etiketleme (cPILOT) kullanılarak Otomatik Numune Çoklama

Protokol, klinik örneklerden elde edilen proteinlerin Çoklu Reaksiyon İzlemesi (MRM) için üçlü dörtlü kütle spektrometresi kullanımını sağlamayı amaçlamaktadır. Alınması gereken tüm önlemlerle klinik numuneler için numune hazırlamadan veri analizine kadar sistematik bir iş akışı sağladık.

İnsan Beyin Dokusundan Proteinlerin Çoklu Reaksiyon İzleme Tabanlı Tespiti Kullanılarak Nicel Proteomik İş Akışı

Protein Arginin ( R ) -metilasyonu, çoklu biyolojik yolları düzenleyen geniş çaplı bir translasyonel sonrası modifikasyondur. Kütle spektrometresi, modifiye peptid zenginleştirme için biyokimyasal yaklaşımlarla birleştirildiğinde, R-metil-proteomun küresel profilini çıkarmak için en iyi teknolojidir. İnsan hücrelerinde küresel R-metilasyonun yüksek güvenilirlikle tanımlanması için tasarlanan iş akışı burada açıklanmaktadır.

Global ve Yüksek Güvenilirlikli Protein R-Metilasyon Analizi için Kütle Spektrometrisine Dayalı Proteomik Yaklaşım

Bu protokol, serbest ve proteine bağlı arginin ve metil-argininlerin 1H-NMR spektroskopisi ile hazırlanmasını ve kantitatif ölçümünü açıklamaktadır.

Arginin Metilomunun Nükleer Manyetik Rezonans Spektroskopisi ile Araştırılması

Biz RNA bağlanıcı proteinler tanımlamak ve kendi RNA bağlayıcı bölgeleri UV-aracılı photocrosslinking ve kütle spektrometresi kullanılarak canlı hücrelerdeki eşlemek için bir protokol tanımlamak.

Kütle spektrometresi tabanlı kimlik RNA-bağlama bölgelerinin için numune hazırlama

Keşfedin endojen peptidlerin ısı inaktivasyonu ile korunması ve izotopik etiketleme kullanarak LC-MS ile göreli nicelleme yöntemini. Bu teknik, peptidomik çalışmalarda güvenilir ve maliyet etkin analiz sağlar.

Peptidomik Çalışmalar için Aminlerin Indirgeyici Metilasyonunu Kullanarak Numune Hazırlama ve Göreli Nicellik

Daha fazla video keşfet