Name: DNA Üzerine Birleştirilen EWS-FLI1 Kondensatlarının Tek Moleküllü Görüntülenmesi (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-09-08T15:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 5 s
Description: Keşfedin, tek moleküllü görüntüleme yöntemiyle DNA üzerinde EWS-FLI1 kondensatlarının faz ayrışmasını ve dinamiklerini. Bu teknik, Ewing sarkomu tümör hücrelerinde gen transkripsiyonunu anlamak için önemli bilgiler sunar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Bu çalışma NSFC Grants No. 31670762 (Z.Q.) tarafından desteklenmiştir.

<ol><li>Cramer, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organization+and+regulation+of+gene+transcription%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Organization and regulation of gene transcription.</a> Nature. 573 (7772), 45-54 (2019).</li>
<li>Zhang, Y., Reinberg, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcription+regulation+by+histone+methylation%3A+interplay+between+different+covalent+modifications+of+the+core+histone+tails%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+%26+Development%22%5BJournal%5D)">Transcription regulation by histone methylation: interplay between different covalent modifications of the core histone tails.</a> Genes & Development. 15 (18), 2343-2360 (2001).</li>
<li>Wang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induced+ncRNAs+allosterically+modify+RNA-binding+proteins+in+cis+to+inhibit+transcription%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Induced ncRNAs allosterically modify RNA-binding proteins in cis to inhibit transcription.</a> Nature. 454 (7200), 126-130 (2008).</li>
<li>Alexander, K. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((p53+mediates+target+gene+association+with+nuclear+speckles+for+amplified+RNA+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Cell%22%5BJournal%5D)">p53 mediates target gene association with nuclear speckles for amplified RNA expression.</a> Molecular Cell. 81 (8), 1666-1681 (2021).</li>
<li>Matsui, T., Segall, J., Weil, P. A., Roeder, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiple+factors+required+for+accurate+initiation+of+transcription+by+purified+RNA+polymerase-II%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Multiple factors required for accurate initiation of transcription by purified RNA polymerase-II.</a> Journal of Biological Chemistry. 255 (24), 1992-1996 (1980).</li>
<li>Stadhouders, R., Filion, G. J., Graf, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcription+factors+and+3D+genome+conformation+in+cell-fate+decisions%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Transcription factors and 3D genome conformation in cell-fate decisions.</a> Nature. 569 (7756), 345-354 (2019).</li>
<li>Peng, Y., Zhang, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enhancer+and+super-enhancer%3A+Positive+regulators+in+gene+transcription%5BTitle%5D)+AND+%22Animal+Models+and+Experimental+Medicine%22%5BJournal%5D)">Enhancer and super-enhancer: Positive regulators in gene transcription.</a> Animal Models and Experimental Medicine. 1 (3), 169-179 (2018).</li>
<li>Lambert, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+human+transcription+factors%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">The human transcription factors.</a> Cell. 172 (4), 650-665 (2018).</li>
<li>Normanno, D., Dahan, M., Darzacq, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intra-nuclear+mobility+and+target+search+mechanisms+of+transcription+factors%3A+a+single-molecule+perspective+on+gene+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Biochimica+et+Biophysica+Acta%22%5BJournal%5D)">Intra-nuclear mobility and target search mechanisms of transcription factors: a single-molecule perspective on gene expression.</a> Biochimica et Biophysica Acta. 1819 (6), 482-493 (2012).</li>
<li>Berg, O. G., Winter, R. B., von Hippel, P. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diffusion-driven+mechanisms+of+protein+translocation+on+nucleic+acids%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Diffusion-driven mechanisms of protein translocation on nucleic acids.</a> Biochemistry. 20 (24), 6929-6948 (1981).</li>
<li>Loverdo, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantifying+hopping+and+jumping+in+facilitated+diffusion+of+DNA-binding+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Physical+Review+Letters%22%5BJournal%5D)">Quantifying hopping and jumping in facilitated diffusion of DNA-binding proteins.</a> Physical Review Letters. 102 (18), 188101(2009).</li>
<li>Boija, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcription+factors+activate+genes+through+the+phase-separation+capacity+of+their+activation+domains%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Transcription factors activate genes through the phase-separation capacity of their activation domains.</a> Cell. 175 (7), 1842-1855 (2018).</li>
<li>Sabari, B. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Coactivator+condensation+at+super-enhancers+links+phase+separation+and+gene+control%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Coactivator condensation at super-enhancers links phase separation and gene control.</a> Science. 361 (6400), (2018).</li>
<li>Kim, S., Shendure, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanisms+of+interplay+between+transcription+factors+and+the+3D+genome%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Cell%22%5BJournal%5D)">Mechanisms of interplay between transcription factors and the 3D genome.</a> Molecular Cell. 76 (2), 306-319 (2019).</li>
<li>Shrinivas, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enhancer+features+that+drive+formation+of+transcriptional+condensates%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Cell%22%5BJournal%5D)">Enhancer features that drive formation of transcriptional condensates.</a> Molecular Cell. 75 (3), 549-561 (2019).</li>
<li>Banani, S. F., Lee, H. O., Hyman, A. A., Rosen, M. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biomolecular+condensates%3A+organizers+of+cellular+biochemistry%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews.+Molecular+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Biomolecular condensates: organizers of cellular biochemistry.</a> Nature Reviews. Molecular Cell Biology. 18 (5), 285-298 (2017).</li>
<li>Zhou, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanism+of+DNA-induced+phase+separation+for+transcriptional+repressor+VRN1%5BTitle%5D)+AND+%22Angewandte+Chemie+International+Edition%22%5BJournal%5D)">Mechanism of DNA-induced phase separation for transcriptional repressor VRN1.</a> Angewandte Chemie International Edition. 58 (15), 4858-4862 (2019).</li>
<li>Rao, S., Ahmad, K., Ramachandran, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cooperative+binding+between+distant+transcription+factors+is+a+hallmark+of+active+enhancers%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Cell%22%5BJournal%5D)">Cooperative binding between distant transcription factors is a hallmark of active enhancers.</a> Molecular Cell. 81 (8), 1651-1665 (2021).</li>
<li>Qi, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+sequence+alignment+by+microhomology+sampling+during+homologous+recombination%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">DNA sequence alignment by microhomology sampling during homologous recombination.</a> Cell. 160 (5), 856-869 (2015).</li>
<li>Qi, Z., Greene, E. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualizing+recombination+intermediates+with+single-stranded+DNA+curtains%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Visualizing recombination intermediates with single-stranded DNA curtains.</a> Methods. 105, 62-74 (2016).</li>
<li>Ma, C. J., Gibb, B., Kwon, Y., Sung, P., Greene, E. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+dynamics+of+human+RPA+and+RAD51+on+ssDNA+during+assembly+and+disassembly+of+the+RAD51+filament%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">Protein dynamics of human RPA and RAD51 on ssDNA during assembly and disassembly of the RAD51 filament.</a> Nucleic Acids Research. 45 (2), 749-761 (2017).</li>
<li>Sternberg, S. H., Redding, S., Jinek, M., Greene, E. C., Doudna, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+interrogation+by+the+CRISPR+RNA-guided+endonuclease+Cas9%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">DNA interrogation by the CRISPR RNA-guided endonuclease Cas9.</a> Nature. 507 (7490), 62-67 (2014).</li>
<li>Larson, A. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Liquid+droplet+formation+by+HP1+alpha+suggests+a+role+for+phase+separation+in+heterochromatin%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Liquid droplet formation by HP1 alpha suggests a role for phase separation in heterochromatin.</a> Nature. 547, 236-240 (2017).</li>
<li>Zuo, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Loci-specific+phase+separation+of+FET+fusion+oncoproteins+promotes+gene+transcription%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Loci-specific phase separation of FET fusion oncoproteins promotes gene transcription.</a> Nature Communications. 12 (1), 1491(2021).</li>
<li>Collins, B. E., Ye, L. F., Duzdevich, D., Greene, E. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+curtains%3A+novel+tools+for+imaging+protein-nucleic+acid+interactions+at+the+single-molecule+level%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">DNA curtains: novel tools for imaging protein-nucleic acid interactions at the single-molecule level.</a> Methods in Cell Biology. 123, 217-234 (2014).</li>
<li>Greene, E. C., Wind, S., Fazio, T., Gorman, J., Visnapuu, M. -L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+curtains+for+high-throughput+single-molecule+optical+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Enzymology%22%5BJournal%5D)">DNA curtains for high-throughput single-molecule optical imaging.</a> Methods in Enzymology. 472, 293-315 (2010).</li>
<li>Gangwal, K., Close, D., Enriquez, C. A., Hill, C. P., Lessnick, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Emergent+properties+of+EWS%2FFLI+regulation+via+GGAA+microsatellites+in+Ewing%27s+sarcoma%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+%26+Cancer%22%5BJournal%5D)">Emergent properties of EWS/FLI regulation via GGAA microsatellites in Ewing's sarcoma.</a> Genes & Cancer. 1 (2), 177-187 (2010).</li>
<li>Sizemore, G. M., Pitarresi, J. R., Balakrishnan, S., Ostrowski, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+ETS+family+of+oncogenic+transcription+factors+in+solid+tumours%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews.+Cancer%22%5BJournal%5D)">The ETS family of oncogenic transcription factors in solid tumours.</a> Nature Reviews. Cancer. 17 (6), 337-351 (2017).</li>
<li>Roy, R., Hohng, S., Ha, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+practical+guide+to+single-molecule+FRET%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">A practical guide to single-molecule FRET.</a> Nature Methods. 5 (6), 507-516 (2008).</li>
<li>Huang, B., Bates, M., Zhuang, X. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Super-resolution+fluorescence+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Super-resolution fluorescence microscopy.</a> Annual Review of Biochemistry. 78, 993-1016 (2009).</li>
<li>Bustamante, C., Bryant, Z., Smith, S. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ten+years+of+tension%3A+single-molecule+DNA+mechanics%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Ten years of tension: single-molecule DNA mechanics.</a> Nature. 421 (6921), 423-427 (2003).</li>
<li>Bustamante, C., Chemla, Y. R., Moffitt, J. R. High-resolution dual-trap optical tweezers with differential detection. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aBustamante%2C+C+%22Single-Molecule+Techniques%3A+A+Laboratory+Manual%22">Single-Molecule Techniques: A Laboratory Manual</a>. Selvin, P. R., Ha, T. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. (2008).</li>
<li>Zhao, Y. L., Jiang, Y. Z., Qi, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualizing+biological+reaction+intermediates+with+DNA+curtains%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Physics+D%3A+Applied+Physics%22%5BJournal%5D)">Visualizing biological reaction intermediates with DNA curtains.</a> Journal of Physics D: Applied Physics. 50 (15), 153001(2017).</li>
</ol>

Yazarların çıkar çatışması yoktur.

Tek moleküllü yaklaşımlar reaksiyon sisteminin içeriğine karşı son derece hassas olduğundan, DNA Perdeleri deneyleri sırasında, özellikle bölüm 1 ve 2'de hazırlanan lipitler ve bölüm 5'te kullanılan tamponlar olmak üzere tüm malzemelerin ve çözeltilerin iyi kalitede olmasını sağlamak için ekstra çaba harcanmalıdır. Tamponları hazırlamak için daha yüksek saflıkta reaktifler kullanılmalı ve tamponlar tek moleküllü tahlil için taze hazırlanmalıdır.
500 nM mCherry etiketli EWS-FLI1 odaya yıkandığı...

Transkripsiyonel düzenleme, canlı hücrelerde kesin gen ekspresyonu için çok önemli bir adımdır. Kromozomal modifikasyon, transkripsiyon faktörleri (TF'ler) ve kodlamayan RNA'lar gibi birçok faktör bu karmaşık sürece katılır 1,2,3. Bu faktörler arasında, TF'ler, promotörler veya arttırıcılar olarak bilinen spesifik DNA dizilerini tanıyarak ve bağlayarak ve daha sonra transkripsiyonuaktive etmek veya bastırmak için diğer fonksiyonel proteinleri işe alarak transkripsiyonel düzenlemenin özgüllüğüne katkıda bulunur 4,5,6,7. Bu TF'lerin insan genomundaki hedef bölgelerini aramayı ve histon olmayan DNA bağlayıcı proteinlerle kaplı DNA ile etkileşime girmeyi nasıl başardıkları, bilim adamlarını on yıllardır şaşırttı. Son birkaç yılda, TF'lerin hedef arama mekanizması için birkaç klasik model, DNA zinciri 8,9,10,11 boyunca nasıl "kaydıklarını", "zıpladıklarını", "zıpladıklarını" veya "bölümler arası transferi" tanımlamak için inşa edilmiştir. Bu modeller, tek bir TF molekülünün DNA'sı üzerindeki arama davranışına odaklanmıştır. Bununla birlikte, son zamanlarda yapılan çalışmalar, bazı TF'lerin çekirdekte tek başına veya Mediator kompleksi12 ile sıvı-sıvı faz ayrımına (LLPS) maruz kaldığını göstermektedir. TF'lerin gözlemlenen damlacıkları, promotör veya arttırıcı bölgelerle ilişkilidir ve biyomoleküler kondens oluşumunun transkripsiyondaki rolünü ve üç boyutlu genom 13,14,15'i vurgulamaktadır. Bu biyomoleküler kondensatlar, in vivo ve in vitro membran eksikliği olan bölmelerle bağlantılıdır. Modüler biyomakromoleküllerin ve proteinlerin içsel olarak düzensiz bölgelerinin (IDR'ler) çok değerli etkileşimlerin iki ana itici gücü olduğu LLPS aracılığıyla oluşturulurlar16. Böylece, TF'ler sadece DNA'yı aramakla kalmaz, aynı zamanda bu yoğuşmalar 4,17,18 içinde sinerjik olarak işlev görür. Bugüne kadar, bu transkripsiyon kondensatlarının DNA üzerindeki biyofiziksel özelliği belirsizliğini korumaktadır.
Bu nedenle, bu çalışma, TF'lerin DNA üzerinde oluşturduğu transkripsiyon kondensatlarının oluşumunu ve dinamiklerini in vitro olarak doğrudan görüntülemek için tek moleküllü bir yöntem olan DNA Perdeleri'ni uygulamayı amaçlamıştır. Proteinler ve DNA arasındaki etkileşimi incelemek için yüksek verimli bir in vitro görüntüleme platformu olan DNA Perdeleri, DNA onarımı19,20,21, hedef arama 22 ve LLPS 17,23,24'te uygulanmıştır. DNA Perdelerinin akış hücresi, yüzeyi pasifleştirmek ve biyomoleküllerin yüzeyde dağılmasına izin vermek için biyotinile lipit çift katmanları ile kaplanmıştır. Nanofabrikasyon zikzak desenleri DNA'nın hareketini sınırlar. Biyotinile Lambda DNA substratları bariyer kenarları boyunca hizalanabilir ve yönlendirilmiş tampon akışı tarafından gerilebilir. Tüm moleküllerin aynı başlangıç ve bitiş dizileri, proteinin DNA üzerinde izlenmesine izin verir ve bağlanma olaylarının konum dağılımını tanımlar25,26. Dahası, DNA Perdelerinin toplam iç yansıma floresan mikroskobu (TIRFM) ile kombinasyonu, arka plan gürültüsünü en aza indirmeye ve sinyalleri tek molekül düzeyinde algılamaya yardımcı olur. Bu nedenle, DNA Perdeleri, DNA motifleri üzerindeki transkripsiyon kondens oluşumunun dinamiklerini araştırmak için umut verici bir yöntem olabilir. Bu yazıda, kromozomal translokasyon tarafından üretilen bir FUS/EWS/TAF15 (FET) ailesi füzyon onkoproteini olan EWS-FLI1 örneği açıklanmaktadır. 25× GGAA içeren Lambda DNA'sı - EWS-FLI127'nin bağlanma dizisi - EWS-FLI1 moleküllerinin DNA üzerinde LLPS'ye nasıl maruz kaldığını gözlemlemek için DNA Perdeleri deneylerinde DNA substratı olarak kullanıldı. Bu yazıda deneysel protokol ve veri analiz yöntemleri ayrıntılı olarak ele alınmaktadır.

<table><tbody><tr><td>488 nm diyot pompalı katı hal lazer</td><td>Tutarlı</td><td>OBIS488LS</td><td></td></tr><tr><td>561 nm diyot pompalı katı hal lazer</td><td>Tutarlı</td><td>OBIS561LS</td><td></td></tr><tr><td>Agar</td><td>Rhawn</td><td>R003215-50g</td><td></td></tr><tr><td>biyotinile DOPE</td><td>Avanti</td><td>870273P</td><td></td></tr><tr><td>Sığır Serumu Albümin</td><td>Sigma</td><td>A7030</td><td></td></tr><tr><td>Kloroform</td><td>Amresco</td><td>1595C027</td><td></td></tr><tr><td>Kaplama Electra 92</td><td>Allresist GmbH</td><td>AR-PC 5090.02</td><td>İletken koruyucu kaplama</td></tr><tr><td>Deoksiribonükleaz I sığır</td><td>Sigma</td><td>D5139-2MG</td><td></td></tr><tr><td>DOPC</td><td>Avanti</td><td>850375P</td><td></td></tr><tr><td>DTT</td><td>Sigma</td><td>D9779</td><td></td></tr><tr><td>Cam lamel</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-544-7</td><td></td></tr><tr><td>Hellmanex III</td><td>Sigma</td><td>Z805939-1EA</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Sigma</td><td>60130</td><td></td></tr><tr><td>Lambda DNA</td><td>NEB</td><td>N3013S</td><td></td></tr><tr><td>Lambda Ambalaj Ekstraktları</td><td>Epicentre</td><td>MP5120</td><td></td></tr><tr><td>MgCl2</td><td>Sigma</td><td>M2670</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma</td><td>s3014</td><td></td></tr><tr><td>Nanoport</td><td>Idex</td><td>N-333-01</td><td></td></tr><tr><td>NheI-HF</td><td>NEB</td><td>R3131S</td><td></td></tr><tr><td>Nikon Ters Mikroskop</td><td>Nikon</td><td>Eclipse Ti</td><td></td></tr><tr><td>NZCYM Et Suyu</td><td>Sigma</td><td>N3643-250G</td><td></td></tr><tr><td>PEG-2000 DOPE</td><td>Avanti</td><td>880130P-1G</td><td></td></tr><tr><td>PEG-8000</td><td>Amresco</td><td>25322-68-3</td><td></td></tr><tr><td>PMMA 200K, ETİL LAKTAT %4</td> <td>Allresist GmbH</td><td>AR-P 649.04</td><td></td></tr><tr><td>PMMA 950K, ANİSOL 2%</td><td>Allresist GmbH</td><td>AR-P 672.02</td><td></td></tr><tr><td>Prime 95B Bilimsel CMOS kamera</td><td>FOTOMETRİ</td><td>Prime95B</td><td></td></tr><tr><td>proteinaz K</td><td>NEB</td><td>P8107S</td><td></td></tr><tr><td>Silika cam slayt</td><td>G.Finkenbeiner</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Altı enjeksiyon vanası</td><td>Idex</td><td>MXP9900-000</td><td></td></tr><tr><td>Streptavidin</td><td>Thermo</td><td>S888</td><td>ddH 2 O ile seyreltilmiş</td></tr><tr><td>Şırınga pompası</td><td>Harvard Aparat</td><td>Pompası11 Elit</td><td></td></tr><tr><td>T4 DNA Ligaz</td><td>NEB</td><td>M0202S</td><td></td></tr><tr><td>Tris tabanı</td><td>Sigma</td><td>T6066</td><td></td></tr><tr><td>XhoI</td><td>NEB</td><td>R0146V</td><td></td></tr><tr><td>YOYO-1 İyodür (491/509)</td> <td>İnvitrojen</td><td>Y3601</td><td>DMSO ile Seyreltilmiş</td></tr></tbody></table>

dna Üzerine birleştirilen ews-fli1 kondensatlarının tek moleküllü görüntülenmesi

Single-Molecule Imaging of EWS-FLI1 Condensates Assembling on DNA

Kromozomal translokasyondan kaynaklanan füzyon genleri birçok solid tümörde veya lösemide bulunmuştur. Füzyon onkoproteinlerinin FUS/EWS/TAF15 (FET) ailesine ait olan EWS-FLI1, Ewing sarkomunda en sık tutulan füzyon genlerinden biridir. Bu FET ailesi füzyon proteinleri tipik olarak N-terminuslarında düşük karmaşıklıklı bir FET proteini alanı (LCD) ve C-terminuslarında bir DNA bağlayıcı alan (DBD) barındırır. EWS-FLI1'in LCD-LCD ve LCD-DBD etkileşimleri nedeniyle hedef bağlanma lokuslarında biyomoleküler kondensatlar oluşturduğu doğrulanmıştır ve bu yoğuşmalar gen transkripsiyonunu arttırmak için RNA polimeraz II'yi işe alabilir. Bununla birlikte, bu yoğuşmaların bağlanma bölgelerinde nasıl monte edildiği belirsizliğini korumaktadır. Son zamanlarda, EWS-FLI1 yoğuşmalarının bu montaj süreçlerini görselleştirmek için tek moleküllü bir biyofizik yöntemi olan DNA Perdeleri uygulandı. Burada, DNA Perdelerinin hedef DNA üzerine monte edilen biyomoleküler kondensatların incelenmesinde uygulanması için ayrıntılı deneysel protokol ve veri analizi yaklaşımları tartışılmaktadır.

DNA Perdelerinin şeması Şekil 1A, Şekil 1B ve Şekil 1D'de gösterilmiştir. GGAA'nın 25 kesintisiz tekrarını içeren klonlanmış hedef dizisi, Ewing sarkomundaki NORB1 promotöründe bulunur. Bu hedef dizisi EWS-FLI1 işe alım28 için çok önemlidir. EWS-FLI1 molekülleri, 561 nm lazer ile elde edilen mCherry etiketli EWS-FLI1 sinyalleri tespit edilerek görselleştirildi (Şekil 1C ve Şekil ...

Burada, DNA üzerinde birleşen EWS-FLI1 kondensatlarının biyofiziksel mekanizmasını incelemek için tek moleküllü görüntüleme yöntemi olan DNA Perdeleri'nin kullanımını açıklıyoruz.

DNA Üzerine Birleştirilen EWS-FLI1 Kondensatlarının Tek Moleküllü Görüntülenmesi

The fusion genes resulting from chromosomal translocation have been found in many solid tumors or leukemia. EWS-FLI1, which belongs to the FUS/EWS/TAF15 ...

DNA üzerindeki transkripsiyon faktörlerinin faz ayrımını gözlemlemek için tek bir molekül testi sağlıyoruz Bu teknik, DNA üzerinde sıvı damlacık olarak toplanan transkripsiyon faktörlerinin dinamik sürecinin gerçek zamanlı olarak gerçekleştirilmesini sağlar. EWS-FL1, Ewing sarkomu tümörigenezinde en sık tutulan füzyon genlerinden biridir. Araştırmamız, DNA motif numarası ile tümör hücrelerinde çorak bir gen transkripsiyonu ile ilişkili olan ve belki de prognoz için yararlı olan EWS-FL1 kondens oluşumu arasındaki ilişkiyi tanımlayabilir.Bu yöntem, P53 ve MED1 gibi in vitro herhangi bir transkripsiyon kondensatını veya kompleksini incelemek için uygulanabilir. Bir DNA perdesi deneyi için zikzak nano fabrikasyon bariyerlere sahip bir akış hücresi hazırlamak için, giriş ve çıkış tüplerini doğru yönde bağlayın. Daha sonra akış hücresini, iki adet üç mililitrelik şırınga kullanarak 2,5 mililitre lipit tamponu ile yıkayın, böylece akış hücresinde kabarcık olmadığından emin olun.Şırıngayı çıktıdan çıkarın ve her enjeksiyon arasında beş dakikalık bir inkübasyonla üç kez bir mililitre lipozom çözeltisi enjekte edin. İyileşme için, akış hücresini 2,5 mililitre lipit tamponu ile yavaşça yeniden yıkayın ve oda sıcaklığında 30 dakika inkübe edin. Kuluçka sırasında, BSA tamponunu metin yazısında belirtildiği gibi hazırlayın.Daha sonra 30 dakikalık iyileşmeden sonra, akış hücresini çıkış tarafından 2,5 mililitre BSA tamponu ile yıkayın. Daha sonra, giriş tarafından akış hücresine 800 mikrolitre streptavidin tamponunu, her adımdan sonra 10 dakikalık bir inkübasyonla iki adımda enjekte edin. Daha sonra tüm serbest streptavidin moleküllerini çıkarmak için akış hücresini 2,5 mililitre BSA tamponu ile yıkayın.Daha sonra, BSA tamponu kullanarak biyotin Lambda DNA'sını klonlanmış motiflerle seyreltin ve beş dakikalık aralıklarla dört kez yavaşça enjekte edin. Enjeksiyon sırasında, bilimsel ücretsiz metal oksit yarı iletken sistemindeki mikroskobu açın. Daha sonra boruyu 10 mililitre çift damıtılmış suyla yıkayın ve prizmayı ve boru konektörünü su,% 2 sıvı küvet temizleyici ve% 99 etanol ile durulayın.Daha sonra, görüntüleme tamponunun en az 20 mililitresini 30 mililitrelik bir şırıngaya çekin. Akış hücresini mikroskop aşamasına yerleştirin ve mikroakışkan sisteme bağlayın. Dakikada 0.03 mililitrelik bir akış hızı kullanarak, DNA moleküllerini 10 dakika boyunca bariyere yıkayın.Ardından mikroakışkan sistemi kapatın ve 30 dakika boyunca inkübe edin. akış durdu ve DNA'nın yanal olarak yayılmasına izin verdi. DNA perdeleri üzerindeki EWS-FLI1 yoğuşma oluşumunu görüntülemek için, görüntüleme yazılımını açın ve parlak alan altındaki dokuz zikzak deseninin konumlarını bulun ve işaretleyin.Ardından, DNA'yı 10 dakika boyunca çift sarmallı DNA boyasıyla boyamak için akışı dakikada 0.2 mililitrede açın. Daha sonra, mCherry EWS-FLI1 proteinini görüntüleme tamponu ile 100 mikrolitrede 100 nanomol konsantrasyonunda seyreltin. Daha sonra protein numunesini valften 100 mikrolitrelik bir cam şırıngayla yükleyin ve akış hızını dakikada 0,4 mililitre olarak değiştirin.488 nanometre lazeri açtıktan sonra, DNA dağılım durumunu kontrol etmek ve DNA moleküllerinin eşit olarak dağıldığı bölgeyi seçmek için her bölgeyi önceden tarayın. Ardından lazer gücünü 488 nanometre lazer için %10 ve 561 nanometre lazer için %20 olarak ayarlayın. Güç ölçeri kullanarak, prizmanın yakınındaki gerçek lazer gücünü ölçün.Aynı anda hem 488 hem de 561 nanometre lazerlerle iki saniyelik aralıklarla görüntü almaya başlayın. Ardından, görüntüleme tamponunun protein numunesini 60 saniye sonra akış hücresine yıkamasına izin vermek için valfi manuel moddan enjeksiyon moduna değiştirin. Serbest EWS-FLI1'i çıkarmak için, akış hücresini görüntüleme tamponuyla yalnızca 561 nanometre lazer açıkken beş dakika boyunca yıkamaya devam edin.Sonra akışı durdurun ve 10 dakika boyunca 37 santigrat derecede inkübe edin. 10 dakika sonra, DNA'nın genişlemesine izin vermek için akışı dakikada 0,4 mililitrede açın ve EWS-FLI1 kondens oluşumunun yüksek verimli verilerini elde etmek için farklı çerçeveler arasında iki saniyelik aralıklarla görüntüler elde edin. EWS-FLI1 molekülleri, 561 nanometre lazerle elde edilen mCherry etiketli EWS-FLI1 sinyallerini tespit ederek görselleştirildi.DNA substratındaki 25 GGAA tekrarının bulunduğu yerde EWS-FLI1 kondensatının in vitro oluşumu doğrudan görselleştirilebilir. DNA perdelerinde kullanılan mCherry EWS-FLI1'in özgüllüğü, 25 GGAA tekrarı olan ve olmayan bir DNA şablonu kullanılarak elektroforetik hareketlilik kayma testi ile doğrulandı. EWS-FLI1 konsantrasyonu 20 ila 500 nanomol arasında titre edildiğinde, EWS-FLI1 yoğunluğu çarpıcı bir şekilde artmıştır.FLI bir DBD yoğunluğundaki değişim, proteinler GGAA tekrarlarını kapsayacak şekilde doyurulduğunda ihmal edilebilirken, EWS-FLI1'in DNA üzerinde yoğuşmalar oluşturduğunu düşündürmektedir. Enjeksiyon çok yavaş ve yumuşak olmalıdır, böylece lipozom ve DNA akış hücresine eşit olarak dağılabilir. Saflaştırılmış bir transkripsiyon faktörünün özellikle in vitro hedef sekansla bağlandığını doğrulamak için MSA yapmak önemlidir.Bu teknik, insanların kondensatın transkripsiyon faktörlerinin hedef aramasını kolaylaştırıp kolaylaştırmayacağını ve transkripsiyon üzerindeki etkisini keşfetmelerini sağlar.

single-molecule-imaging-of-ews-fli1-condensates-assembling-on-dna

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Biyokimya

Biz gelecekteki nükleik asit temelli tedaviler için daha iyi kontrol ve sentez üniforma ve özelleştirilebilir polyplexes sağlaması bekleniyor polielektrolit polyplexes oluşumunu araştırmak için yeni ve güçlü bir entegrasyon sahipliği yapacaktır (QD-FRET) ve Mikroakiskan sunuyoruz.

Birleştiren QD FRET Mikroakiskan Real-Time DNA Nanocomplex Self-Meclis Monitör

Bu videoda, tek moleküllü görüntüleme kullanarak belirli lokuslarda DNA molekülleri üzerinde füzyon proteini yoğunlaşmalarının montajını görselleştirmek için bir yöntem açıklanmaktadır. Bu kondensatlar, RNA polimeraz II'nin işe alınmasına ve gelişmiş gen transkripsiyonuna izin veren LCD-LCD ve LCD-DBD etkileşimleri nedeniyle oluşur.

DNA perdeleri üzerinde füzyon proteini kondensatlarının montajını görselleştirmek için tek moleküllü görüntüleme

Burada iki optik kapalı kalmış mikro-arasında asılı tek bir DNA molekülü ile etkileşim tek floresan etiketli protein molekülü tespit etmek için cihazları ve yöntemleri tarif etmektedir.

Protein-DNA Etkileşiminin Çalışmaları Tek molekül Manipülasyon ve Görüntüleme birleştiren

Bu çalışma, tek bir molekül flüoresan rezonans enerji transferi (FRET) kullanılarak çift sarmallı DNA ilmek dinamiklerini ölçmek için bir ayrıntılı deneysel prosedür sunmaktadır. Protokol ayrıca J faktörü denilen döngü olasılık yoğunluğunu ayıklamak için nasıl açıklar.

Tek Molekül FRET DNA döngü oluşturma incelenmesi

Elektron spektroskopik görüntüleme, nükleik asidi proteinden nanometre çözünürlükte görüntüleyebilir ve ayırt edebilir. Transmisyon elektron mikroskobu örneklerinde etiketli proteinleri özel olarak etiketleyebilen miniSOG sistemi ile birleştirilebilir. Örnek olarak çift iplikli kopma onarım odaklarını kullanarak bu teknolojilerin kullanımını gösteriyoruz.

Elektron Spektroskopik Görüntüleme Kombinasyonunun miniSOG Etiketli DNA Onarım Proteinler Görselleştirme (ESI)

Bu protokol, hızlı hücre yuvarlaması yapışması sırasında yapışma olaylarını görüntüleyene kadar yapışma ayak izi testini gerçekleştirmek için deneysel prosedürleri sunar.

Yapışma Ayak İzi Tahlili ile Hücre Yuvarlanmasında Görüntüleme Moleküler Yapışması

Mikroakışkan odalar aracılığıyla incelenen görsel, tek moleküllü biyokimya, cam varil, gaz geçirmez şırıngalar, boruların akış hücrelerine kararlı bağlantıları ve şırıngalar ve borular arasına anahtarlama valfleri yerleştirilerek kabarcıkların ortadan kaldırılması kullanılarak büyük ölçüde kolaylaştırılmıştır. Protokol, DNA işlemlerinin ve moleküller arası etkileşimlerin görselleştirilmesini sağlayan çift optik tuzakları tanımlar.

Tek Moleküllü Çalışmalarda Çift Optik Cımbız ve Mikroakışkan Kullanımı

Bir plazma membran reseptörü kinazının membran kaçakçılığı olaylarını incelemek için burada yaygın olarak kullanılan birkaç yöntem tanıtılmaktadır. Bu yazıda bitki materyali hazırlama, farmakolojik tedavi ve konfokal görüntüleme kurulumu dahil olmak üzere ayrıntılı protokoller açıklanmaktadır.

Stoma Soy Hücrelerinde Membran Kaçakçılığı Olaylarını İncelemek için Görüntü Tabanlı Yöntemler

Doğası gereği düzensiz birçok proteinin, çok sayıda hücresel süreç için önemli bir davranış olan oldukça dinamik biyomoleküler kondensatların oluşumuna katıldığı gösterilmiştir. Burada, canlı hücrelerdeki biyomoleküler kondensatlarda proteinlerin birbirleriyle etkileşime girdiği dinamikleri ölçmek için tek moleküllü görüntüleme tabanlı bir yöntem sunuyoruz.

Biyomoleküler Kondensatlarda Protein Etkileşim Dinamiğinin Tek Moleküllü Ölçümü

Bu makale, tek moleküllü korelasyon kuvveti ve floresan mikroskobu için nükleozom içeren DNA bağlarının yeniden yapılandırılması için ayrıntılı bir deneysel prosedür sunmaktadır. Ayrıca, kromatin ile etkileşime giren proteinlerin bağlanma davranışını görselleştirmek ve nükleozomların fiziksel özelliklerindeki değişiklikleri analiz etmek için yapılabilecek birkaç aşağı akış deneyini açıklar.

Tek moleküllü korelasyon kuvveti ve floresan mikroskobu için yerinde nükleozom düzeneği

Bu protokol, CMG sarmal ile çözülen DNA'nın canlı görselleştirilmesi için tek moleküllü bir testin gerçekleştirilmesini gösterir. (1) bir DNA substratının hazırlanmasını, (2) floresan etiketli Drosophila melanogaster CMG helikazının saflaştırılmasını, (3) toplam iç yansıma floresan (TIRF) mikroskobu için bir mikroakışkan akış hücresinin hazırlanmasını ve (4) tek moleküllü DNA çözme tahlilini açıklar.

CMG Helikaz ile DNA Çözmenin Tek Moleküllü Gerçek Zamanlı Görselleştirilmesi

Keşfedin, tek moleküllü görüntüleme yöntemiyle DNA üzerinde EWS-FLI1 kondensatlarının faz ayrışmasını ve dinamiklerini. Bu teknik, Ewing sarkomu tümör hücrelerinde gen transkripsiyonunu anlamak için önemli bilgiler sunar.

DNA Üzerine Birleştirilen EWS-FLI1 Kondensatlarının Tek Moleküllü Görüntülenmesi

Daha fazla video keşfet