Name: Y-27632 Kullanarak Birincil İnsan Dişeti Epitel Hücrelerinin İzolasyonu ve Kültürü (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-11-06T13:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 47 s
Description: Öğrenin, Y-27632 kullanarak birincil insan dişeti epitel hücrelerinin izolasyonu ve kültürü için geliştirilmiş hücre kültürü yöntemini. Bu teknik kök hücre özelliklerini artırır ve rejeneratif tıpta uygulama sağlar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Bu çalışma, Shandong Eyaleti Doğa Bilimleri Vakfı (ZR2019ZD36) Anahtar Programı ve Shandong Eyaleti Anahtar Araştırma ve Geliştirme Programı (2019GSF108107) tarafından X.W.'ye desteklenmiştir; Shandong Eyaleti Temel Araştırma ve Geliştirme Programı (2018GSF118240) J.G.'ye; Shandong Eyaleti Tıbbi ve Sağlık Bilim ve Teknoloji Geliştirme Projesi (2018WS163) Z.X.'ye ve Shandong Eyaleti Tıbbi ve Sağlık Bilim ve Teknoloji Geliştirme Projesi (2019WS045) J.S.

Bu protokolde kullanılan insan dokuları, Kurumun İnsan Araştırmaları Etik Kurulu yönergelerine göre Maksillofasiyal Cerrahi Anabilim Dalı'nda etkilenen dişlerin ekstraksiyonlarından atılan taze erişkin diş eti dokularıdır (Protokol No. GR201711, Tarih: 02-27-2017).
1. Hazırlıklar
<ol><li>%3 penisilin/streptomisidin (P/S) ile desteklenmiş 10 mL fosfat tamponlu salin (PBS) içeren 15 mL tüplerde taze yetişkin dişeti dokularını toplayın ve dokuları 4 °C'de tutun. NOT: Dokuları eksizyondan sonra 24 saat içinde aşağıda ayrıntılı olarak belirtildiği gibi tedavi edin.</li>
</ol>2. Reaktifleri ve kültür ortamını hazırlayın
<ol><li>Yıkama solüsyonunun hazırlayın: %3 P/S. 50 mL PBS'yi 1,5 mL penisilin (100 U/mL) ve 1,5 mL streptomisilin (100 mg/L) ile karıştırın.</li>
	<li>500 mL büyüme faktörü içeren ortam hazırlayın (G-medium olarak adlandırılır): %1 P/S içeren DMEM/F12 (3:1) ortamı, %2 B27 takviyesi, 20 ng/mL epidermal büyüme faktörü (EGF), 40 ng/mL fibroblast büyüme faktörü 2 (FGF2) ve 40 μg/mL mantar zonklama.</li>
	<li>Yeni yöntem için enzim sindirim çözeltileri hazırlayın: 50 mL DMEM'de 125 mg Dispase tozu ve 125 mg Tip I kollajenaz tozunu çözün. NOT: Tüm enzim çözeltilerini 0,22 μm süzgeçten filtreleyin ve 4 °C'de saklayın.</li>
	<li>Enzimamatik sindirimi nötralize etmek için ortamın 500 mL'sini hazırlayın: DMEM ortamında% 10 fetal sığır serumu (FBS) ve% 1 P / S.</li>
</ol>3. Doğrudan explant yöntemi
<ol><li>Dişeti dokusu önksezisi<ol>
<li>Dişeti dokusunu 30 s için 5 mL% 75 etanol ile yıkayın. Ardından, 5 mL yıkama çözeltisi (adım 2.1) ile iki kez 5 dakika durulayın. NOT: Tüm yıkamaları 50 mm çapındaki hücre kültürü yemeklerinde gerçekleştirin.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Diş eti epitel hücre kültürü<ol>
<li>Diş eti dokusunu 1 mm3 parçaya bölün ve 100 mm hücre kültürü kabına saçın. Kesme işlemleri için ince sivri forseps ve oftalmik makas kullanın.</li>
		<li>G-medium'u (adım 2.2) kültür yemeğine ekleyin. Ardından, kültür çanasını 37 °C'de% 5 CO2 inkübatörde kuluçkaya yatırın. Her 24 saatte bir dokuları incelemek için ters bir mikroskop (40x) kullanın.</li>
		<li>Epitel hücreleri doku parçalarının etrafında 2-5 mm çapında yayıldığında diş eti doku parçalarını çıkarın. G-medium'u her 2-4 günde bir değiştirin.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. Yeni modifiye enzymatic yöntem
<ol><li>Dişeti dokusu önksezisi<ol>
<li>Bunun için, doğrudan explant yöntemi olan 3.1.1 adımı için açıklanan adımları izleyin.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Diş eti dokusunun sindirimi<ol>
<li>Diş eti dokusunu iki sterilize bıçak ile yaklaşık <1 mm büyüklüğünde küçük parçalar halinde kesin. İki cerrahi bıçakla parçalama işlemini tekrarlayın.</li>
		<li>Diş eti doku parçalarını içeren 1,5 mL santrifüj tüpüne 1 mL 2,5 mg/mL dispaz + kollajenaz çözeltisi ekleyin ve ardından tüpü 37 °C'de bir inkübatörde 15-20 dakika kuluçkaya yatırın.</li>
		<li>Doku şeffaf ve flokülent olduğunda, sindirimi sonlandırmak için nötralizasyon çözeltisinin 1 mL'sini ekleyin. Çözeltiyi 10-15 kez yukarı ve aşağı pipetleme ile iyice karıştırın. Çözeltiyi 100 μm örgü filtreden geçirin.</li>
		<li>5 dakika boyunca 200 x g'da santrifüj.</li>
		<li>Süpernatant çıkarın ve 10 mL büyüme faktörü içeren ortamda alttaki hücre peletini yeniden atın (adım 2.2). Hücre süspansiyonunu 100 mm hücre kültürü çanasına aktarın. Hücre kültürü yemeğine 10 μM Y-27632 ekleyin.</li>
		<li>%5 CO2 inkübatörde 37 °C'deki hücreleri kültüre edin. Eski G-medium'u her 2 günde bir taze G-medium ile değiştirin. 1. Gün ve 3.</li>
	</ol>
</li>
</ol>5. Hücre geçişi
<ol><li>Yemeği inkübatörden çıkarın, harcanan ortamı çıkarın ve PBS ile iki kez yıkayın. Her 100 mm'lik tabak için 2 mL% 0.05 tripsin ekleyin. NOT: Trypsin çözeltisi ile bulaşık tabanı arasında yeterli temas olduğundan emin olmak için yemeği çalkalayın.</li>
	<li>Sindirim işlemi için kabı 37 °C'de yaklaşık 5 dakika bir inkübatörde bırakın.</li>
	<li>Hücreleri incelemek ve çoğu hücrenin çanağın dibinden ayrıldığından emin olmak için bir mikroskop (40x) kullanın.</li>
	<li>Sindirimi durdurmak ve hücreleri 15 mL'lik bir tüpe aktarmak için nötralizasyon çözeltisinin 2 mL'lik kısmını ekleyin. Pipet 10-15 kez yukarı ve aşağı. Hücreleri 5 dakika boyunca 200 x g'da santrifüj edin.</li>
	<li>Üstnatant yavaşça çıkarın. Hücreleri 10 mL G-medium ile yeniden biriktirin ve hücre sayısını sayın.</li>
	<li>Her 100 mm'lik yemeğe10 mL G-medium ve 10 μM Y-27632'de yaklaşık 1 x 10 6 hücre ekleyin.</li>
	<li>G-medium ve Y-27632'yi her 2 günde bir yenileyin. Hücreleri 1.</li>
</ol>

<ol><li>Takahashi, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gingival+barrier%3A+regulation+by+beneficial+and+harmful+microbes%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Barriers%22%5BJournal%5D)">Gingival barrier: regulation by beneficial and harmful microbes.</a> Tissue Barriers. 7, 1651158(2019).</li>
<li>Michea, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epithelial+control+of+the+human+pDC+response+to+extracellular+bacteria%5BTitle%5D)+AND+%22European+Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">Epithelial control of the human pDC response to extracellular bacteria.</a> European Journal of Immunology. 43, 1264-1273 (2013).</li>
<li>Bedran, T. B., Mayer, M. P., Spolidorio, D. P., Grenier, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synergistic+anti-inflammatory+activity+of+the+antimicrobial+peptides+human+beta-defensin-3+%28hBD-3%29+and+cathelicidin+%28LL-37%29+in+a+three-dimensional+co-culture+model+of+gingival+epithelial+cells+and+fibroblasts%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+one%22%5BJournal%5D)">Synergistic anti-inflammatory activity of the antimicrobial peptides human beta-defensin-3 (hBD-3) and cathelicidin (LL-37) in a three-dimensional co-culture model of gingival epithelial cells and fibroblasts.</a> PloS one. 9, 106766(2014).</li>
<li>Sciezynska, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+culture+of+human+primary+keratinocytes-a+methods+review%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Dermatology%22%5BJournal%5D)">Isolation and culture of human primary keratinocytes-a methods review.</a> Experimental Dermatology. 28, 107-112 (2019).</li>
<li>Bryja, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Overview+of+the+different+methods+used+in+the+primary+culture+of+oral+mucosa+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Regulators+and+Homeostatic+Agents%22%5BJournal%5D)">Overview of the different methods used in the primary culture of oral mucosa cells.</a> Journal of Biological Regulators and Homeostatic Agents. 33, 397-401 (2019).</li>
<li>Kedjarune, U., Pongprerachok, S., Arpornmaeklong, P., Ungkusonmongkhon, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Culturing+primary+human+gingival+epithelial+cells%3A+comparison+of+two+isolation+techniques%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cranio-Maxillo-Facial+Surgery%3A+Official+Publication+of+the+European+Association+for+Cranio-Maxillo-Facial+Surgery%22%5BJournal%5D)">Culturing primary human gingival epithelial cells: comparison of two isolation techniques.</a> Journal of Cranio-Maxillo-Facial Surgery: Official Publication of the European Association for Cranio-Maxillo-Facial Surgery. 29, 224-231 (2001).</li>
<li>Klingbeil, M. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+two+cellular+harvesting+methods+for+primary+human+oral+culture+of+keratinocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+and+Tissue+Banking%22%5BJournal%5D)">Comparison of two cellular harvesting methods for primary human oral culture of keratinocytes.</a> Cell and Tissue Banking. 10, 197-204 (2009).</li>
<li>Qian, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((One-step+simple+isolation+method+to+obtain+both+epidermal+and+dermal+stem+cells+from+human+skin+specimen%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">One-step simple isolation method to obtain both epidermal and dermal stem cells from human skin specimen.</a> Methods in Molecular Biology. 1879, 139-148 (2019).</li>
<li>Wen, J., Zu, T., Zhou, Q., Leng, X., Wu, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Y-27632+simplifies+the+isolation+procedure+of+human+primary+epidermal+cells+by+selectively+blocking+focal+adhesion+of+dermal+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Tissue+Engineering+and+Regenerative+Medicine%22%5BJournal%5D)">Y-27632 simplifies the isolation procedure of human primary epidermal cells by selectively blocking focal adhesion of dermal cells.</a> Journal of Tissue Engineering and Regenerative Medicine. 12, 1251-1255 (2018).</li>
<li>Liu, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+simplified+and+efficient+method+to+isolate+primary+human+keratinocytes+from+adult+skin+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">A simplified and efficient method to isolate primary human keratinocytes from adult skin tissue.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. , (2018).</li>
<li>Lauer, G., Wiedmann-Al-Ahmad, M., Otten, J. E., Hubner, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunohistochemical+study+during+healing+of+free+palatal+mucosa+grafts+on+plastic-embedded+samples%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Oral+Pathology+%26+Medicine%3A+Official+Publication+of+the+International+Association+of+Oral+Pathologists+and+the+American+Academy+of+Oral+Pathology%22%5BJournal%5D)">Immunohistochemical study during healing of free palatal mucosa grafts on plastic-embedded samples.</a> Journal of Oral Pathology & Medicine: Official Publication of the International Association of Oral Pathologists and the American Academy of Oral Pathology. 30, 104-112 (2001).</li>
<li>Locke, M., Hyland, P. L., Irwin, C. R., Mackenzie, I. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modulation+of+gingival+epithelial+phenotypes+by+interactions+with+regionally+defined+populations+of+fibroblasts%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Periodontal+Research%22%5BJournal%5D)">Modulation of gingival epithelial phenotypes by interactions with regionally defined populations of fibroblasts.</a> Journal of Periodontal Research. 43, 279-289 (2008).</li>
<li>Shabana, A. H., Ouhayoun, J. P., Sawaf, M. H., Forest, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cytokeratin+patterns+of+human+oral+mucosae+in+histiotypic+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Archives+of+Oral+Biology%22%5BJournal%5D)">Cytokeratin patterns of human oral mucosae in histiotypic culture.</a> Archives of Oral Biology. 36, 747-758 (1991).</li>
<li>Kasai, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((biopsy+of+human+oral+mucosal+epithelial+cells+as+a+quality+control+of+the+cell+source+for+fabrication+of+transplantable+epithelial+cell+sheets+for+regenerative+medicine%5BTitle%5D)+AND+%22Regenerative+Therapy%22%5BJournal%5D)">biopsy of human oral mucosal epithelial cells as a quality control of the cell source for fabrication of transplantable epithelial cell sheets for regenerative medicine.</a> Regenerative Therapy. 4, 71-77 (2016).</li>
<li>Oda, D., Dale, B. A., Bourekis, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+oral+epithelial+cell+culture.+II.+Keratin+expression+in+fetal+and+adult+gingival+cells%5BTitle%5D)+AND+%22In+Vitro+Cellular+%26+Developmental+Biology%3A+Journal+of+the+Tissue+Culture+Association%22%5BJournal%5D)">Human oral epithelial cell culture. II. Keratin expression in fetal and adult gingival cells.</a> In Vitro Cellular & Developmental Biology: Journal of the Tissue Culture Association. 26, 596-603 (1990).</li>
<li>Guarino, M., Tosoni, A., Nebuloni, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+contribution+of+epithelium+to+organ+fibrosis%3A+epithelial-mesenchymal+transition%5BTitle%5D)+AND+%22Human+Pathology%22%5BJournal%5D)">Direct contribution of epithelium to organ fibrosis: epithelial-mesenchymal transition.</a> Human Pathology. 40, 1365-1376 (2009).</li>
<li>Hatakeyama, S., Yaegashi, T., Takeda, Y., Kunimatsu, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Localization+of+bromodeoxyuridine-incorporating%2C+p63-+and+p75%28NGFR%29-+expressing+cells+in+the+human+gingival+epithelium%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Oral+Science%22%5BJournal%5D)">Localization of bromodeoxyuridine-incorporating, p63- and p75(NGFR)- expressing cells in the human gingival epithelium.</a> Journal of Oral Science. 49, 287-291 (2007).</li>
<li>Bayar, G. R., Aydintug, Y. S., Gunhan, O., Ozturk, K., Gulses, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ex+vivo+produced+oral+mucosa+equivalent+by+using+the+direct+explant+cell+culture+technique%5BTitle%5D)+AND+%22Balkan+Medical+Journal%22%5BJournal%5D)">Ex vivo produced oral mucosa equivalent by using the direct explant cell culture technique.</a> Balkan Medical Journal. 29, 295-300 (2012).</li>
<li>Daniels, J. T., Kearney, J. N., Ingham, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+keratinocyte+isolation+and+cell+culture%3A+a+survey+of+current+practices+in+the+UK%5BTitle%5D)+AND+%22Burns%3A+Journal+of+the+International+Society+for+Burn+Injuries%22%5BJournal%5D)">Human keratinocyte isolation and cell culture: a survey of current practices in the UK.</a> Burns: Journal of the International Society for Burn Injuries. 22, 35-39 (1996).</li>
<li>Carrel, A., Burrows, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cultivation+of+adult+tissues+and+organs+outside+the+body%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Medical+Association%22%5BJournal%5D)">Cultivation of adult tissues and organs outside the body.</a> Journal of the American Medical Association. 55, 1379-1381 (1910).</li>
<li>Rheinwald, J. G., Green, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Formation+of+a+keratinizing+epithelium+in+culture+by+a+cloned+cell+line+derived+from+a+teratoma%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Formation of a keratinizing epithelium in culture by a cloned cell line derived from a teratoma.</a> Cell. 6, 317-330 (1975).</li>
<li>Oda, D., Watson, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+oral+epithelial+cell+culture+I.+Improved+conditions+for+reproducible+culture+in+serum-free+medium%5BTitle%5D)+AND+%22In+Vitro+Cellular+%26+Developmental+Biology%3A+Journal+of+the+Tissue+Culture+Association%22%5BJournal%5D)">Human oral epithelial cell culture I. Improved conditions for reproducible culture in serum-free medium.</a> In Vitro Cellular & Developmental Biology: Journal of the Tissue Culture Association. 26, 589-595 (1990).</li>
<li>Boyce, S. T., Ham, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calcium-regulated+differentiation+of+normal+human+epidermal+keratinocytes+in+chemically+defined+clonal+culture+and+serum-free+serial+culture%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Investigative+Dermatology%22%5BJournal%5D)">Calcium-regulated differentiation of normal human epidermal keratinocytes in chemically defined clonal culture and serum-free serial culture.</a> The Journal of Investigative Dermatology. 81, 33-40 (1983).</li>
<li>Guo, A., Jahoda, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+improved+method+of+human+keratinocyte+culture+from+skin+explants%3A+cell+expansion+is+linked+to+markers+of+activated+progenitor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Dermatology%22%5BJournal%5D)">An improved method of human keratinocyte culture from skin explants: cell expansion is linked to markers of activated progenitor cells.</a> Experimental Dermatology. 18, 720-726 (2009).</li>
<li>Smola, H., Krieg, T. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aSmola%2C+H+%22The+keratinocyte+handbook%22">The keratinocyte handbook</a>. Irene, M., Leigh, E., Lane, B., Watt, F. M. 375, Cambridge University Press. FEBS Letters 311(1994).</li>
<li>Shwetha, H. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ex+vivo+culture+of+oral+keratinocytes+using+direct+explant+cell+culture+technique%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Oral+and+Maxillofacial+Pathology%3A+JOMFP%22%5BJournal%5D)">Ex vivo culture of oral keratinocytes using direct explant cell culture technique.</a> Journal of Oral and Maxillofacial Pathology: JOMFP. 23, 243-247 (2019).</li>
<li>Yin, J., Yu, F. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rho+kinases+regulate+corneal+epithelial+wound+healing%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology.+Cell+Physiology%22%5BJournal%5D)">Rho kinases regulate corneal epithelial wound healing.</a> American Journal of Physiology. Cell Physiology. 295, 378-387 (2008).</li>
<li>Chapman, S., Liu, X., Meyers, C., Schlegel, R., McBride, A. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+keratinocytes+are+efficiently+immortalized+by+a+Rho+kinase+inhibitor%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Clinical+Investigation%22%5BJournal%5D)">Human keratinocytes are efficiently immortalized by a Rho kinase inhibitor.</a> The Journal of Clinical Investigation. 120, 2619-2626 (2010).</li>
<li>Strudwick, X. L., Lang, D. L., Smith, L. E., Cowin, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Combination+of+low+calcium+with+Y-27632+rock+inhibitor+increases+the+proliferative+capacity%2C+expansion+potential+and+lifespan+of+primary+human+keratinocytes+while+retaining+their+capacity+to+differentiate+into+stratified+epidermis+in+a+3D+skin+model%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+One%22%5BJournal%5D)">Combination of low calcium with Y-27632 rock inhibitor increases the proliferative capacity, expansion potential and lifespan of primary human keratinocytes while retaining their capacity to differentiate into stratified epidermis in a 3D skin model.</a> PloS One. 10, 0123651(2015).</li>
<li>Orazizadeh, M., Hashemitabar, M., Bahramzadeh, S., Dehbashi, F. N., Saremy, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+the+enzymatic+and+explant+methods+for+the+culture+of+keratinocytes+isolated+from+human+foreskin%5BTitle%5D)+AND+%22Biomedical+Reports%22%5BJournal%5D)">Comparison of the enzymatic and explant methods for the culture of keratinocytes isolated from human foreskin.</a> Biomedical Reports. 3, 304-308 (2015).</li>
<li>Rosin, F. C. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Keratin+expression+in+gingival+tissue+and+primary+cultured+gingival+keratinocytes%3A+Are+there+differences%5BTitle%5D)+AND+%22Archives+of+Oral+Biology%22%5BJournal%5D)">Keratin expression in gingival tissue and primary cultured gingival keratinocytes: Are there differences.</a> Archives of Oral Biology. 117, 104780(2020).</li>
<li>Wang, T., Kang, W., Du, L., Ge, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rho-kinase+inhibitor+Y-27632+facilitates+the+proliferation%2C+migration+and+pluripotency+of+human+periodontal+ligament+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cellular+and+Molecular+Medicine%22%5BJournal%5D)">Rho-kinase inhibitor Y-27632 facilitates the proliferation, migration and pluripotency of human periodontal ligament stem cells.</a> Journal of Cellular and Molecular Medicine. 21, 3100-3112 (2017).</li>
</ol>

Tüm yazarlar çıkar çatışması olmadığını beyan eder.

Diş eti dokusu periodontal bütünlüğü ve sağlığı koruyan anahtar bir yapıdır. Dişeti epitel hücreleri periodontal dokunun onarımında ve yenilenmesinde önemli rollere sahiptir ve oral biyoloji, farmakoloji, toksikoloji ve oral mukoza eksiklikleri de dahil olmak üzere bilimsel araştırma ve klinik uygulamalarda ve ilgili alanlarda kullanılabilir18. Bu nedenle, oral epitel hücrelerini hasat etmek için istikrarlı ve verimli bir yöntem geliştirmek gerekir19. Birincil epitel hücrel...

Periodontal dokuyu koruyan ilk hat savunma yapısı olan insan dişeti, sadece fiziksel ve kimyasal bir bariyer1değil, aynı zamanda bağışıklık yanıtlarına katılan ve bağışıklık bariyeri oluşturan farklı inflamatuar mediatör sınıflarını salgılar2,3. Diş eti epitel, periodontal dokunun onarımında ve yenilenmesinde önemli bir rol oynar. Bu nedenle, diş eti epitelinin savunmasını ve bağışıklığını incelemek periodontitin oluşumunu, tanısını ve tedavisini anlamak için büyük öneme sahiptir. Diş eti epitel hücrelerinin insan dişeti dokusundan izolasyonu ve kültürü, diş eti epitelinin incelenmesi için gerekli ilk adımdır. Böyle bir prosedür, doku mühendisliği için tohum hücreleri üretmek, periodontal ilişkili hastalıkların in vitro modelleri ve periodontal kusurları onarmak için malzemeler gibi temel operasyonları gerektirir.
Primer diş eti epitel hücreleri düşük bölünme oranı in vitro4ile karakterizedir Araştırmacılar on yıllardır optimal bir izolasyon ve yetiştirme yöntemi aramaktadır. Bugüne kadar laboratuvarlarda primer diş eti epitel hücrelerini in vitro4,5elde etmek için iki farklı teknik, doğrudan eksplant yöntemi ve enzimatik bir yöntem yaygın olarak kullanılmaktadır. Doğrudan eksplant yöntemi, daha az miktarda doku örneğinin gerekliliği ve basit izolasyon prosedürü gibi avantajlara sahiptir, ancak daha uzun kültür süresi ve kontaminasyona yatkınlık dezavantajlarına sahiptir5. Enzimmatik yöntem gereken kültür süresini kısaltsa da, verimlilik nispeten düşüktür ve kullanılan enzimlere ve ortama bağlı olarak değişir. Kedjarune ve ark.6, alt kültürden önce (2 hafta) daha fazla zaman gerektiren doğrudan eksplant yönteminin, enzimatik yönteme kıyasla diş eti epitel hücrelerini kültlemede daha başarılı göründüğünü göstermiştir. Bununla birlikte, bu iki yöntemi karşılaştıran Klingbeil ve ark.7, enzmatik yöntemin oral epitel hücrelerinin birincil kültürleri için en iyi sonuçlara sahip olduğunu ve en kısa süre içinde (11.9 gün ile 14.2 gün) optimal hücre verimini elde etmenin mümkün olduğunu buldu.
Bu nedenle, oral epitel hücrelerinin izolasyonu ve kültürü için daha uygun ve etkili bir yöntem geliştirmek önemliydi4. Daha önce Rho ile ilişkili protein kinazının (ROCK) bir inhibitörü olan Y-27632'nin eklenmesinin, insan primer epidermal hücrelerinin ve keratinositlerin yetişkin cilt dokularından izolasyon prosedürünü basitleştirdiğini bildirdik8,9,10. Epidermal hücrelerin büyümesini ve verimini destekleyen ve epidermal hücrelerin büyümesini ve verimini destekleyen yeni bir şartlandırılmış aşılama ortamı olan G-medium'u geliştirdik8,9,10. Bu çalışmada G-medium ile Y-27632'yi birleştirerek diş eti epitel hücreleri için yeni bir serumsuz izolasyon ve kültür tekniği geliştirdik. Özünde, yöntemimiz geleneksel iki adımlı enzymatic yöntemin basitleştirilmesine dayanmaktadır, bu nedenle yeni yöntemimizi doğrudan explant yöntemiyle karşılaştırdık. Bu modifiye enzimatik yöntem, diş eti epitel hücrelerini diş eti dokusundan ayırmak için gereken süreyi önemli ölçüde kısaltır ve diş eti epitel hücrelerinin kültleme verimliliğini arttırır.

<table><tbody><tr><td>İsimler</td><td></td><td></td><td>Kısaltmalar & </td></tr><tr><td>Yorumlar Kontes otomatik hücre sayacı</td><td>Şangay Ruiyu Biyo-bilim & Teknoloji Co.Ltd.</td><td>BBA0218AC</td><td>Otomatik hücre sayımı</td></tr><tr><td>Hücre inkübasyonu için</td><td>CO2 İnkübatörü</td><td>Thermo Scientific</td><td>51026333</td></tr><tr><td>Sorvall ST 16R Santrifüj</td><td>Thermo Scientific</td><td>75004380</td><td>Hücre santrifüjü</td></tr><tr><td>Hücre Kültürü Kabı</td><td>Eppendorf</td><td>30702115</td><td>Hücre kültürü için</td></tr><tr><td>50 ml Santrifüj Tüpü</td><td>KIRGEN</td><td>171003</td><td>Hücre santrifüjlemesi için</td></tr><tr><td>1.5 ml mikrosantrifüj Tüpleri</td><td>KIRGEN</td><td>190691J</td><td>Hücre sindirimi için</td></tr><tr><td>Hücre Süzgeci</td><td>Corning dahil</td><td>431792</td><td>Hücre filtrasyonu</td></tr><tr><td>Fosfat tamponlu çözelti</td><td>Solarbio Life Science</td><td>P1020-500</td><td>Yıkama solüsyonu</td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Thermo Scientific</td><td>C11995500</td><td>Nötralizasyon ortamının bileşeni</td></tr><tr><td>Tanımlanmış K-SFM</td><td>Ömrü Teknolojiler</td><td>10785-012</td><td>Dişeti epitel ve nbsp; hücre kültürü ortamı</td></tr><tr><td>Penisilin Streptomisin</td><td>Thermo Scientific</td><td>15140-122</td><td>Antibiyotikler</td></tr><tr><td>Fetal Sığır Serumu</td><td>Biyolojik Endüstriler</td><td>04-001-1AC5</td><td>Nötralizasyon ortamının bileşeni</td></tr><tr><td>%0.05 Tripsin</td><td>Yaşam Teknolojileri</td><td>25300-062</td><td>HGGEPC'lerin ayrışması</td></tr><tr><td>için Seyreltme Ortamı</td><td>Yaşam Teknolojileri</td><td>50-9701</td><td>Kaplama matrisi için</td></tr><tr><td>Dispase</td><td>Gibco</td><td>17105-041</td><td>HGGEPC'lerin izolasyonu için</td></tr><tr><td>Kollajenaz Tip I</td><td>Yaşam Teknolojileri</td><td>17100-017</td><td>HGGEPC'lerin izolasyonu için</td></tr><tr><td>F12 Besin Karışımı, Hams</td><td>Life Technologies</td><td>31765035</td><td>G-medium</td></tr><tr><td>B27 Takviyesi Bileşeni</td><td>Yaşam Teknolojileri</td><td>17504044</td><td>G-orta</td></tr><tr><td>FGF-2 Millipore</td><td>Merck Biosciences'ta</td> büyüme faktörü <td>341595</td><td>G-ortamı</td></tr><tr><td>Y-27632'de</td> büyüme faktörü <td>Gen Çalışması</td><td>IAD1011</td><td>ROCK inhibitörü</td></tr><tr><td>Fungizone</td><td>Gibco</td><td>15290026</td><td>G-ortamı</td></tr><tr><td>EGF Rekombinant İnsan Proteini</td><td>Gibco</td><td>PHG0311</td><td>için Hazırlık G-ortamı</td></tr><tr><td>Hücre Sayma Kiti-8'de</td> <td>büyüme faktörüHücre</td><td>proliferasyon testi için</td>Dojindo Moleküler Teknolojiler <td>CK04</td></tr><tr><td>Tavşan Anti-İnsan CK18</td><td>Abcam</td><td>ab82254</td><td>HGGEPC'lerin farklılaşma markörünü kontrol etmek için immünofloresan boyama için</td></tr><tr><td>Tavşan Anti-İnsan Sitokeratin10</td><td>Abcam</td><td>ab76318</td><td>HGGEPC'lerin farklılaşma belirtecini kontrol etmek için immünofloresan boyama için</td></tr><tr><td>Fare anti-insan Vimentin</td><td>Hücre Sinyalizasyon Teknolojisi</td><td>3390</td><td>Dişeti fibroblastlarının immünofloresan boyaması için</td></tr><tr><td>Tavşan Anti-İnsan pan-ck</td><td>BD</td><td>550951</td><td>HGGEPC'lerin tavşan anti-Ki67 Abcam'ın farklılaşma belirtecini kontrol etmek için immünofloresan boyama için</td></tr><tr><td></td><td></td><td>15580</td><td>HGGEPC'lerin tavşan anti-p63'ünün farklılaşma markörünü kontrol etmek için immünofloresan boyama için</td></tr><tr><td></td><td>Biolegend</td><td>619002</td><td>HGGEPC'lerin farklılaşma markörünü kontrol etmek için immünofloresan boyama için</td></tr><tr><td>tavşan anti-p75NGFR</td><td>Abcam</td><td>ab52987</td><td>HGGEPC'lerin farklılaşma markörünü kontrol etmek için immünofloresan boyama için</td></tr></tbody></table>

y-27632 kullanarak birincil İnsan dişeti epitel hücrelerinin İzolasyonu ve kültürü

Isolation and Culture of Primary Human Gingival Epithelial Cells using Y-27632

Diş eti dokusu periodontal dokuları koruyan ve birçok oral fonksiyonda anlamlı roller oynayan ilk yapıdır. Diş eti epitel, özellikle periodontal dokunun onarımı ve yenilenmesinde diş eti dokusunun önemli bir yapısıdır. Diş eti epitel hücrelerinin işlevlerini incelemek, oral kusurları onarmak ve biyomalzemelerin uyumluluğunu tespit etmek gibi çok önemli bilimsel değere sahiptir. İnsan dişeti epitel hücreleri son derece farklılaştırılmış keratinize hücreler olduğundan, ömürleri kısadır ve geçişleri zordur. Şimdiye kadar, diş eti epitel hücrelerini izole etmenin ve kültürlemenin sadece iki yolu vardır, doğrudan eksplant yöntemi ve enzimatik bir yöntem. Bununla birlikte, doğrudan eksplant yöntemini kullanarak epitel hücreleri elde etmek için gereken süre daha uzundur ve enzymatic yöntemin hücre sağkalım oranı daha düşüktür. Klinik olarak, diş eti dokusunun kazanımı sınırlıdır, bu nedenle istikrarlı, verimli ve basit bir in vitro izolasyon ve kültür sistemine ihtiyaç vardır. Epitel hücrelerinin büyümesini seçici olarak teşvik edebilecek Rho ile ilişkili bir kinaz (ROCK) inhibitörü olan Y-27632'yi ekleyerek geleneksel enzimmatik yöntemi geliştirdik. Modifiye enzymatic yöntemimiz, geleneksel enzymatic yöntemin adımlarını basitleştirir ve doğrudan eksplant yöntemine ve enzymatic yönteme göre önemli avantajlara sahip olan epitel hücrelerinin kült verimliliğini arttırır.

Şekil 1, doğrudan eksplant yönteminin ve değiştirilmiş enzymatic yönteminin şematik diyagramını gösterir. Doğrudan eksplant yöntemi tüm süreç boyunca herhangi bir sindirim enzimi gerektirmez. Buna karşılık, geleneksel enzymatic yöntem genellikle epitel tabakasını alttaki fibroblast tabakasından ayırmak için dispaz ve kollajenaz olmak üzere iki sindirim enzimi kümesine ihtiyaç duyar ve daha sonra epitel hücrelerini süspansiyona serbest bırakmak için tripsin gerekir. Yeni yöntemimiz ayırma adı...

Burada geleneksel yönteme Kaya inhibitörü Y-27632 eklenerek insan dişeti epitel hücrelerinin izolasyonu ve kültürü için değiştirilmiş bir yöntem sunuyoruz. Bu yöntem daha kolay, daha az zaman alıcıdır, kök hücre özelliklerini geliştirir ve hem laboratuvar hem de klinik uygulamalar için daha fazla sayıda yüksek potansiyelli epitel hücresi üretir.

Y-27632 Kullanarak Birincil İnsan Dişeti Epitel Hücrelerinin İzolasyonu ve Kültürü

The gingival tissue is the first structure that protects periodontal tissues and plays meaningful roles in many oral functions. The gingival epithelium is ...

Bu nedenle, bu hücre tabanlı protokolün genel amacı, doğrudan patlıcan yönteminin eksikliklerini iyileştirmek için İnsan Dişeti Epitel Hücrelerini izole etmek ve bunlarla karşılaşmaktır. Yeni modifiye endotemik yöntemden, malzeme ve ekipmanlarımıza dayanarak nispeten kısa sürede daha fazla sayıda birincil diş eti epitel hücresi elde edebiliriz. Yani bu protokolde kullanılan insan dokusu, Kurumun İnsan Araştırma Etik Kurulu yönergelerine göre Maxillofasiyal Cerrahi Bölümü'nde etkilenen dişlerin ekstraksiyonlarından atılan taze erişkin diş eti dokularıydı.Yeni Modifiye Enzimatik Yöntem.Gingival Doku Ön Işlemi.Dokuları %75 etanol ile 30 saniye boyunca yıkayın. Ve sonra, her biri beş dakika boyunca iki kez yıkama çözeltisi ile. Gingival Dokusunun Sindirimi.Dokuları iki cerrahi bıçakla küçük parçalara ayırın. 1,5 mililitre santrifüj tüpüne 2,5mg/mililitre dispaz ve kollajenaz-1 çözeltisi ekleyin. Doku parçalarını 1.5 mililitre santrifüj tüpüne koyun. 37 dakikada 15-20 dakika kuluçkaya yatır

isolation-culture-primary-human-gingival-epithelial-cells-using-y

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Biyomühendislik

Bu video, bir fare modelinden dişeti bağışıklık hücresi ağının izolasyon prosedürünü göstermektedir. Enzimatik sindirim, diş eti dokusunu bağlı dişlerden ve kemikten serbest bırakır, bu da mekanik olarak daha fazla sindirilir ve diş etinden bağışıklık hücrelerini serbest bırakır. İzole edilen hücreler immünolojik deneyler için hazırdır.

Murin Diş Bloklarından Dişeti İmmün Hücre Ağının İzolasyonu

Bu videoda, anaerobik patojenik bir bakteri olan Porphyromonas gingivalis'in insan göbek damarı endotel hücrelerine (HUVEC'ler) yapışma ve istila etme yeteneğini değerlendirmek için bir teknik gösterilmektedir. Konakçı hücreleri bakterilerle enfekte ettikten sonra, konakçı hücreler hem yapışmış hem de içselleştirilmiş bakterileri serbest bırakmak için parçalanır. Lizat uygun bir ortamda kaplandığında, kolonilerin varlığı başarılı bakteri-konak hücre etkileşimlerini gösterir.

Anaerobik Bakteri-Konak Hücre Etkileşimlerini İncelemek İçin Bir Bakteriyel Enfeksiyon Testi

Bu çalışma, bir tek hücre kültürü üretmek için fare ağız boşluğundan gingival dokular izole etmek ve işlemek için etkili bir yöntem açıklanır. Ortaya çıkan hücreler bir başka akış sitometri analizi ve klinik çalışmalar için kullanılabilir.

Murin Dişeti Hücre İzolasyonu, İşleme ve Analiz

Bu makale iki protokol sunar: biri konakçıyı başarılı bir şekilde istila edebilen ve hayatta kalabilen anaerobik bakterileri ölçmek, diğeri ise konakçı hücrelerle etkileşime giren anaerobik bakterileri görselleştirmek için. Bu çalışma, yetiştirilebilir herhangi bir anaeroba ve herhangi bir ökaryotik hücre tipine uygulanabilir.

Ana Hücreleri ile Anaerobik Bakteriler Etkileşim değerlendirilmesi için bir model organizma olarak Porphyromonas gingivalis

Biz izolasyon, fenotipik karakterizasyonu ve kemirgen dişetinin gelen bağışıklık hücrelerinin fonksiyonel analiz için bir teknik kurduk.

İzolasyon, Karakterizasyonu ve Dişeti Bağışıklık Hücre Ağı Fonksiyonel Sınav

Burada birincil insan Lenfositi yetişkin cilt dokularının üzerinden verimli bir şekilde ayırmak için bir protokol mevcut. Bu yöntem geleneksel yordamı ROCK inhibitörü Y-27632 aşılama ortamda kendiliğinden dermal hücrelerden epidermal hücrelerin ayırarak basitleştirir.

Birincil insan Lenfositi yetişkin cilt dokusundan izole etmek için basit ve etkili bir yöntem

Birincil insan tükürük bezi türevi epitelyal hücreleri izole etmek ve yetiştirmek için bir yöntem sunuyoruz. Bu hücreler onları tükürük epitelyal orijinli olmak ile tutarlı gen ifade desenleri sergiler ve Engelbreth-Holm-Swarm tümör hücrelerinden türetilen Bodrum membran matrisleri üzerinde salispheres olarak veya tedavi kültür yemekleri monolayers olarak yetişebilir.

Salispheres veya Monolayers olarak In vitro büyüme için ınsan tükürük bezlerinden tükürük epitelyal hücrelerin yalıtım

Mevcut protokol, yetişkin fare damak tadından elde edilen oral keratinositlerin izolasyonu ve kültürünü açıklar. İmmünasyon kullanılarak yapılan bir değerlendirme yöntemi de rapor edilir.

Yetişkin Fare Damak Tadından Birincil Oral Keratinositlerin İzolasyonu ve Kültürü

Diş folikülleri epitel popülasyonu ve mezenkimal hücreler içerir. Epitel popülasyonu, farklı bir kültür ortamı sağlanarak heterojen diş folikül hücre popülasyonundan seçilmiştir. Epitel hücreleri hayatta kaldı ve serumsuz bir ortamda koloniler oluşturdu.

Epitel Hücrelerinin İnsan Diş Foliküllerinden İzolasyonu

Bu çalışma, primer insan meme epitel hücrelerini (HMEC'ler) küçük miktarlarda meme dokusundan verimli bir şekilde izole etmek ve büyütmek için daha kolay, zaman kazandıran ve ekonomik bir protokol bildirmektedir. Bu protokol, hem laboratuvar hem de klinik uygulamalar için birincil HMEC'lerin hızlı bir şekilde üretilmesi için uygundur.

Primer İnsan Meme Epitel Hücrelerinin İzolasyonu ve Kültürü

Öğrenin, Y-27632 kullanarak birincil insan dişeti epitel hücrelerinin izolasyonu ve kültürü için geliştirilmiş hücre kültürü yöntemini. Bu teknik kök hücre özelliklerini artırır ve rejeneratif tıpta uygulama sağlar.

Y-27632 Kullanarak Birincil İnsan Dişeti Epitel Hücrelerinin İzolasyonu ve Kültürü

Daha fazla video keşfet