Name: Ev Yapımı Mini Biyoreaktörlerde İndüklenmiş Pluripotent Kök Hücrelerden Beyin Organoidi Üretimi (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-12-11T15:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 16 s
Description: Öğrenin, ev yapımı mini biyoreaktörler kullanarak insan indüklenmiş pluripotent kök hücrelerinden beyin organoidi üretme yöntemini. Bu protokol, merkezi sinir sistemi patolojilerini modellemek için yüksek kaliteli 3D doku oluşturur.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Bu çalışma, Rusya Federasyonu Bilim ve Yükseköğretim Bakanlığı'ndan 075-15-2019-1669 hibesi (RT-PCR analizi) ve Rusya Bilim Vakfı'ndan 19-15-00425 sayılı hibe ile desteklendi (diğer tüm çalışmalar için). Yazarlar ayrıca Pavel Belikov'a video düzenleme konusundaki yardımları için teşekkür etti. El yazmasındaki figürler BioRender.com ile oluşturulmuştur.

NOT : 1.2 ve 1.3 adımları hariç olmak üzere protokol boyunca steril teknik kullanın. Hücrelere veya organoidlere uygulamadan önce tüm kültür ortamlarını ve çözeltilerini 37 °C'ye ısıtın. %80 nem üzerinde%5 CO 2'de 37 °C'de bir CO2 inkübatöründe hücre yetiştirin. Protokol şeması Şekil 1'de gösterilmiştir.
1. Petri kaplarını mini biyoreaktörlere dönüştürmek
<ol><li>Steril 15 mL santrifüj tüplerini 7-8 mm yüksekliğinde halkalar halinde kesin; halkaları otoklavla.</li>
	<li>Düşük yapışmalı, işlenmemiş veya mikrobiyolojik Petri kaplarını kırıntılara ayırın. Sıvı plastik hazırlamak için yaklaşık 1 g plastik kırıntıyı 10 mL kloroformda bir gecede çözün. DİkKAT: Duman kaputunda çalışın.</li>
	<li>Elde eden sıvı plastiğin pipetleme için yeterince viskoz olup olmadığını kontrol edin; damlası küresel bir form tutar ve yüzeye yayılmaz. Çok sıvıysa, daha fazla plastik kırıntı ekleyin. Kalınsa, kloroform ekleyin.</li>
	<li>Steril ultra düşük yapışma 6 cm Petri kabının ortasına plastik bir düğme yapın. Aşağıda ayrıntılı olarak belirtildiği gibi eşit derecede uygun iki yol vardır.<ol>
<li>Otomatik kapatılmış plastik halkayı ortaya koyun ve sıvı plastiği halkanın içine bırakın.</li>
		<li>Herhangi bir plastik halka olmadan, sıvı plastiği Petri kabının ortasına bırakın.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Bulaşıkları kurutulana kadar laminer akış davlumbazında 2-3 saat açık bırakın. Kurutulmuş yemekleri 15-20 dakika ultraviyole radyasyonla tedavi edin.</li>
</ol>2. iPSC'lerin nöronal farklılaşması indüksiyonu
<ol><li>Hücre dışı proteinlerden oluşan bir matrisle önceden kaplanmış 35 mm Petri kaplarında% 75-90'a kadar pluripotent kök hücreler için ortamda iPSC'ler yetiştirin.</li>
	<li>Orta A-SR hazırlayın. Ayrıntılar için Tablo 1'e bakın.</li>
	<li>Yetiştirme ortamını epire edin ve 0.</li>
	<li>Orta A'ya hazırlanın (bkz. Tablo 2).</li>
	<li>Hücreleri 2-14.</li>
</ol>3. 14. Günde nöroepithelial öncül hücrelerden sferoid oluşumu
<ol><li>14. Günde, her kuyuda yaklaşık 1.200 mikrowell içeren özel bir 24 kuyu kültür plakası kullanarak nöroepithelial öncü hücrelerden sferoidler yapın (Şekil 2C). Aşağıda verilen prosedürü izleyin. NOT: Bu farklılaşma aşamasında, 35 mm Petri kabı genellikle 3 - 3,5 x 106 nöroepithelial öncül hücre içerir. Bu nedenle, nöroepithelial öncü hücrelere sahip bir adet 35 mm Petri kabı, mikrowells ile 24 kuyulu kültür plakasının 3 - 4 kuyusu için yeterlidir.</li>
	<li>Mikrowells ile 24 kuyulu bir kültür plakası hazırlayın: Her kuyuya, plaka tutucu ile donatılmış sallanan kova rotorunda 5 dakika boyunca 1.300 x g'da kısa bir süre 1 mL orta A. Santrifüj ekleyin. Mikroskop altında mikrowelllerde kabarcık olmadığını kontrol edin.</li>
	<li>Orta B'ye hazırlanın (Tablo 3).</li>
	<li>Ortamı nöroepithelial öncü hücrelerle Petri kabından çıkarın; hücreleri 2 mL DMEM/F12 ile yıkayın. Hücre müfrezesi için, PBS'de hazırlanan 1,5 mL 0,48 mM EDTA çözeltisi ile hücreleri tedavi edin. Mikroskop altında hücre müfrezesini kontrol edin.</li>
	<li>Hücreleri 15 mL'lik bir tüpe toplar. Hücreleri yıkamak için tüpe 5 mL DMEM/F12 ekleyin. 5 dakika boyunca 200 x g'da santrifüj. Süpernatant ve resuspend hücreleri 2 mL orta B'de çıkarın.</li>
	<li>Trypan Blue boyama ve hemositometre ile hücre konsantrasyonu ve canlılığını kontrol edin. Toplamda 1 x 106 uygulanabilir hücre içermesi için gereken süspansiyon hacmini hesaplayın.</li>
	<li>1 x 106 hücre içeren hücre süspansiyonunun mikrowells ile 24 kuyulu bir plakanın her kuyusuna aktarın. Her kuyuya 2 mL'ye kadar orta B ekleyin, hücreleri birkaç kez hafifçe yukarı ve aşağı borulayın ve mikrowelllerdeki hücreleri yakalamak için 1 dakika boyunca kısa bir süre 100 x g santrifüjleyin. NOT: Kuyu başına hücre sayısı 1 x 106'yıgeçmemelidir. Aksi takdirde, komşu mikrowelllerden gelen küreseller kaynaşır.</li>
	<li>Mikroskop altında hücrelerin mikrowelllerde eşit olarak dağıtılıp dağıtılmadığını kontrol edin. Hücreler eşit olmayan şekilde dağıtılırsa pipetleme ve santrifüjlemeyi tekrarlayın.</li>
	<li>Hücrelerin küresellerde toplanmasına izin vermek için plakayı bir gecede kuluçkaya yatırın.</li>
</ol>4. Organoidlerin eldei ve yetiştirilmesi
<ol><li>Ertesi sabah (15. gün), mikroskop altında küresellerin kalitesini kontrol edin. Sağlıklıysa şeffaf ve pürüzsüz olduklarından emin olun (Şekil 2A,B). Küreselleri her kuyudan 15 mL'lik bir tüpe dikkatlice toplayın, küreselleri 2-3 dakika yerçekimi ile çökeltmek üzere bırakın ve ardından süpernatantı çıkarın.</li>
	<li>Sferoidlere 2 mL matrisin buz üzerinde aynı anda çözülmüş ekleyin. Pipetleme ile hafifçe karıştırın ve oda sıcaklığında 30 dakika kuluçkaya yatırın.</li>
	<li>Matrisin fazlalığını yıkamak için, tüpe 8 mL orta B. Pipet ekleyin, ardından tüpü 100 x g'da1 dakika santrifüjleyin. NOT: Küresellerin geri döndürülemez toplanmasını önlemek için santrifüjleme süresini ve hızını aşmayın.</li>
	<li>Üsttekini çıkarın. Tüpe 2 mL orta B, pipet yavaşça ekleyin. Küresel süspansiyonu, her biri 4 mL orta B içeren iki mini biyoreaktör arasında bölün.</li>
	<li>Petri kabını mini biyoreaktörlerle bir yörünge çalkalayıcıya koyun. Organoidleri 70-75 rpm dönme hızında yetiştirin.</li>
	<li>16. günde orta C(Tablo 4) hazırlayın.</li>
	<li>Organoidleri 15 mL tüpe aktarın. 5 dakika boyunca, dibe düşmelerine izin verin, süpernatantı aspire edin, 5 mL orta C ekleyin. NOT: Şeffaf ve zar zor görülebilen küreselleri kaybetmemeye dikkat edin.</li>
	<li>Sferoidleri iki hafta boyunca orta C'de yetiştirin ve ortamı her iki günde bir yenileyin. Bu iki haftanın sonunda, aşağıdaki ekim için mini biyoreaktör başına yaklaşık 100 küresel bırakın. Sıvı nitrojende donma ortamında aşırı küreselleri dondurun.</li>
	<li>30. günde orta D 'yi hazırlayın (Tablo 5).</li>
	<li>Yetiştirme ortamını olgunlaşma ortamı olan orta D olarak değiştirin. Üç hafta boyunca her 2-3 günde bir ekim ortamını yenileyin, ardından BDNF ve GDNF olmadan orta D kullanın.</li>
</ol>

<ol><li>Marchetto, M. C., Winner, B., Gage, F. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pluripotent+stem+cells+in+neurodegenerative+and+neurodevelopmental+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Human+Molecular+Genetics%22%5BJournal%5D)">Pluripotent stem cells in neurodegenerative and neurodevelopmental diseases.</a> Human Molecular Genetics. 19, 71-76 (2010).</li>
<li>Lee, C. T., Bendriem, R. M., Wu, W. W., Shen, R. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((3D+brain+Organoids+derived+from+pluripotent+stem+cells%3A+promising+experimental+models+for+brain+development+and+neurodegenerative+disorders%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biomedical+Science%22%5BJournal%5D)">3D brain Organoids derived from pluripotent stem cells: promising experimental models for brain development and neurodegenerative disorders.</a> Journal of Biomedical Science. 24 (1), 1-12 (2017).</li>
<li>Kadoshima, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Self-organization+of+axial+polarity%2C+inside+out+layer+pattern%2C+and+species-specific+progenitor+dynamics+in+human+ES+cell-derived+neocortex%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Self-organization of axial polarity, inside out layer pattern, and species-specific progenitor dynamics in human ES cell-derived neocortex.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences U.S.A. 110 (50), 20284(2013).</li>
<li>Lancaster, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cerebral+organoids+model+human+brain+development+and+microcephaly%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Cerebral organoids model human brain development and microcephaly.</a> Nature. 501 (7467), 373-379 (2013).</li>
<li>Xiang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fusion+of+regionally+specified+hPSC+derived+organoids+models+human+brain+development+and+interneuron+migration%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Fusion of regionally specified hPSC derived organoids models human brain development and interneuron migration.</a> Cell Stem Cell. 21, 383-398 (2017).</li>
<li>Muguruma, K., Nishiyama, A., Kawakami, H., Hashimoto, K., Sasai, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Self-organization+of+polarized+cerebellar+tissue+in+3D+culture+of+human+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Self-organization of polarized cerebellar tissue in 3D culture of human pluripotent stem cells.</a> Cell Reports. 10 (4), 537-550 (2015).</li>
<li>Qian, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Brain+region+specific+organoids+using+mini+bioreactors+for+modeling+ZIKV+exposure%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Brain region specific organoids using mini bioreactors for modeling ZIKV exposure.</a> Cell. 165 (5), 1238-1254 (2016).</li>
<li>Qian, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+human+brain+region+specific+organoids+using+a+miniaturized+spinning+bioreactor%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Generation of human brain region specific organoids using a miniaturized spinning bioreactor.</a> Nature Protocols. 13 (3), 565-580 (2018).</li>
<li>Jo, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Midbrain+like+organoids+from+human+pluripotent+stem+cells+contain+functional+dopaminergic+and+neuro+melanin+producing+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Midbrain like organoids from human pluripotent stem cells contain functional dopaminergic and neuro melanin producing neurons.</a> Cell Stem Cell. 19 (2), 248-257 (2016).</li>
<li>Sakaguchi, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+functional+hippocampal+neurons+from+self-organizing+human+embryonic+stem+cell+derived+dorsomedial+telencephalic+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communication%22%5BJournal%5D)">Generation of functional hippocampal neurons from self-organizing human embryonic stem cell derived dorsomedial telencephalic tissue.</a> Nature Communication. 6 (1), 8896(2015).</li>
<li>Di Lullo, E., Kriegstein, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+use+of+brain+organoids+to+investigate+neural+development+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">The use of brain organoids to investigate neural development and disease.</a> Nature Reviews Neuroscience. 18 (10), 573-584 (2017).</li>
<li>Chen, K. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pluripotent+stem+cell+platforms+for+drug+discovery%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Molecular+Medicine%22%5BJournal%5D)">Pluripotent stem cell platforms for drug discovery.</a> Trends in Molecular Medicine. 24 (9), 805-820 (2018).</li>
<li>Dang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zika+virus+depletes+neural+progenitors+in+human+cerebral+organoids+through+activation+of+the+innate+immune+receptor+TLR3%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Zika virus depletes neural progenitors in human cerebral organoids through activation of the innate immune receptor TLR3.</a> Cell Stem Cell. 19 (2), 258-265 (2016).</li>
<li>Tiwari, S. K., Wang, S., Smith, D., Carlin, A. F., Rana, T. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Revealing+tissue-specific+SARS-CoV-2+infection+and+host+responses+using+human+stem+cell-derived+lung+and+cerebral+organoids%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Revealing tissue-specific SARS-CoV-2 infection and host responses using human stem cell-derived lung and cerebral organoids.</a> Stem Cell Reports. 16 (3), 437-445 (2021).</li>
<li>Ao, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((One-stop+microfluidic+assembly+of+human+brain+organoids+to+model+prenatal+cannabis+exposure%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">One-stop microfluidic assembly of human brain organoids to model prenatal cannabis exposure.</a> Analytical Chemistry. 92 (6), 4630-4638 (2020).</li>
<li>Di Nardo, P., Parker, G. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stem+cell+standardization%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells+Development%22%5BJournal%5D)">Stem cell standardization.</a> Stem Cells Development. 20 (3), 375-377 (2011).</li>
<li>Jo, J., Xiao, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Midbrain+like+organoids+from+human+pluripotent+stem+cells+contain+functional+dopaminergic+and+neuro+melanin+producing+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Midbrain like organoids from human pluripotent stem cells contain functional dopaminergic and neuro melanin producing neurons.</a> Cell Stem Cell. 19 (2), 248-257 (2016).</li>
<li>Matsui, T. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Six-month+cultured+cerebral+organoids+from+human+ES+cells+contain+matured+neural+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience+Letters%22%5BJournal%5D)">Six-month cultured cerebral organoids from human ES cells contain matured neural cells.</a> Neuroscience Letters. 670, 75-82 (2018).</li>
<li>Trujillo, C. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Complex+oscillatory+waves+emerging+from+cortical+organoids+model+early+human+brain+network+development%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Complex oscillatory waves emerging from cortical organoids model early human brain network development.</a> Cell Stem Cell. 25 (4), 558-569 (2019).</li>
<li>Eremeev, A. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Necessity+Is+the+mother+of+invention%E2%80%9D+or+inexpensive%2C+reliable%2C+and+reproducible+protocol+for+generating+organoids%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry+%28Moscow%29%22%5BJournal%5D)">Necessity Is the mother of invention” or inexpensive, reliable, and reproducible protocol for generating organoids.</a> Biochemistry (Moscow). 84 (3), 321-328 (2019).</li>
<li>Qian, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+human+brain+region%E2%80%93specific+organoids+using+a+miniaturized+spinning+bioreactor%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Generation of human brain region–specific organoids using a miniaturized spinning bioreactor.</a> Nature Protocols. 13, 565-580 (2018).</li>
<li>Matsui, T. K., Tsuru, Y., Hasegawa, K., Kuwako, K. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vascularization+of+human+brain+organoids%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Vascularization of human brain organoids.</a> Stem Cells. 39 (8), 1017-1024 (2021).</li>
<li>Hall, G. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Patterned%2C+organoid-based+cartilaginous+implants+exhibit+zone+specific+functionality+forming+osteochondral-like+tissues+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Patterned, organoid-based cartilaginous implants exhibit zone specific functionality forming osteochondral-like tissues in vivo.</a> Biomaterials. 273, 120820(2021).</li>
<li>Zachos, N. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+enteroids%2Fcolonoids+and+intestinal+organoids+functionally+recapitulate+normal+intestinal+physiology+and+pathophysiology%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Human enteroids/colonoids and intestinal organoids functionally recapitulate normal intestinal physiology and pathophysiology.</a> Journal of Biological Chemistry. 291, 3759-3766 (2016).</li>
<li>Eremeev, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cerebral+organoids%E2%80%94challenges+to+establish+a+brain+prototype%5BTitle%5D)+AND+%22Cells%22%5BJournal%5D)">Cerebral organoids—challenges to establish a brain prototype.</a> Cells. 10 (7), 1790(2021).</li>
<li>Kadoshima, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Self-organization+of+axial+polarity%2C+inside-out+layer+pattern%2C+and+species-specific+progenitor+dynamics+in+human+ES+Cell-derived+neocortex%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+U.+S.+A%22%5BJournal%5D)">Self-organization of axial polarity, inside-out layer pattern, and species-specific progenitor dynamics in human ES Cell-derived neocortex.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences U. S. A. 110, 20284-20289 (2013).</li>
</ol>

Yazarların açıklayacak bir şeyi yok.

Açıklanan protokol, tek tip boyutta yüksek kaliteli organoidlerin üretilmesine izin vermek için iki önemli adıma sahiptir. İlk olarak, organoidler hücre sayısı ve hücre olgunluğunda neredeyse aynı olan küresellerden büyür. İkincisi, ev yapımı biyoreaktörler her organoide, organoidlerin kalabalıklaşmadığı veya birbirine yapışmadığı tek tip bir ortam sağlar.
Hücre kalitesi ve hücre olgunlaşmasının durumu protokolü gerçekleştirmek için gereklidir. Nöronal farklılaşmanın iPSC'lerin%75-90 birleştiğ...

İnsan iPSC türevi modeller nörogelişimsel ve nörodejeneratif bozuklukların çalışmalarında yaygın olarak kullanılmaktadır1. Son on yılda, beyin organoidleri olarak adlandırılan 3D beyin dokusu modelleri, esasen geleneksel 2D nöronal kültürleri tamamlamıştır2. Organoidler embriyonik beynin 3D mimarisini bir dereceye kadar yeniden kaplar ve daha hassas modellemeye izin verir. Farklı beyin bölgelerini temsil eden organoidlerin üretimi için birçok protokol yayınlanır: serebral korteks3,4,5, beyincik6, orta beyin, forebrain, hipotalamus 7,8,9ve hipokampus10. İnsan sinir sistemi hastalıklarını incelemek için organoid kullanmanın birden fazla örneği olmuştur11. Ayrıca, organoidler ilaç keşiflerinde uygulandı 12 ve SARS-Cov-213 ,14dahil olmak üzere bulaşıcı hastalıkların çalışmalarında kullanıldı.
Beyin organoidlerinin çapı birkaç milimetreye kadar ulaşabilir. Bu nedenle, organoidin iç bölgesi hipoksi veya yetersiz beslenmeden muzdarip olabilir ve sonunda nekrotik hale gelebilir. Bu nedenle, birçok protokol özel biyoreaktörler8, çalkalayıcılar veya mikroakışkan sistemler15içerir. Bu aygıtlar büyük hacimli pahalı hücre kültürü ortamı gerektirebilir. Ayrıca, bu tür ekipmanların maliyeti genellikle yüksektir. Bazı biyoreaktörler, yeniden kullanım için sterilize etmelerini zorlaştıran birçok mekanik parçadan oluşur.
Çoğu protokol "toplu etkiden"muzdariptir 16Özdeş iPSC'lerden elde edilen organoidler arasında önemli değişkenlik oluşturur. Bu değişkenlik, tekdüzelik gerektiren ilaç testlerini veya preklinik çalışmaları engeller. Tekdüze boyutta organoidleri seçecek kadar yüksek organoid verimi bu sorunu kısmen çözebilir.
Zaman faktörü de önemli bir sorundur. Matsui ve ark. (2018) beyin organoidlerinin olgunluğa ulaşmak için en az altı ay gerektirdiğini gösterdi17. Trujillo ve ark. (2019) ayrıca organoidlerde elektrofizyolojik aktivitenin sadece altı aylık ekimden sonra meydana geldiğini göstermiştir18. Uzun organoid olgunlaşma süresi nedeniyle, araştırmacılar genellikle bir öncekini tamamlamadan önce yeni bir farklılaşma başlatırlar. Birden fazla paralel farklılaşma süreci ek masraflar, ekipman ve laboratuvar alanı gerektirir.
Son zamanlarda esas olarak yukarıda belirtilen sorunları çözen bir mini biyoreaktör geliştirdik19. Bu ev yapımı biyoreaktör, merkezinde plastik bir düğme bulunan ultra düşük yapışma veya işlenmemiş Petri kabından oluşur. Bu plastik düğme, çalkalayıcının dönmesinden kaynaklanan Petri kabının merkezinde organoidlerin kalabalıklaşmasını ve tıkanmasını önler. Bu makale, bu ucuz ve basit ev yapımı mini biyoreaktörün büyük miktarlarda yüksek kaliteli beyin organoidleri üretmeye nasıl izin verdiğini açıklamaktadır.

<table><tbody><tr><td>Gelişmiş DMEM/F-12</td><td>Gibco</td><td>12634010</td><td>DMEM/F-12</td></tr><tr><td>AggreWell400</td><td>STEMCELL Technologies Inc</td><td>34425</td><td>Mikro kuyulu 24 oyuklu kültür plakası</td></tr><tr><td>B-27 Takviyesi</td><td>Gibco</td><td>17504044</td><td>Nöronal takviyesi B</td></tr><tr><td>GlutaMAX Takviyesi</td><td>Gibco</td><td>35050061</td><td>200 mM L-alanil-L-glutamin</td></tr><tr><td>İnsan BDNF</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-096-285</td><td></td></tr><tr><td>İnsan FGF-2</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-093-839</td><td></td></tr><tr><td>İnsan GDNF</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-096-290</td><td></td></tr><tr><td>KnockOut Serum Değiştirme</td><td>Gibco</td><td>10828028</td><td>Serum değiştirme</td></tr><tr><td>mTESR1</td><td>STEMCELL Technologies Inc</td><td>85850</td><td>Pliripotent kök hücre ortamı</td></tr><tr><td>N2 Takviyesi</td><td>Gibco</td><td></td><td></td>17502001</tr><tr><td>Nörobazal Ortam</td><td>Gibco</td><td>21103049</td><td>Nöronal hücre bakımı için bazal ortam</td></tr><tr><td>Penisilin-Streptomisin Çözeltisi</td><td>Gibco</td><td>15140130</td><td></td></tr><tr><td>Plasmocin</td><td>InvivoGen</td><td>ant-mpt-1</td><td>Antimikrobiyaller</td></tr><tr><td>Purmorfamin</td><td>EMD Millipore</td><td>540220</td><td></td></tr><tr><td>StemMACS Y27632</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-106-538</td><td>Y27632</td></tr><tr><td>StemMACS Dorsomorphin</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-104-466</td><td>Dorsomorfin</td></tr><tr><td>StemMACS LDN-193189</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-106-540</td><td>LDN-193189</td></tr><tr><td>StemMACS SB431542</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-106-543</td><td>SB431542</td></tr><tr><td>Tripan Mavi Çözelti</td><td>Gibco</td><td>15250061</td><td></td></tr><tr><td>Versen çözeltisi</td><td>Gibco</td><td>15040066</td> PBS ve beta; -merkaptoetanol Gibco 31350010 <td>içinde 0.48 mM EDTA</td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

ev yapımı mini biyoreaktörlerde İndüklenmiş pluripotent kök hücrelerden beyin organoidi Üretimi

Brain Organoid Generation from Induced Pluripotent Stem Cells in Home-Made Mini Bioreactors

iPSC türevi beyin organoidi, sinir sisteminin patolojilerini ve ilaç taramasını modellemek için umut verici bir teknolojidir. Bu teknoloji son zamanlarda ortaya çıktı. Henüz emekleme aşamasındadır ve henüz çözülmemiş bazı sınırlamaları vardır. Mevcut protokoller organoid elde etmenin ilaç keşfi ve preklinik çalışmalar için yeterince tutarlı olmasına izin vermemektedir. Organoidlerin olgunlaşması bir yıla kadar sürebilir ve araştırmacıları aynı anda birden fazla farklılaşma süreci başlatmaya itebilir. Laboratuvar için alan ve ekipman açısından ek maliyetler getirmektedir. Ek olarak, beyin organoidleri genellikle merkezde besin ve oksijen eksikliğinden muzdarip nekrotik bir bölgeye sahiptir. Bu nedenle, mevcut protokollerin çoğu beslenmeyi iyileştirmek için kültür ortamı için dolaşım sistemi kullanır.
Bu arada organoid yetiştiriciliği için ucuz dinamik sistemler veya biyoreaktörler yoktur. Bu makalede, kompakt ve ucuz ev yapımı mini biyoreaktörlerde beyin organoidleri üretmek için bir protokol açıklanmaktadır. Bu protokol, büyük miktarlarda yüksek kaliteli organoidlerin elde etmeyi sağlar.

Protokol şeması Şekil 1'de gösterilmiştir. Protokol, iPSC'lerin en az bir ay boyunca beyin organoidlerine farklılaştırılmış beş medyayı içeriyordu. Farklılaşma başladı, daha sonra iPSC'ler% 75-90 izdihama ulaştı (Şekil 2A, B). Nöronlara karşı farklılaşmanın ilk belirtileri, hücrelerin "rozetler" halinde kümelenmeye başladığı orta A'da iPSC ekiminin 10-11 günlerinde gözlenmiştir (Şekil 2C). 14-15. günlerde, iPSC'ler ...

Burada, insan kaynaklı pluripotent kök hücrelerden (iPSC' ler) beyin organoidleri üretmek için bir protokol açıklıyoruz. Beyin organoidlerini büyük miktarlarda ve yüksek kalitede elde etmek için ev yapımı mini biyoreaktörler kullanıyoruz.

Ev Yapımı Mini Biyoreaktörlerde İndüklenmiş Pluripotent Kök Hücrelerden Beyin Organoidi Üretimi

The iPSC-derived brain organoid is a promising technology for in vitro modeling the pathologies of the nervous system and drug screening. This technology ...

Bugüne kadar pluripotent kök hücrelerden farklılaştırılmış serebral organoidler, yerli insan beyin dokusuna en yakın vitro 3D modeldir. Ek olarak, serebral organoidler çeşitli merkezi sinir sistemi patolojilerini modellemek, farmakolojik olarak aktif maddeleri test etmek ve ayrıca rejeneratif tıpta kullanılmak üzere eşit derecede uygundur. Bu arada, bu teknoloji hala gelişimin ilk aşamasındadır.Protokol, agrega elde etme yöntemine ve farklılaşma ile daha fazla ekime bağlı olarak iki gruba ayrılabilir. Birincisi, ekim süresinde farklı olan protokol ve farklılaşma şemalarını ve piyasa tüpleri veya plakaları gibi özel düşük yapışma cihazlarında çalkalayıcıda organoidin daha sonra olgunlaşmasıyla farklılaşma indükleyicilerini içerir. Başka bir grup özel bir biyoreaktör kullanmayı içerir.Çeşitli protokollerin analizi, organoidlerin dolaşımdaki besin ortamı ile koşullar altında yetiştirilmesi gerektiğini göstermiştir. Bununla birlikte, standart bir boyuta ve morfolojiye sahip organoid elde etmek için basit ve ucuz sistemlerin bulunmaması, işlemi ölçeklendirme için bu tür cihazların geliştirilmesini gerektirir. Bu çalışmada, büyük miktarlarda yüksek kaliteli organoid elde etmeyi mümkün kılan basit ve ucuz mini biyoreaktörleri elde etme ve test etme yöntemimizi açıklıyoruz.Steril 15 mililitre santrifüj tüplerini 7 veya 8 milimetre yüksekliğinde halkalara kesin. Halkaları otoklavla. Tedavi edilen veya mikrobiyolojik Petri kaplarındaki düşük toplamaları kırıntılara ayırın.Sıvı bir plastik hazırlamak için yaklaşık 1 gram plastik kırıntıyı bir gecede 10 mililitre kloroformda çözün. Steril ultra düşük yapışma 6 santimetre Petri kabının ortasına plastik bir düğme yapın. Eşit derecede uygun iki yol vardır.birincisi, otoklavı bir merkeze plastik bir halkaya koyun ve halkanın içine yarım mililitre sıvı plastik uygulayın. İkincisi, herhangi bir plastik halka olmadan Petri kabının ortasına yarım mililitre sıvı plastik bırakın. Bulaşıkları laminer akış davlumbazında tam kuruluk olana kadar 2 veya 3 saat açık bırakın.Pluripotent kök hücreler için ortamda indüklenmiş pluripotent kök hücreler, 35 milimetre Petri kaplarında% 75 veya% 90'a kadar izdiham, soğuk Dulbecco Modifiye Kartal Ortası'nda çözünmüş bir matris ve Fisher-12 ortamı ile önceden kaplanmış. Orta A artı serum replasmanı hazırlayın. Serum replasmanı ile indüklenmiş pluripotent kök hücreleri ortamda 1 gün boyunca yetiştirin.Pluripotent kök hücreler için ortamı, farklılaşmanın sıfır gününde serum replasman ortamına değiştirin. Orta A'yı hazırlayın.Farklılaşmanın 2. Hücreleri 2 hafta boyunca orta A'da yetiştirin, Petri yemeklerinde her 2 günde bir ferahlatıcı ortam.14. günde, her kuyuda yaklaşık 1.200 mikrowell içeren özel bir 24 kuyu kültür plakası kullanarak küresel oluşumuna başlayın. Mikrowells ile 24 kuyulu bir kültür plakası hazırlayın. Her kuyuya 1 mililitre orta A ekleyin, plaka tutucu ile donatılmış bir sallanan kova rotorunda 5 dakika boyunca 1, 300g'de kısa bir süre santrifüj ekleyin.Mikroskop altında mikrowelllerde kabarcık olmadığını kontrol edin. Orta B'yi hazırlayın.Ortamı Petri kabından çıkarın. Hücre müfrezesi için, PBS'de hazırlanan 1,5 mililitre EDTA çözeltisi ile hücreleri tedavi edin.Mikroskop altında hücre müfrezesini kontrol edin. Hücreyi 15 mililitrelik tüpe topla. Tüpe hücrelere doğru 5 mililitre karışık Dulbecco ve Fisher ortamı ekleyin.5 dakika boyunca 200g'de santrifüj. Süpernatant çıkarın ve 2 mililitre orta B hücreli hücreleri yeniden askıya alın.1 milyar hücre içeren hücre süspansiyonu mikrowells ile 24 kuyulu bir plakanın her kuyusuna aktarın. Birkaç kez aşağı yukarı yavaşça pipet hücreleri ve mikroüllerde hücre yakalamak için 1 dakika boyunca kısaca 100g santrifüj.Mikroskop altında hücrenin mikroüllerde eşit olarak dağıtıldığını kontrol edin. Sferoidlerde hücre toplama için plakayı bir gecede kuluçkaya yatırın. Ertesi sabah, 15.Küreselleri her kuyudan 15 mililitrelik bir tüpe dikkatlice toplayın, küreselleri yerçekimi ile 2 ve 3 dakika çökeltmeye bırakın ve ardından süpernatantı çıkarın. Sferoidlere matrisin 2 mililitresini ekleyin, buz üzerinde çözünür ve eski tempore. Pipetleme ile hafifçe karıştırın ve oda sıcaklığında 30 dakika kuluçkaya yatırın.Matrisin fazlalığını yıkamak için, tüpe 8 mililitre orta B.Pipet ekleyin, ardından tüpü 100g'da 1 dakika santrifüjleyin. Üsttekini çıkarın. Tüpe 20 mililitre orta B ekleyin, pipet hafifçe, sonra küresel süspansiyonu mini biyoreaktörler arasında bölün.Daha sonra mini biyoreaktörleri suyun buharlaşmasını ve kirlenmeyi önleyen 15 santimetrelik bir Petri kabına yerleştirin. Petri kabını mini biyoreaktörlerle yörüngesel bir çalkalayıcıya koyun. Organoidleri 70, 75rpm dönme hızında yetiştirin.16. günde, orta C.Transfer organoidi 50 mililitre tüpe hazırlayın. 5 dakika boyunca, dibe düşmelerine izin verin. Süpernatantı aspire edin ve 5 mililitre orta C ekleyin.Mini biyoreaktörlerdeki organoidlere tekrar katıl.Sferoidleri 2 hafta boyunca orta C'de yetiştirin ve ortamı her 2 günde bir yenileyin. Bu 2 hafta boyunca, aşağıdaki ekim için mini biyoreaktör başına yaklaşık 100 küresel seçin. 30. günde, orta D.Ekimi bir olgunlaşma ortamı olan orta D'ye değiştirin.3 hafta boyunca her 2 veya 3 günde bir ekim ortamını yenileyin. Daha sonra F ve GDNF'de çözünmüş orta D'yi kullanın. Orta A ve B'de 1 ay ardışık ekimden sonra, boyut ve morfolojide standartlaştırılmış organoidler elde edilir.Büyüdükçe, ortamı daha sık değiştirmeleri gerekir, haftada 4 defaya kadar da artar. 2 aylık ekimden sonra çapları 4 ve 5 milimetreye ulaşır. Ve bir ay sonra, 5 ve 6 milimetre ve büyüme durur.Şekil organoid enzimin görünümünü, hematoksilin ve eozin ile boyanmış net bölümleri göstermektedir. 1 ay boyunca yapılan immünohistokimyasal analiz, merkezi kısım dahil olmak üzere SOX2 pozitif progenitör hücre kümelerinin varlığını göstermektedir. Organoidlerin periferinde glial fibriliner asidik protein, mikrotübül ilişkili protein 2 ve tiyazine hidrolaz pozitiftir.Hücreler konsantre edilir, bu da olgun nöron formuna karşılık gelir. Bazı durumlarda, orta kısımda nekrotik alan üzerinde beyaz kümeler oluşur. Bu, daha büyük organoidler elde etmek için bu protokolün sınırlandırılmasını gösterir.Büyük olasılıkla, büyümenin sınırlayıcı faktörü besin ve oksijenin difüzyon oranıdır. Çeşitli ortam ve hücre tipi sferoidler ve sistemimizi bazı organoid türleri için test etmek. Çok sayıda beyin ve retina, karaciğer karsinom hücrelerinden ve mezenkimal kök hücrelerden kombine organoidler, capital blast mezenkimal kök çağrılarından kombine organoidler ve hematopoetik kök hücrelerin indüklenmiş pluripotent kök hücrelerden ve bağırsak organoidlerinden farklılaşması.Hücrelerin ilk bileşiminde değişken miydi? Farklılaşma faktörleri, kültür ve orta, hücre dışı matris ve muhtemelen gaz karışımı bileşimi, platform dönüş hızı ve diğer parametreler. Çeşitli organ ve dokularda aynı şekil, boyut veya morfoloji modeline sahip organoid elde etmek mümkün olacaktır.Bu çalışmada önerilen mini biyoreaktörlerin kullanımı.

brain-organoid-generation-from-induced-pluripotent-stem-cells-home

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Gelişim Biyolojisi

Video, indüklenmiş pluripotent kök hücrelerden insan beyni organoidleri üretmek için bir yöntemi göstermektedir. Nörosferin, diğer mikrop tabakalarının oluşumunu baskılayan bir nöroektodermal tabaka oluşturduğunu gösterir. Nöroküreler bir 3D jel matrisine gömülüdür ve nöroepitelyal tomurcuklar oluşturur. Organoid medya ile inkübe edildiğinde, bu nöroepitelyal tomurcuklar belirli beyin bölgelerine farklılaşır ve bu da olgun beyin organoidlerinin oluşumuna neden olur.

İnsan Beyni Organoidlerini Oluşturmak için İn Vitro Bir Yöntem

Bu video, indüklenmiş pluripotent kök hücrelerden (iPSC'ler) serebral organoidler üretmek için bir testi göstermektedir. İnsan iPSC'leri embriyoid cisimler (EB'ler) oluşturmak için indüklenir. EB'ler, bir indüksiyon ortamı kullanılarak bir polimer iskele üzerinde kültürlenir ve nöral kök hücrelere, progenitör hücrelere ve olgunlaşmamış nöronlara farklılaşmayı teşvik eder. Son olarak, EB'ler bir matrise gömülür ve serebral organoid oluşumu için bir bakım ortamına aktarılır.

İndüklenmiş Pluripotent Kök Hücre Kaynaklı Serebral Organoidlerin Üretilmesi

Bu video, tek kullanımlık bir 3D biyoreaktör kullanarak indüklenmiş pluripotent kök hücrelerden (iPSC'ler) olgun serebellar organoidler üretme tekniğini göstermektedir. Biyoreaktör, daha sonra iPSC agregatlarının olgun serebellar organoidlere farklılaşmasını indükleyen büyüme faktörleri ve kemokinler açısından zenginleştirilmiş bir dizi kültür ortamı ile muameleye tabi tutulan iPSC agregat oluşumunu kolaylaştırır. Daha sonra, organoidler hasat edilir ve daha fazla analiz için dondurularak...

Tek Kullanımlık Biyoreaktörler Kullanılarak İndüklenmiş Pluripotent Kök Hücrelerden Olgun Serebellar Organoidlerin Üretilmesi

Serebral organoids erken insan beyni geliştirme vitroaraştırmak için yeni bir modeli sistemi temsil eder. Bu makale verimli bir şekilde homojen dorsal ön-tipi organoids İnsan İndüklenmiş pluripotent kök hücre de dahil olmak üzere kritik karakterizasyonu ve doğrulama adımları oluşturmak için ayrıntılı yöntembilim sağlar.

Standart ve tekrarlanabilir ön türü beyin Organoids insan nesil Pluripotent kök hücreler indüklenen

Bu protokol, beyin hücresi tiplerinin çeşitliliğini ve hücresel organizasyonun birçok özelliğini korurken, dışsal büyüme faktörleri veya bazal membran matrisi olmadan basitleştirilmiş, düşük maliyetli bir şekilde beyin organoidleri üretmek için bir araç olarak oluşturulmuştur.

İnsan Embriyonik Kök Hücrelerinden Beyin Organoidleri Üretmek için Statik Kendi Kendini Yöneten Bir Yöntem

Bu protokol, insan pluripotent kök hücrelerinin kontrollü boyut agregaları üretmek ve daha da kimyasal olarak tanımlanmış ve besleyici içermeyen koşullar altında serebellar organoidlerde farklılaşma uyarmak için dinamik bir kültür sistemi açıklar tek kullanımlık biyoreaktör kullanarak.

İnsan Pluripotent Kök Hücrelerinden Olgun Serebellar Organoidlerin Ölçeklenebilir Üretimi ve İmmünboyama ile Karakterizasyonu

Bu protokol, insan pluripotent hücrelerinin bağırsak organoidlerine farklılaşmasına izin verir. Protokol, hücreleri kesin endoderm, arka bağırsak endodermi ve ardından bağırsak epiteli popülasyonuna farklılaştırarak normal insan gelişimini taklit eder. Bu, protokolü hem bağırsak gelişimini hem de hastalık modelleme uygulamalarını incelemek için uygun hale getirir.

Gelişimsel ve Hastalık Modelleme Uygulamaları için hiPSC Kaynaklı Bağırsak Organoidlerinin Üretilmesi

2D ve 3D insan kaynaklı pluripotent kök hücre (hIPSC) tabanlı neokortik gelişim modellerinin üretimi ve karakterizasyonu için ayrıntılı protokollerin yanı sıra primer selyyum (PC) biyogenez ve fonksiyonunun nitel ve nicel analizini sağlayan tamamlayıcı metodolojiler sunuyoruz.

Neokortik Gelişim Sırasında Primer Seyum Tutulumını Diseksiyona Yönelik 2D ve 3D İnsan Kaynaklı Pluripotent Kök Hücre Bazlı Modeller

Burada, insan pluripotent kök hücre kaynaklı ince bağırsak ve kolonik organoidlerin üretilmesi, sürdürülmesi ve karakterize edilmesi için ayrıntılı yöntemler açıklanmaktadır. Bu yöntemler, tekrarlanabilirliği artırmak, ölçeklenebilirliği genişletmek ve organoidlerin kaplanması ve geçirilmesi için gereken çalışma süresini azaltmak için tasarlanmıştır.

İnsan Pluripotent Kök Hücre Kaynaklı Bağırsak ve Kolonik Organoidlerin Üretimi, Bakımı ve Karakterizasyonu

Burada, insan pluripotent kök hücrelerini kendi kendine örgütlenerek verimli bir şekilde kullanarak gelişimsel olarak ilgili insan kalbi organoidleri (hSO'lar) oluşturmak için bir protokol açıklıyoruz. Protokol, gelişimsel ipuçlarının sıralı aktivasyonuna dayanır ve son derece karmaşık, işlevsel olarak ilgili insan kalp dokuları üretir.

Pluripotent Kök Hücrelerden Elde Edilen Kendi Kendine Monte Edilen İnsan Kalbi Organoidlerinin Üretilmesi

Bu protokol, insan pluripotent kök hücrelerini kullanarak vasküler organoidler oluşturmak için bir yöntem sunar.

İnsan Kaynaklı Pluripotent Kök Hücrelerden Vasküler Organoid Üretimi

Öğrenin, ev yapımı mini biyoreaktörler kullanarak insan indüklenmiş pluripotent kök hücrelerinden beyin organoidi üretme yöntemini. Bu protokol, merkezi sinir sistemi patolojilerini modellemek için yüksek kaliteli 3D doku oluşturur.

Ev Yapımı Mini Biyoreaktörlerde İndüklenmiş Pluripotent Kök Hücrelerden Beyin Organoidi Üretimi

Daha fazla video keşfet