Name: Anopheles gambiae Sivrisineklerinden Larva Tükürük Bezlerinin Diseksiyonu ve İmmünasyon (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-09-30T14:45:00.000+00:00
Duration: 6 min 12 s
Description: Öğrenin Anopheles gambiae larva tükürük bezlerinin diseksiyonu ve immünostaining tekniklerini. Bu yöntem, sivrisinek biyolojisini ve hastalık iletim mekanizmalarını anlamak için araştırmacılara güvenilir bir araç sunar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Johns Hopkins Sıtma Araştırma Enstitüsü'ne An. gambiae larvalarına erişip yetiştirdiği için teşekkür ederiz.

1. Çözümlerin ve araçların hazırlanması
<ol><li>Diseksiyon çözeltisinin hazırlanması<ol>
<li>Diseksiyon çözeltisi hazırlamak için, 15 plastik bir tüpte 7,5 mL damıtılmış H2O'ya% 100 etanol 2,5 mL ekleyin. Karıştırmak için tüpü 3 kez ters çevirin. NOT: Bu çözelti birkaç hafta boyunca oda sıcaklığında saklanabilir.</li>
	</ol>
</li>
	<li>10x fosfat tamponlu salin (PBS) stoğunun hazırlanması<ol>
<li>10x PBS stoğu hazırlamak için 17,8 g Na2HPO4• 2H2O, 2,4 g KH2PO4, 80 g NaCl ve 2 g KCl ila 800 mL deiyonize su ekleyin. Katı maddeler tamamen çözünene kadar bir karıştırma plakası üzerinde bir karıştırma çubuğu ile karıştırın. Arıtılmış su ile son ses seviyesini 1 L'ye ayarlayın. NOT: Bu çözelti birkaç ay boyunca oda sıcaklığında saklanabilir.</li>
	</ol>
</li>
	<li>1x PBS hazırlanması<ol>
<li>Steril bir cam şişeye 90 mL H2O'ya 10 mL 10x PBS ekleyin. Kapağı sıkıca kapatın ve karıştırmak için 3x ters çevirin. NOT: Çözelti birkaç hafta boyunca 4 °C'de saklanabilir.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Fiksatif hazırlanması.<ol>
<li>200 μL buzul asetik aside 600 μL metanol ekleyin. Çözümü her seferinde taze yapın.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Macun plakasının yapımı (silikon kauçukla dolu bir doku kültürü yemeği)<ol>
<li>Epoksi (1 g) ve su (50 mL) bileşenlerini (1:50) karıştırın ve karışımı bir Petri kabına dökün. Kullanmadan önce bileşenlerin kurumasını bekleyin. NOT: Bir kez inşa edildikten sonra, macun plakası yıllarca kullanılabilir.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. Bez diseksiyonu (Şekil 1A)
<ol><li>Geç aşama L4 larvalarını toplayın (~ 10 gün sonra kapak; Şekil 2) plastik transfer pipet kullanarak besleme tepsilerinden. NOT: Standart sivrisinek hayvancılığı ve larva kültürü için bu yararlı çevrimiçi kılavuza bakın13.<ol>
<li>Bir parçalama mikroskobu aşamasına bir macun plakası yerleştirin ve larvaları macun plakasına aktarın. NOT: larvaları ilk diseksiyon için aliquoting yaparken, plastik bir transfer pipet kullanarak bir kerede slayta ~10 larva transfer etmek yararlıdır.</li>
	</ol>
</li>
	<li>10 larvadan ayrı olarak macun plakasına bir damla diseksiyon çözeltisi(1:3EtOH:H 2 O) yerleştirin.</li>
	<li>% 25 EtOH damlasına bir L4 larva yerleştirmek için plastik transfer pipet veya tek kullanımlık cam pipet kullanın.</li>
	<li>Her elde bir tane olan kümesleri (#5) alın ve baskın olmayan el ile larva başını tutun. Baskın eli kullanarak, larvayı başın hemen altındaki kümeslerle kavrayın ve başın vücudun geri kalanından kopmasını ve bezlerin kafaya bağlı kalmasını sağlamak için minimum sabit kuvvetle hafifçe çekin. Larva karkasının vücut kısmını atın. NOT: Parçalara ayırırken, larva leşlerini toplamak için yakınlarda bir kağıt havlu ayarlayın.</li>
	<li>Kafa/bezleri 1,5 mL mikrosantrifüj tüpünde 1 mL 1x PBS'de toplayın. Bağlı kafalarıyla ~40 parçalanmış bez için 1 mL PBS kullanın. Kafaların/SG'lerin arabelleğin altına batmasını bekleyin.</li>
</ol>3. Antikor boyama için fiksasyon (Şekil 1B)
<ol><li>Mikrosantrifüj tüpünün tepesinden başlayarak PBS'yi bir cam transfer pipeti kullanarak boşaltın, yapışkan sivrisinek dokularından kaçının ve dokulara zarar vermeden PBS çözeltisinin mümkün olduğunca çoğunu çıkarın. Çözeltiyi 800 μL'lik 3:1 metanol karışımı ile buzul asetik aside değiştirin. Tüpü gece boyunca 4 °C'ye yerleştirin (12-24 saat önerilir; 19 saat tercih edilir).</li>
	<li>Ertesi gün çözeltiyi boşaltın ve 1 mL soğuk% 100 aseton ile değiştirin. 90'lara bırak.</li>
	<li>Asetonu çıkarın ve dokuları her seferinde 1 mL 1x PBS ile üç kez hafifçe durulayın. NOT: Numuneler akışla birlikte yavaşça yüzdürülmeli, ardından her PBS ilavesi tamamlandığında tüpün altına geri düşmelidir.</li>
</ol>4. İmmünasyon (Şekil 1B)
<ol><li>Toplam 1x PBS hacminin 200 μL'sinde uygun seyreltmede (1:100) birincil antikoru (örneğin Rab11) ekleyin. Boru içeriğini bir pipet ucuyla hafifçe döndürün. 4 °C'de gece boyunca kuluçkaya yaslanın.</li>
	<li>Birincil antikor çözeltisini çıkarın ve 1 mL 1x PBS ile üç kez yıkayın (çözeltiyi pipet içine ve dışına hafifçe pipetleme).</li>
	<li>Toplam hacmin 200 μL'sinde uygun seyreltmede (1:200) ikincil antikor (Alex Fluor 488 Goat anti-Rabbit) ekleyin. Boru içeriğini bir pipet ucuyla hafifçe döndürün. Oda sıcaklığında 90 dakika kuluçkaya yatır.</li>
	<li>Bu aşamada 200 μL PBS'ye Nil Kırmızısı (lipitler, 5 μL 1 μg/μL) ve/veya Hoechst (DNA, 3 μL 1 μg/μL) gibi boyalar ekleyin. Oda sıcaklığında 60 dakika daha kuluçkaya yatır. 1x PBS ile üç kez hafifçe yıkayın.</li>
</ol>5. Mikroskopi için lekeli bezlerin montajı (Şekil 1C)
<ol><li>Pipet 200 μL% 100 gliserol bir mikroskop slayt üzerine. NOT: Gliserol viskoz olduğundan, pipet ucunu uygun hacme ulaşana kadar sıvının içinde bırakın. %100 gliseol içine inildiğinde doku küçülmesi gözlenmedi. Bununla birlikte, araştırmacılar örnekleri% 100 gliserol içine taşımadan önce tüplerde% 30 ve% 50 gliserol yıkamalarından geçebilirler.</li>
	<li>Lekeli kafaları (slayt başına 20'ye kadar) ekli bezlerle (diğer iç yapılarla birlikte) yumuşak bir fırça kullanarak mikroskop kaydırağı(Şekil 3A) aktarın. Numuneleri cam slayt boyunca eşit olarak dağıtılacak şekilde yayın. NOT: Bezleri fırçayla bir kapak kaydırağında biriktirirken, SG'leri hafifçe yönlendirmek için tokmaklar kullanılabilir, böylece hepsi aynı yöne yönlendirilir.</li>
	<li>Bir diseksiyon mikroskobu altında görüntüleme, larva başını iki çift kümes gücü kullanarak bezlerden ayırın ve iki dokuyu dikkatlice zıt yönlere çekin. NOT: SG'leri tamamen izole etmek zor olduğundan, SG'leri ve ilgili iç yapıları bırakarak kafaları çıkarmanız yeterlidir. SG'ler diğer dokularla ilişkili kalsalar bile, Hoechst ve diğer belirteçlerle lekelendiğinde kolayca tanınırlar (Şekil 3B,C).</li>
	<li>Kafaları çıkarın ve atın ve her SG için ayırma işlemini tekrarlayın. NOT: Kafaları çıkarırken, toplamak için yakınlarda bir kağıt havlu ayarlayın.</li>
	<li>Üzerine 1,5 mm kalınlığında bir kapak kılıfı hafifçe yerleştirin (hava kabarcıklarından kaçının) ve şeffaf oje ile kapatın.</li>
	<li>4 °C'de ışık geçirmez bir kapta saklayın. NOT: Boyalı bezlerin hazırlanan slaytları, kalitede önemli bir değişiklik olmadan altı aydan bir yıla kadar karanlıkta 4 °C'de tutulabilir. Aylar geçerken gliserol sızmaya başlarsa, delikleri doldurmak için kapak kapağını ve pipeti daha gliserol içinde hafifçe kaldırın.</li>
</ol>

<ol><li>World malaria report 2020: 20 years of global progress and challenges. World Health Organization. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://apps.who.int/iris/handle/10665/337660">https://apps.who.int/iris/handle/10665/337660</a> (2020).</li>
<li>Feachem, R. G. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Malaria+eradication+within+a+generation%3A+ambitious%2C+achievable%2C+and+necessary%5BTitle%5D)+AND+%22Lancet%22%5BJournal%5D)">Malaria eradication within a generation: ambitious, achievable, and necessary.</a> Lancet. 394 (10203), 1056-1112 (2019).</li>
<li>Adolfi, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+population+modification+gene-drive+rescue+system+in+the+malaria+mosquito+Anopheles+stephensi%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Efficient population modification gene-drive rescue system in the malaria mosquito Anopheles stephensi.</a> Nature Communications. 11, 5553(2020).</li>
<li>Kyrou, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+CRISPR-Cas9+gene+drive+targeting+doublesex+causes+complete+population+suppression+in+caged+Anopheles+gambiae+mosquitoes%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">A CRISPR-Cas9 gene drive targeting doublesex causes complete population suppression in caged Anopheles gambiae mosquitoes.</a> Nature Biotechnology. 36 (11), 1062-1066 (2018).</li>
<li>Rostami, M. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CRISPR%2FCas9+gene+drive+technology+to+control+transmission+of+vector-borne+parasitic+infections%5BTitle%5D)+AND+%22Parasite+Immunology%22%5BJournal%5D)">CRISPR/Cas9 gene drive technology to control transmission of vector-borne parasitic infections.</a> Parasite Immunology. 42 (9), 12762(2020).</li>
<li>Bhatt, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Coverage+and+system+efficiencies+of+insecticide-treated+nets+in+Africa+from+2000+to+2017%5BTitle%5D)+AND+%22Elife%22%5BJournal%5D)">Coverage and system efficiencies of insecticide-treated nets in Africa from 2000 to 2017.</a> Elife. 4, 09672(2015).</li>
<li>Mellink, J. J., Vanden Bovenkamp, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+aspects+of+mosquito+salivation+in+blood+feeding+of+Aedes+aegypti%5BTitle%5D)+AND+%22Mosquito+News%22%5BJournal%5D)">Functional aspects of mosquito salivation in blood feeding of Aedes aegypti.</a> Mosquito News. 41 (1), 115(1981).</li>
<li>Ribeiro, J. M., Rossignol, P. A., Spielman, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+mosquito+saliva+in+blood+vessel+location%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Experimental+Biology%22%5BJournal%5D)">Role of mosquito saliva in blood vessel location.</a> Journal of Experimental Biology. 108, 1-7 (1984).</li>
<li>Yamamoto, D. S., Sumitani, M., Kasashima, K., Sezutsu, H., Matsuoka, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhibition+of+malaria+infection+in+transgenic+Anopheline+mosquitoes+lacking+salivary+gland+cells%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Pathogens%22%5BJournal%5D)">Inhibition of malaria infection in transgenic Anopheline mosquitoes lacking salivary gland cells.</a> PLoS Pathogens. 12 (9), 1005872(2016).</li>
<li>Rishikesh, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Morphology+and+development+of+the+salivary+glands+and+their+chromosomes+in+the+larvae+of+Anopheles+stephensi+sensu+stricto%5BTitle%5D)+AND+%22Bulletin+of+the+World+Health+Organization%22%5BJournal%5D)">Morphology and development of the salivary glands and their chromosomes in the larvae of Anopheles stephensi sensu stricto.</a> Bulletin of the World Health Organization. 20 (1), 47-61 (1959).</li>
<li>Jensen, D. V., Jones, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+development+of+the+salivary+glands+in+Anopheles+albimanus+Wiedemann+%28Diptera%2C+Culicidae%29%5BTitle%5D)+AND+%22Annals+of+the+Entomological+Society+of+America%22%5BJournal%5D)">The development of the salivary glands in Anopheles albimanus Wiedemann (Diptera, Culicidae).</a> Annals of the Entomological Society of America. 50 (5), 40824(1957).</li>
<li>Chiu, M., Trigg, B., Taracena, M., Wells, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diverse+cellular+morphologies+during+lumen+maturation+in+Anopheles+gambiae+larval+salivary+glands%5BTitle%5D)+AND+%22Insect+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Diverse cellular morphologies during lumen maturation in Anopheles gambiae larval salivary glands.</a> Insect Molecular Biology. 30 (2), 210-230 (2021).</li>
<li>Benedict, M. Q. MR4. Methods in Anopheles research. Center for Disease Control. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://www.beiresources.org/Portals/2/ VectorResources/2016%20Methods%20in%20Anopheles%20Research%20full%20manual.pdf">https://www.beiresources.org/Portals/2/ VectorResources/2016%20Methods%20in%20Anopheles%20Research%20full%20manual.pdf</a> (2015).</li>
<li>Wells, M. B., Andrew, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Salivary+gland+cellular+architecture+in+the+Asian+malaria+vector+mosquito+Anopheles+stephensi%5BTitle%5D)+AND+%22Parasites+%26+Vectors%22%5BJournal%5D)">Salivary gland cellular architecture in the Asian malaria vector mosquito Anopheles stephensi.</a> Parasites & Vectors. 8, 617(2015).</li>
<li>Wells, M. B., Villamor, J., Andrew, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Salivary+gland+maturation+and+duct+formation+in+the+African+malaria+mosquito+Anopheles+gambiae%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Salivary gland maturation and duct formation in the African malaria mosquito Anopheles gambiae.</a> Scientific Reports. 7 (1), 601(2017).</li>
<li>Wells, M. B., Andrew, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Anopheles+salivary+gland+architecture+shapes+plasmodium+sporozoite+availability+for+transmission%5BTitle%5D)+AND+%22mBio%22%5BJournal%5D)">Anopheles salivary gland architecture shapes plasmodium sporozoite availability for transmission.</a> mBio. 10 (4), 01238(2019).</li>
<li>Clements, A. N. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aClements%2C+AN+%22The+physiology+of+mosquitoes%22">The physiology of mosquitoes</a>. , Pergamon Press. Paris. (1963).</li>
<li>Imms, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((On+the+larval+and+pupal+stages+of+Anopheles+maculipennis%2C+meigen%5BTitle%5D)+AND+%22Parasitology%22%5BJournal%5D)">On the larval and pupal stages of Anopheles maculipennis, meigen.</a> Parasitology. 1 (2), 103-133 (1908).</li>
<li>Favia, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bacteria+of+the+genus+Asaia+stably+associate+with+Anopheles+stephensi%2C+an+Asian+malarial+mosquito+vector%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Bacteria of the genus Asaia stably associate with Anopheles stephensi, an Asian malarial mosquito vector.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104 (21), 9047-9051 (2007).</li>
<li>Neira Oviedo, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+salivary+transcriptome+of+Anopheles+gambiae+%28Diptera%3A+Culicidae%29+larvae%3A+A+microarray-based+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Insect+Biochemistry+and+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">The salivary transcriptome of Anopheles gambiae (Diptera: Culicidae) larvae: A microarray-based analysis.</a> Insect Biochemistry and Molecular Biology. 39 (5-6), 382-394 (2009).</li>
<li>Linser, P. J., Smith, K. E., Seron, T. J., Neira Oviedo, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Carbonic+anhydrases+and+anion+transport+in+mosquito+midgut+pH+regulation%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Experimental+Biology%22%5BJournal%5D)">Carbonic anhydrases and anion transport in mosquito midgut pH regulation.</a> Journal of Experimental Biology. 212 (11), 1662-1671 (2009).</li>
<li>Linser, P. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Slc4-like+anion+transporters+of+the+larval+mosquito+alimentary+canal%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Insect+Physiology%22%5BJournal%5D)">Slc4-like anion transporters of the larval mosquito alimentary canal.</a> Journal of Insect Physiology. 58 (4), 551-562 (2012).</li>
</ol>

Yazarların açıklayacak çıkar çatışmaları yoktur.

Burada açıklanan protokol bir Drosophila SG diseksiyon protokolünden ve yetişkin sivrisinek diseksiyon protokolü14 , 15,16'dan uyarlanmıştır. Bununla birlikte, çoğu belirteç yetişkin diseksiyonu ve SG boyama yöntemlerini kullanırken bodrum zarını (gösterilmeyen veriler) nüfuz etmedi. Yetişkin protokolünün uyarlamaları arasında bezlerin% 25 EtOH çözeltisinde parçalanması, bezlerin MeOH ve buzul asetik asit kombinasyonu ile yıkanm...

Sıtma, 2019'da yaklaşık 230 milyon enfeksiyona ve tahmini 409.000 ölüme neden olan büyük bir halk sağlığıtehdididir 1. Ölümlerin çoğunluğu Sahra altı Afrika'dadır ve parazit Plasmodium falciparumböcek vektörü Anopheles gambiae, bu video gösterisinin konusudur. Rakamlar yüzyılın başlarından bu yana yıllık ölüm oranında önemli bir düşüşe işaret etse de (>300.000 daha az yıllık ölüm), 2000'den 2015'e kadar gözlenen hastalık oranlarındaki umut verici düşüşler sivriliyor ve bu da hastalık bulaşmasını sınırlamak için yeni yaklaşımlara ihtiyaç olduğunu gösteriyor2. Sıtmayı kontrol etmek ve muhtemelen ortadan kaldırmak için umut verici ek stratejiler arasında CRISPR / Cas9 tabanlı gen düzenleme ve gentahriki 3,4,5kullanarak sivrisinek vektör kapasitesini hedeflemektir. Gerçekten de, hastalık bulaşmasını azaltmada en büyük etkiye sahip olan sivrisinek vektörün (uzun ömürlü insektisitle tedavi edilen yatak ağlarının genişletilmiş kullanımı yoluyla) hedeflenilmesidir6.
Dişi sivrisinekler, bir kan unu sırasında enfekte bir insandan Plasmodium gametositleri alır. Döllenme, olgunlaşma, midgut epitel geçişi, nüfus genişlemesi ve zorunlu sivrisinek konaklarında hemokoel navigasyonun ardından, yüz ila on binlerce Plasmodium sporozoit sivrisinek SG'lerini istila eder ve kurucu salgı hücrelerinin salgı boşluklarını doldurur. Salgı boşluklarının içine girdikten sonra, parazitler tükürük kanalına doğrudan erişebilir ve böylece bir sonraki kan yemeğinde yeni bir omurgalı konakçuya iletilmeye hazırdır. Çünkü SG'ler sıtmaya neden olan sporozoitlerin insan konakçılarına iletilmesi için kritik öneme sahiptir ve laboratuvar çalışmaları SG'lerin kan besleme, sivrisinek hayatta kalma veya doğurganlık 7 ,8,9için gerekli olmadığını göstermektedir, bulaşmayı engelleyen önlemler için ideal bir hedefi temsil ederler. Yetişkin sivrisinek SG'leri, erken pupal SG histolysis10'unötesinde devam eden larva SG'lerinde "kanal tomurcuk" kalıntılarının detaylandırılması olarak oluşur Larva SG'yi yetişkin evresi hastalık bulaşmasını sınırlamak için müdahaleler için ideal bir hedef haline getirir.
SG gelişiminin larva aşamasını karakterize etmek, sadece morfolojisini ve fonksiyonel adaptasyonlarını daha iyi anlamakla kalmaz, aynı zamanda anahtar SG düzenleyicilerinin gen düzenlemesi yoluyla bu organı hedefleyen yeni müdahalelerin değerlendirilmesine de yardımcı olabilir. Larva tükürük bezi mimarisinin önceki tüm çalışmaları immünostaining ve modern görüntüleme tekniklerindenönce 10,11, tükürük bezlerini çeşitli antikorlar ve hücre belirteçleri ile izole etmek ve boyamak için bir protokol geliştirdik12. Bu video, konfokal görüntüleme için Anopheles gambiae L4 larvalarından larva SG'lerinin çıkarılması, sabitlenmesi ve lekelenmesine yönelik bu yaklaşımı göstermektedir.

<table><tbody><tr><td>&nbsp; KH2PO4</td><td>Millipore Sigma</td><td>P9791</td><td></td></tr><tr><td>&nbsp; Na2HPO4 &boğa; 2H2O</td><td>Millipore Sigma</td><td>71643</td><td></td></tr><tr><td>&nbsp; NaCl</td><td>Millipore Sigma</td><td>S7653</td><td></td></tr><tr><td>Aseton</td><td>Millipore Sigma</td><td>179124</td><td></td></tr><tr><td>Yumuşak kıllı</td> fırça <td>Amazon (SN NJDF) Detay Boya Fırçası Seti</td><td>B08LH63D89</td><td></td></tr><tr><td>Kapak fişleri (22 x 50 mm)</td><td>VWR</td><td>48393-195</td><td></td></tr><tr><td>DAPI (DNA)</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>D1306</td><td></td></tr><tr><td>Etil alkol 200 kanıt</td><td>Millipore Sigma</td><td>EX0276</td><td></td></tr><tr><td>Gilson Pipetman P200 Pipet</td><td>Gilson</td><td>P200</td><td></td></tr><tr><td>Buzul Asetik Asit</td><td>Sigma Aldrich</td><td>695092</td><td></td></tr><tr><td>Kuyumcular forseps, Dumont No. 5</td><td>Millipore Sigma</td><td>F6521</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Millipore Sigma</td><td>58221</td><td></td></tr><tr><td>Metanol</td><td>Millipore Sigma</td><td>1414209</td><td></td></tr><tr><td>Oje</td><td>Amazon (Sally Hansen)</td><td>B08148YH9M</td><td></td></tr><tr><td>Nil Kırmızısı (lipid)</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>N1142</td><td></td></tr><tr><td>Kağıt havlu/mendil</td><td>ULINE</td><td>S-7128</td><td></td></tr><tr><td>Petri plakası (macun plakası yapmak için)</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>FB0875712</td><td></td></tr><tr><td>Pipet Uçları</td><td>Gilson</td><td>Uçları E200ST</td><td></td></tr><tr><td>Plastik Transfer</td><td>Pipeti Fisher Bilimsel</td><td>S304671</td><td></td></tr><tr><td>Primer antikorlar (örneğin, Crb, Rab11)</td><td>Gelişimsel Çalışmalar Hibridoma Bankası (DSHB); Andrew Lab</td><td>Mouse anti-Crb (Cq4) veya Tavşan anti-Rab11</td><td></td></tr><tr><td>Floresan etiketli ikincil antikorlar (örneğin, Alexa Fluor 488 Keçi-anti Tavşan)</td> <td>ThermoFisher Scientific</td><td>A11008</td><td></td></tr><tr><td>Macun plakası için silikon reçine ve sertleştirici madde</td><td>Dow Chemicals - Ximeter Silikon</td><td>PMX-200</td><td></td></tr><tr><td>Slaytlar, etiketleme için bir ucu buzlu</td><td>VWR&nbsp; 20 X 50 mm</td><td>48393-195</td><td></td></tr><tr><td>Buğday Tohumu Aglütinin</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>W834</td><td></td></tr></tbody></table>

anopheles gambiae sivrisineklerinden larva tükürük bezlerinin diseksiyonu ve İmmünasyon

Dissection and Immunostaining of Larval Salivary Glands from Anopheles gambiae Mosquitoes

Sivrisinek tükürük bezleri (SG'ler), böcek kaynaklı patojenlerin iletimi için gerekli bir ağ geçidi organıdır. Virüsler ve sıtmaya neden olan Plazmodium parazitleri de dahil olmak üzere hastalık neden olan ajanlar, SG hücrelerinin salgı boşluklarında birikir. Burada, sonraki bir kan unu sırasında omurgalı konaklarına iletilmek üzere hazırlanırlar. Yetişkin bezleri, erken pupal SG histolizinin ötesinde devam eden larva SG kanal tomurcuk kalıntılarının bir detaylandırılması olarak oluştuğundan, larva SG, hastalık bulaşmasını sınırlayan müdahaleler için ideal bir hedeftir. Larva SG gelişimini anlamak, morfolojisinin ve fonksiyonel adaptasyonlarının daha iyi anlaşılmasına yardımcı olabilir ve bu organı hedefleyen yeni müdahalelerin değerlendirilmesine yardımcı olabilir. Bu video protokolü, Anopheles gambiae sivrisineklerinden larva SG'lerini izole etmek, sabitlemek ve lekelemek için etkili bir teknik göstermektedir. % 25 etanol çözeltisinde larvalardan parçalanan bezler, metanol-buzul asetik asit karışımına sabitlenir ve ardından soğuk aseton yıkama. Fosfat tamponlu salin (PBS) içinde birkaç durulamadan sonra, SG'ler SG eksprese proteinlerine karşı çok çeşitli işaret boyaları ve / veya antisera ile boyanabilir. Larva SG izolasyonu için bu yöntem in situ hibridizasyon analizi, diğer transkriptomik uygulamalar ve proteomik çalışmalar için doku toplamak için de kullanılabilir.

Tükürük bezlerinin tüm aşama 4 larvalardan parçalanmaları nispeten kolaydır. Erkek ve dişi larvalar geç L4 larva aşamasında dişilerin sırt toraksı boyunca kırmızı bir şeritle ayırt edilebilir, ancak erkeklerin değil (Şekil 2). Ayrıca, anten morfolojisinin erkekte dişi L4 larvalarına göre çok daha ayrıntılı olduğunu gözlemliyoruz (Şekil 2), yetişkin sivrisineklerde bu yapıda gözlenen farklılıklara benzer. L4 aşamasındaki önemli genel büyümenin yanı sıra, tükürük ...

Yetişkin sivrisinek tükürük bezi (SG), virüsler ve parazitler de dahil olmak üzere sivrisinek kaynaklı tüm patojenlerin insan konakçılarına iletilmesi için gereklidir. Bu video, SG'lerin larva (L4) evresi Anopheles gambiae sivrisineklerinden verimli bir şekilde izole edilmesini ve daha fazla analiz için L4 SG'lerin hazırlanmasını göstermektedir.

Anopheles gambiae Sivrisineklerinden Larva Tükürük Bezlerinin Diseksiyonu ve İmmünasyon

Mosquito salivary glands (SGs) are a requisite gateway organ for the transmission of insect-borne pathogens. Disease-causing agents, including viruses and ...

Böceklerin tükürük bezleri, birçok insan hastalığını iletmek için gereklidir. Bu yüzden maaş bezi biyolojisinin daha iyi anlaşılması, hastalık önleme için mevcut stratejilere katkıda bulunmalıdır. Bu teknik, aday düzenleyicilerdeki mutasyonların sivrisinek larva tükürük bezlerinin morfolojisini etkileyip etkilemediğini ve sıtma parazitlerinin bulaşmasını potansiyel olarak etkileyip etkilemediğini hızlı bir şekilde sormamıza izin verecektir.Sivrisinek larvaları ile ilk birkaç kez çalıştığınızda, hızlı hareket ettikçe kavramaları zordur. Ne kadar çok pratik yaptırırsan, o kadar iyi olursun. Prosedüre başlarken, laboratuvarımın lisans araştırma asistanı Marisol Luchetti olacak.Deneye başlamak için, bir diseksiyon mikroskobu aşamasına bir lazımlık plakası yerleştirin ve 10 sivrisinek L4 larvasını lazımlık plakasına aktarın. Daha sonra larvalardan ayrı lazımlık plakasına diseksiyon çözeltisinden bir damla yerleştirin. Bir L4 larvasını% 25 etanol diseksiyon çözeltisi damlasına yerleştirmek için forseps kullanın.Her elde beş numaralı bir asa tutarak, larvaları başın hemen altında, baskın el ile kavrayın ve larva başını baskın olmayan el ile kavrayın, ardından bezler başa bağlı kalırken, vücudun geri kalanından kopmak için başı minimum sabit kuvvetle hafifçe çekin. Larva karkasının vücut kısmını attıktan sonra, baş veya tükürük bezlerini bir mililitre PBS'de, 1,5 mililitrelik bir mikro santrifüj tüpünde toplayın ve tükürük bezlerinin tamponun dibine batmasını bekleyin. Ertesi gün, dokuları sabitlemek için çözeltiyi 90 saniye boyunca bir mililitre soğuk% 100 aseton ile boşaltın.Asetonu çıkardıktan sonra, dokuları bir mililitre PBS ile üç kez hafifçe durulayın. İmmün yetinme için, PBS'nin toplam hacminin 200 mikrolitresinde, uygun seyreltmede Rab 11 gibi birincil bir antikor ekleyin. Boru içeriğini bir pipet ucuyla hafifçe döndürün.Primer antikorları bir gecede dört derecede kuluçkaya yatırın, ardından bir mililitre PBS'de üç kez yıkayın. Daha sonra ikincil antikor olan Alexa Fluor 488 Goat anti-Rabbit'i uygun seyreltmede toplam hacmin 200 mikrolitresinde ekleyin. İçeriği bir pipet ucuyla karıştırdıktan sonra, dokuları Nil kırmızısı ve Hoechst gibi boyalarla 60 dakika oda sıcaklığında 200 mikrolitre PBS'ye inküboz edin ve ardından PBS ile üç kez yıkayın.Bir pipet ile 200 mikrolitre% 100 gliserol ekleyerek ve yumuşak bir fırça kullanarak mikroskop slaytı başına ekli bezler ve iç yapılarla 20'ye kadar lekeli kafa aktararak bir mikroskop slaytı hazırlayın. Kafa örneklerini cam slayt boyunca eşit olarak dağıtmak için dışarı yayın. Bir diseksiyon mikroskobu altında görüntüleme, larva başını bezlerden ayırın, iki çift kümes gücü kullanarak, iki dokuyu dikkatlice zıt yönlere çekerek.Tüm numuneler yapıldığında, 1,5 milimetre kalınlığında bir kapak kaymasını yavaşça kaydırağın üzerine yerleştirin, hava kabarcıklarının oluşumunu önleyin ve ardından kaydırağı açık oje ile kapatın. Tükürük bezlerinin dördüncü evre larvalardan parçalanmaları nispeten kolaydır. Erkek ve dişi larvalar, geç L4 larva aşamasında, dişilerin sırt toraksı boyunca kırmızı bir şeritle ayırt edilebilir.Anten morfolojisi de, erkeklerde, görülebileceği gibi dişi L4 larvalarından daha ayrıntılıdır, beyaz oklar işaret edilir, sol görüntüdeki dişi antenler ve sağdaki erkek antenleri. Erken L4 evre larvalarından izole edilen, Hoechst ile lekelenmiş tükürük bezleri, dar bir daralma ile ayrılmış proksimal ve distal lobları ortaya çıkarmaktadır. Oluşturan lümen, orta ila geç L4 larvalarının immün lekeli distal tükürük bezinde incelendi.Lümeni çevreleyen salgı hücrelerinin apikal etki alanları, mikrovilli gibi yapıları düşündüren yoğun Nil kırmızısı lekelemesine sahipti. Rab 11 lekesi apikal yüzeye yakın bir şekilde gözlendi. Zamanla ilgili tek bir adım var, o da soğuk asetondaki dokuların 90 saniyelik inkübasyonu.Bu protokol daha yeni geliştirildi, ancak sivrisinek tükürük bezi üzerinde çalışan herkese yardımcı olacağını umuyoruz. Sık sık kullanmayı bekliyoruz.

dissection-immunostaining-larval-salivary-glands-from-anopheles

Research

JoVE Journal

Biology

Biyoloji

Sivrisinek midgut ve tükürük bezlerinin Plasmodium falciparum ve dang virüsü gibi vektör patojenler için anahtar giriş ve çıkış noktaları vardır. Bu video Aedes aegypti sivrisinek midgut ve tükürük bezleri kaldırmak için diseksiyon teknikleri göstermektedir.

Ae midgut ve Tükürük Bezlerinin Diseksiyon. aegypti Sivrisinekler

Zamansal ve mekansal gen ekspresyon analizleri fonksiyonel genomik önemli bir role sahiptir. Tüm montaj...

Melezleme<em&gt; In situ</em&gt; Bezler, Yumurtalık ve Vektör Sivrisinek ve Embriyoların

Floresan<em&gt; In situ</emSivrisinekler ve Mitotik Kromozomlar üzerinde&gt; Hibridizasyon

Bu video, sinek larvasındaki hematopoezin birincil bölgesi olan Drosophila lenf bezini tanımlar ve immünohistokimya ve floresan görüntüleme için organı incelemek ve monte etmek için örnek bir protokol gösterir.

Larva Lenf Bezi Diseksiyonu: Drosophila Hemosit Üreten Organın İzole Edilmesi

İnsan sıtma parazitlerine kemirgen sıtma parazitlerinin yaşam döngüsü ve biyolojisinin çarpıcı benzerlikleri nedeniyle, kemirgen sıtma modelleri sıtma araştırmaları için vazgeçilmez hale gelmiştir. Burada, vahşi tip ve transgenik kemirgen sıtma türlerinin fenotipeksi analizinde kullanılan en önemli tekniklerden bazılarını standardize ettik.

Kemirgen Sıtma paraziti Asexual ve cinsel kan aşamaları ve sivrisinek aşamaları phenotypic Analizi

Sıtma parazitlerinin sivrisinek aşamaları üzerinde ayrıntılı araştırmalar, etkili bulaşma engelleme stratejileri tasarlamak için kritik öneme sahiptir. Bu protokol, enfeksiyöz gametositlerin etkili bir şekilde nasıl kültüreılacağını ve daha sonra bu gametositlerin sivrisineklere nasıl beslendiğini gösterir P. falciparumsivrisinek aşamaları .

Plazmodium falciparum Yapay Membran Besleme Yoluyla Gametosit Kültürü ve Sivrisinek Enfeksiyonu

Bu protokol, Ramsay tahlilinin arkasındaki metodolojileri, iyon seçici mikroelekrodları, Tarama İyon seçici Elektrot Tekniğini (SIET) ve in vitro kasılma testlerini özetlemektedir, Malpighian tübülleri ve arkalarından oluşan yetişkin sivrisinek boşaltım sistemini incelemek için uygulanan, iyon ve akışkan salgı oranlarını, kontinentil aktiviteyi ve transepithelial iyon taşımacılığını toplu olarak ölçmek için.

Yetişkin Sivrisinekte Nöropeptitlerin ve Boşaltım Sisteminin Diğer Düzenleyicilerinin Aktivitesinin Incelenmesi

Mikroenjeksiyon teknikleri, sivrisineklerin genomlarına eksojen genleri sokmak için gereklidir. Bu protokol, James laboratuvarı tarafından DNA yapılarını dönüştürülmüş sivrisinekler üretmek için Anopheles gambiae embriyolarına mikroenjeze etmek için kullanılan bir yöntemi açıklar.

Anopheles gambiae Embriyoları için Mikroenjeksiyon Yöntemi

Caenorhabditis elegans'ta rutin olarak kullanılan RNA girişimi (RNAi) için bir dağıtım yöntemi olan bakteriler tarafından üretilen dsRNA'nın oral yoldan uygulanması, burada yetişkin sivrisineklere başarıyla uygulanmıştır. Yöntemimiz, enjeksiyon kullanmadan sağlam ters genetik çalışmalarına ve iletimi engelleyen vektör çalışmalarına izin verir.

Yetişkin Anofeller gambiae Sivrisineklerine Etkili Oral RNA İnferferi (RNAi) Uygulaması

Basit anatomileri göz önüne alındığında, Anofel testisleri spermatogenezi incelemek için iyi bir sitolojik model sunar. Bu protokol, bu biyolojik süreci araştırmak için kullanılan bir teknik olan tam montajlı floresan in situ hibridizasyonun yanı sıra sperm üretiminde yer alan genlerde mutasyonları barındıran transgenik suşların fenotipini açıklar.

Anofel Sivrisineklerinde Spermatogenezi İncelemek için Tam Montajlı Floresan In Situ Hibridizasyon

Sivrisineklerdeki mikrobiyal topluluklar, vektör biyokontrol stratejileri için büyük umut vaat ediyor. Simbiyontların çoğu yetiştirilemez ve metagenomik analizler gerektirir. Dişi sivrisinekleri incelemek ve yumurtalıkları, orta bağırsakları ve tükürük bezlerini ayırmak, çapraz kontaminasyonu önlemek, organ düzeyinde mikrobiyom çalışmalarını kolaylaştırmak ve mikroorganizmaların sivrisinek biyolojisindeki rollerinin anlaşılmasını geliştirmek için bir yöntem açıklıyoruz.

Organ Düzeyinde Mikrobiyom Analizleri için Sivrisinek Yumurtalıkları, Midgut ve Tükürük Bezlerinin Diseksiyonu

Öğrenin Anopheles gambiae larva tükürük bezlerinin diseksiyonu ve immünostaining tekniklerini. Bu yöntem, sivrisinek biyolojisini ve hastalık iletim mekanizmalarını anlamak için araştırmacılara güvenilir bir araç sunar.

Anopheles gambiae Sivrisineklerinden Larva Tükürük Bezlerinin Diseksiyonu ve İmmünasyon

Daha fazla video keşfet