Name: Kültürlenmiş Kemik Hücrelerinde ve İzole Kemik Şaftlarında Amino Asit Tüketiminin Değerlendirilmesi (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-04-13T13:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 32 s
Description: Öğrenin, radyoaktif amino asit alım ölçümü ile kemik hücrelerinde amino asit tüketimini değerlendirin. Bu hızlı ve duyarlı yöntem, osteoblast farklılaşması ve kemik metabolizması araştırmalarında kullanılır.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Karner laboratuvarı, C.M.K.'ya Ulusal Sağlık Enstitüsü R01 hibeleri (AR076325 ve AR071967) tarafından desteklenmektedir.

Burada açıklanan tüm fare prosedürleri, Dallas'taki Teksas Üniversitesi Güneybatı Tıp Merkezi'ndeki Hayvan Çalışmaları Komiteleri tarafından onaylanmıştır. Radyasyon protokolü, Dallas'taki Teksas Üniversitesi Güneybatı Tıp Merkezi'ndeki Radyasyon Güvenliği Danışma Komitesi tarafından onaylandı.
1. Hücrelerde amino asit alımı (Protokol I)
<ol><li>Plaka 5 x 104 ST2 hücreleri 12 kuyucuklu bir doku kültür plakasının her bir kuyucuğunda. α-MEM'deki plaka hücreleri% 10 FBS, 100 U / mL penisilin ve 0.1 μg / mL streptomisin (Pen / Strep) içerir. Adım 1.12'deki normalleştirmeler için koşul başına hücre sayısını ölçmek için hücrelerin ekstra kuyucuklarını plakalayın. Nemlendirilmiş bir hücre kültürü inkübatöründeki hücreleri% 5 CO 2 ile 37 ° C'deinkübe edin.</li>
	<li>Hücreleri birleşene kadar 2-3 gün boyunca kültürleyin.</li>
	<li>Deney gününde, aşağıdaki çözeltileri hazırlayın: 1x Fosfat Tamponlu Tuzlu Tuz (PBS), pH 7.4 ve Krebs Ringers HEPES (KRH) tamponu, pH 8.0: (120 mM NaCl, 5 mM KCl, 2 mM CaCl 2, 1 mM MgCl2, NaHCO3, 5 mM HEPES, 1 mM D-Glikoz). 37 °C'ye kadar ısıtın.</li>
	<li>Ortamı aspire edin ve hücreleri 1 mL 1x PBS, pH 7.4 ile iki kez yıkayın. NOT: Bu protokol, akıcı olmayan hücreleri hızla bölmek için de uygundur. Bu durumda, radyoaktiviteyi mutlak hücre sayısına veya DNA içeriğine normalleştirmek önemlidir. Ek olarak, genel hücre sayısını ve cpm değerlerini artırmak için kültür plakasının veya şişenin boyutunu artırmayı düşünün. Bu, bireysel olarak ampirik olarak belirlemek için önemlidir.</li>
	<li>1x PBS'yi aspire edin ve hücreleri 1 mL KRH ile bir kez yıkayın.</li>
	<li>1 mL KRH başına 4 μL [1 μCi μL-1] L-[3,4-3 H]-Glutamin stoğu seyrelterek 4 μL [3,4-3H]-Glutamin çalışma ortamı yapın. NOT: Radyoaktif malzemeleri kullanmadan önce, onay almak için lütfen kendi kurumunuzdaki Radyasyon Güvenliği Ofisi ile iletişime geçin. Radyasyonla ilgili tüm prosedürler pleksiglas kalkanın arkasında yapılmalıdır.</li>
	<li>4 μCi/mL L-[3,4-3 H]-Glutamin çalışma ortamı içeren 0,5 mL KRH içeren hücreleri 5 dakika boyunca inkübe edin.</li>
	<li>Radyoaktif ortamı toplayın ve sıvı atık kabına dağıtın. Reaksiyonu sonlandırmak için hücreleri buz gibi soğuk KRH ile üç kez kısaca yıkayın. Tüm yıkamaları radyoaktif sıvı atık kabında toplayın ve atın.</li>
	<li>Her bir kuyucuğa 1 mL% 1 SDS ekleyin ve hücreleri lize etmek ve homojenize etmek için 10x'i tritüre edin. Hücre lizatlarını 1.5 mL tüplere aktarın. Hücre kültürü plakalarını, serolojik pipetleri ve pipet uçlarını katı radyoaktif atık kabına atın.</li>
	<li>10 dakika boyunca >10.000 x g'de santrifüj. Süpernatantları, 8 mL sintilasyon çözeltisi içeren sintilasyon şişelerine aktarın. Parıltılı şişeleri kuvvetlice sallayarak karıştırın. Tüpleri ve pipet uçlarını katı radyoaktif atık kabına atın.</li>
	<li>Bir Scintillation sayacı kullanarak radyoaktiviteyi dakika başına sayım (cpm) cinsinden okuyun. Parıltılı şişeleri sintilasyon şişesi atık konteynerine atın.</li>
	<li>Lised, radyoaktif kültürlerdeki hücre sayısını tahmin etmek için hücrelerin kalan radyoaktif olmayan plakalarından hücreleri tripsinize edin, yeniden askıya alın ve sayın (bkz. adım 1.1). Bir hemositometre kullanarak, her deneysel durum için radyoaktif olmayan kuyu başına düşen hücre sayısını sayın. CPM'yi adım 1.11'den radyoaktif olmayan plakalardan tahmini hücre numarasına normalleştirin.</li>
	<li>Deneyin tamamlanmasından sonra, hücre kültürü başlığını, tezgahı ve tüm aletleri radyoaktivite dekontaminant spreyi ile dekontamine edin. Son olarak, çalışma alanının radyasyonsuz olduğundan emin olmak için silme testleri yapın.</li>
</ol>2. Yeni izole edilmiş kemik dokularında amino asit alımı (Protokol II)
<ol><li>KRH'yi 37 ° C'ye kadar ısıtın.</li>
	<li>3 günlük bir fareyi ötenazi yapın ve kollardaki cildi çıkarın. Humeriyi omuzdan makas kullanarak parçacıklayın ve her iki humeri'yi de parçalara ayırın. Bir neşter ve forseps kullanarak tüm çağdaş dokuları çıkarın. Epifizleri kemikten çıkarın. NOT: Humerii'ye ek olarak, bu protokol yenidoğan femora, tibiae ve calvariae'nin yanı sıra 2 ve 4 aylık farelerden izole edilen humerii, femora ve tibiae'ye uyarlanabilir (yayınlanmamış veriler).</li>
	<li>Kemik iliğini kemikten temizleyin ve adım 2.14'te normalleştirmek için kemik şaftlarını tartın.</li>
	<li>Kemiği desellülarize etmek için 100 ° C'de 1x PBS'de bir humerusu 10 dakika kaynatın. Desellülarize haşlanmış kemik negatif kontrol olarak kullanılır. NOT: Bir kalite kontrol olarak, parafin, kaynatmanın kemiğin hücreden arındırılmasında etkili olduğunu görsel olarak doğrulamak için histolojik lekeler için kaynamış ve kaynatılmamış kemikleri gömer.</li>
	<li>Her iki humeri'yi de 37 ° C'de hücre kültürü inkübatöründe 30 dakika boyunca 1 mL KRH'de dengeleyin.</li>
	<li>1 mL KRH başına 4 μL 1μCi/μL L-[2,3,4-3 H]- Arginin stoğunu seyrelterek KRH'de 4 μCi/mL L-[2,3,4-3H]-Arginin çalışma çözeltisi yapın. NOT: Bu protokol, hangi radyo-etiketli besin maddesinin seçildiğini değerlendirmek için uygundur. L-[2,3,4-3 H]-glutamin, L-[14CU]-alanin ve L-[2,3-3 H]-prolin benzer sonuçlarla test edilmiştir. Arginin verilerinin bu protokolün faydasını vurguladığı gösterilmiştir. DİKKAT: Radyasyon kullanan tüm prosedürler, uygun kişisel koruyucu ekipman (KKD) kullanılırken pleksiglas kalkanın arkasında yapılmalıdır.</li>
	<li>Hem deneysel hem de haşlanmış kontrol kemiğini 4 μCi/mL L-[2,3,4-3 H]-Arginin içeren KRH'de ayrıayrı 37 °C'de 90 dakikaya kadar inkübe edin. NOT: Bir zaman kursu gerçekleştirerek, farelerin yaşı, farklı iskelet elemanları ve radyoaktif işaretli amino asit türleri de dahil olmak üzere farklı koşullar için kuluçka sürelerini ampirik olarak belirlemek önemlidir. Doygunluk çoğunlukla yaklaşık 3-4 saat sonra ortaya çıkar. Alım, alımın doğrusal öfkesindeki bir zaman noktasında değerlendirilmelidir.</li>
	<li>Radyoaktif ortamı çıkarın ve sıvı radyoaktif atık kabına atın. Reaksiyonu sonlandırmak için humeri'yi buz gibi soğuk 1 mL KRH kullanarak üç kez yıkayın. Tüm yıkamaları sıvı radyoaktif atık kabına atın.</li>
	<li>Her kemiği 1,5 mL'lik bir tüpe aktarın. 500 μL RIPA tamponu ekleyin [150 mM NaCl; 5 mM EDTA; 50 mM Tris (pH 8.0); %0.5 NP40 (v/v); %0.5 DOX (w/v); %0.1 SDS (w/v)]. Kültür plakalarını, serolojik pipetleri ve pipet uçlarını radyoaktif katı atık kabına atın.</li>
	<li>Bir RIPA tamponunda makasla 100 kez doğrayarak humeri'yi homojenleştirin.</li>
	<li>Sonicate (Genlik:% 35, Darbe 1 s) 10 s için ortaya çıkan homojenize kemik. NOT: Sonication ayrıca aerosol üretmek için bilinir. Sonication adımları biyolojik bir güvenlik kabininde gerçekleştirilebilir. Aerosol oluşumunu azaltmak için, tüpleri fazla doldurmamak önemlidir. Küçük numune hacimlerinin sonikasyonu, köpüklenme nedeniyle eksik sonikasyon veya numune kaybına neden olabilir. Köpüklenme meydana gelirse, numuneyi yerleşmesi için 5 dakika boyunca santrifüj yapın.</li>
	<li>Lizatı oda sıcaklığında >10.000 x g'de 10 dakika boyunca santrifüjleme ile netleştirin. Süpernatantın 200 μL'sini, 8 mL sintilasyon çözeltisi içeren sintilasyon şişelerine aktarın. Parıltılı şişeleri kuvvetlice sallayarak karıştırın. Tüm katı radyoaktif atıkları (ör. kullanılmış tüpler, pipet uçları, plakalar vb.) katı radyoaktif atık kabına atın.</li>
	<li>Scintillation sayacını kullanarak radyoaktiviteyi (cpm) okuyun. Kullanılmış parıltı şişelerini, parıltı şişeleri için belirlenmiş radyoaktif atık kabına atın.</li>
	<li>Kaynamış kemiğin cpm'sini (bazal değer) deneysel kemiğin cpm'sinden çıkarın. Radyoaktiviteyi adım 2.3'ten itibaren kemik ağırlığı ile normalleştirin.</li>
	<li>Hücre kültürü başlığını, aletleri ve tezgahı radyoaktivite dekontaminantı ile püskürtün. Çalışma alanının radyasyonsuz olduğunu doğrulamak için silme testleri gerçekleştirin.</li>
</ol>

<ol><li>Xiao, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhibition+of+%CE%B1-KG-dependent+histone+and+DNA+demethylases+by+fumarate+and+succinate+that+are+accumulated+in+mutations+of+FH+and+SDH+tumor+suppressors%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+%26+Development%22%5BJournal%5D)">Inhibition of α-KG-dependent histone and DNA demethylases by fumarate and succinate that are accumulated in mutations of FH and SDH tumor suppressors.</a> Genes & Development. 26 (12), 1326-1338 (2012).</li>
<li>Altman, B. J., Stine, Z. E., Dang, C. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((From+Krebs+to+clinic%3A+glutamine+metabolism+to+cancer+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Cancer%22%5BJournal%5D)">From Krebs to clinic: glutamine metabolism to cancer therapy.</a> Nature Reviews Cancer. 16 (10), 619-634 (2016).</li>
<li>Karner, C. M., Long, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Wnt+signaling+and+cellular+metabolism+in+osteoblasts%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+and+Molecular+Life+Sciences%22%5BJournal%5D)">Wnt signaling and cellular metabolism in osteoblasts.</a> Cell and Molecular Life Sciences. 74 (9), 1649-1657 (2017).</li>
<li>Zarse, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Impaired+insulin%2FIGF1+signaling+extends+life+span+by+promoting+mitochondrial+L-proline+catabolism+to+induce+a+transient+ROS+signal%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Metabolism%22%5BJournal%5D)">Impaired insulin/IGF1 signaling extends life span by promoting mitochondrial L-proline catabolism to induce a transient ROS signal.</a> Cell Metabolism. 15 (4), 451-465 (2012).</li>
<li>Nagano, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proline+dehydrogenase+promotes+senescence+through+the+generation+of+reactive+oxygen+species%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Science%22%5BJournal%5D)">Proline dehydrogenase promotes senescence through the generation of reactive oxygen species.</a> Journal of Cell Science. 130 (8), 1413-1420 (2017).</li>
<li>Comes, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((L-Proline+induces+a+mesenchymal-like+invasive+program+in+embryonic+stem+cells+by+remodeling+H3K9+and+H3K36+methylation%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">L-Proline induces a mesenchymal-like invasive program in embryonic stem cells by remodeling H3K9 and H3K36 methylation.</a> Stem Cell Reports. 1 (4), 307-321 (2013).</li>
<li>Fan, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glutamine-driven+oxidative+phosphorylation+is+a+major+ATP+source+in+transformed+mammalian+cells+in+both+normoxia+and+hypoxia%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Systems+Biology%22%5BJournal%5D)">Glutamine-driven oxidative phosphorylation is a major ATP source in transformed mammalian cells in both normoxia and hypoxia.</a> Molecular Systems Biology. 9, 712(2013).</li>
<li>Hosios, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Amino+acids+rather+than+glucose+account+for+the+majority+of+cell+mass+in+proliferating+mammalian+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Cell%22%5BJournal%5D)">Amino acids rather than glucose account for the majority of cell mass in proliferating mammalian cells.</a> Developmental Cell. 36 (5), 540-549 (2016).</li>
<li>Welbourne, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ammonia+production+and+glutamine+incorporation+into+glutathione+in+the+functioning+rat+kidney%5BTitle%5D)+AND+%22Canadian+Journal+of+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Ammonia production and glutamine incorporation into glutathione in the functioning rat kidney.</a> Canadian Journal of Biochemistry. 57 (3), 233-237 (1979).</li>
<li>Sullivan, L. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Supporting+aspartate+biosynthesis+is+an+essential+function+of+respiration+in+proliferating+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Supporting aspartate biosynthesis is an essential function of respiration in proliferating cells.</a> Cell. 162 (3), 552-563 (2015).</li>
<li>Nelsen, C. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Amino+acids+regulate+hepatocyte+proliferation+through+modulation+of+cyclin+D1+expression%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Amino acids regulate hepatocyte proliferation through modulation of cyclin D1 expression.</a> The Journal of Biological Chemistry. 278 (28), 25853-25858 (2003).</li>
<li>Krall, A. S., Xu, S., Graeber, T. G., Braas, D., Christofk, H. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Asparagine+promotes+cancer+cell+proliferation+through+use+as+an+amino+acid+exchange+factor%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Asparagine promotes cancer cell proliferation through use as an amino acid exchange factor.</a> Nature Communications. 7, 11457(2016).</li>
<li>Green, C. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Branched-chain+amino+acid+catabolism+fuels+adipocyte+differentiation+and+lipogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Chemical+Biology%22%5BJournal%5D)">Branched-chain amino acid catabolism fuels adipocyte differentiation and lipogenesis.</a> Nature Chemical Biology. 12 (1), 15-21 (2016).</li>
<li>Shiraki, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Methionine+metabolism+regulates+maintenance+and+differentiation+of+human+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Metabolism%22%5BJournal%5D)">Methionine metabolism regulates maintenance and differentiation of human pluripotent stem cells.</a> Cell Metabolism. 19 (5), 780-794 (2014).</li>
<li>Yu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glutamine+metabolism+regulates+proliferation+and+lineage+allocation+in+skeletal+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Metabolism%22%5BJournal%5D)">Glutamine metabolism regulates proliferation and lineage allocation in skeletal stem cells.</a> Cell Metabolism. 29 (4), 966-978 (2019).</li>
<li>Shen, L., Sharma, D., Yu, Y., Long, F., Karner, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biphasic+regulation+of+glutamine+consumption+by+WNT+during+osteoblast+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Science%22%5BJournal%5D)">Biphasic regulation of glutamine consumption by WNT during osteoblast differentiation.</a> Journal of Cell Science. 134 (1), (2021).</li>
<li>Karner, C. M., Esen, E., Okunade, A. L., Patterson, B. W., Long, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Increased+glutamine+catabolism+mediates+bone+anabolism+in+response+to+WNT+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Investigation%22%5BJournal%5D)">Increased glutamine catabolism mediates bone anabolism in response to WNT signaling.</a> Journal of Clinical Investigation. 125 (2), 551-562 (2015).</li>
<li>Hu, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+amino+acid+sensor+Eif2ak4%2FGCN2+is+required+for+proliferation+of+osteoblast+progenitors+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Bone+and+Mineral+Research%22%5BJournal%5D)">The amino acid sensor Eif2ak4/GCN2 is required for proliferation of osteoblast progenitors in mice.</a> Journal of Bone and Mineral Research. 35 (10), 2004-2014 (2020).</li>
<li>Rached, M. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((FoxO1+is+a+positive+regulator+of+bone+formation+by+favoring+protein+synthesis+and+resistance+to+oxidative+stress+in+osteoblasts%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Metabolism%22%5BJournal%5D)">FoxO1 is a positive regulator of bone formation by favoring protein synthesis and resistance to oxidative stress in osteoblasts.</a> Cell Metabolism. 11 (2), 147-160 (2010).</li>
<li>Elefteriou, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ATF4+mediation+of+NF1+functions+in+osteoblast+reveals+a+nutritional+basis+for+congenital+skeletal+dysplasiae%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Metabolism%22%5BJournal%5D)">ATF4 mediation of NF1 functions in osteoblast reveals a nutritional basis for congenital skeletal dysplasiae.</a> Cell Metabolism. 4 (6), 441-451 (2006).</li>
<li>Maleknia, S. D., Johnson, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mass+spectrometry+of+amino+acids+and+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Amino+Acids%2C+Peptides+and+Proteins+in+Organic+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Mass spectrometry of amino acids and proteins.</a> Amino Acids, Peptides and Proteins in Organic Chemistry. , 1-50 (2011).</li>
<li>Rennie, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+introduction+to+the+use+of+tracers+in+nutrition+and+metabolism%5BTitle%5D)+AND+%22The+Proceedings+of+the+Nutrition+Society%22%5BJournal%5D)">An introduction to the use of tracers in nutrition and metabolism.</a> The Proceedings of the Nutrition Society. 58 (4), 935-944 (1999).</li>
<li>Hahn, T. J., Downing, S. J., Phang, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Amino+acid+transport+in+adult+diaphyseal+bone%3A+contrast+with+amino+acid+transport+mechanisms+in+fetal+membranous+bone%5BTitle%5D)+AND+%22Biochimica+Biophysica+Acta%22%5BJournal%5D)">Amino acid transport in adult diaphyseal bone: contrast with amino acid transport mechanisms in fetal membranous bone.</a> Biochimica Biophysica Acta. 183 (1), 194-203 (1969).</li>
<li>Rosenbusch, J. P., Flanagan, B., Nichols, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Active+transport+of+amino+acids+into+bone+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Biochimica+Biophysica+Acta%22%5BJournal%5D)">Active transport of amino acids into bone cells.</a> Biochimica Biophysica Acta. 135 (4), 732-740 (1967).</li>
<li>Kandasamy, P., Gyimesi, G., Kanai, Y., Hediger, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Amino+acid+transporters+revisited%3A+New+views+in+health+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Biochemical+Sciences%22%5BJournal%5D)">Amino acid transporters revisited: New views in health and disease.</a> Trends in Biochemical Sciences. 43 (10), 752-789 (2018).</li>
</ol>

Yazarların herhangi bir açıklaması yoktur.

Burada açıklanan protokol, in vitro veya ex vivo çeşitli deneysel permütasyonlara yanıt olarak amino asit alımını değerlendirmek için hızlı ve hassas bir yaklaşım sağlar. Ticari olarak temin edilebilen kitlerle (örneğin, Glutamin ve Glutamat Belirleme Kiti) karşılaştırıldığında, bu yöntem çok daha hassas, daha hızlı ve daha az emek yoğun16,17,25'tir. Protokolümüzde, Krebs Ringers HEPES tamponundaki alımı değerl...

Amino asitler, her amino aside özgü değişken bir yan zincire sahip bir amino (-NH2) ve karboksil (-COOH) fonksiyonel grupları içeren organik bileşiklerdir. Genel olarak, amino asitler proteinin temel bileşeni olarak iyi bilinir. Daha yakın zamanlarda, amino asitlerin yeni kullanımları ve işlevleri açıklığa kavuşturulmuştur. Örneğin, bireysel amino asitler, biyoenerjetik maddelere katkıda bulunan, enzimatik kofaktörler olarak işlev gören, reaktif oksijen türlerini düzenleyen veya diğer amino asitleri sentezlemek için kullanılan ara metabolitler üretmek için metabolize edilebilir 1,2,3,4,5,6,7,8,9,10 . Birçok çalışma, amino asit metabolizmasının çeşitli bağlamlarda hücre pluripotensi, proliferasyonu ve farklılaşması için kritik olduğunu göstermektedir 3,6,11,12,13,14,15,16,17.
Osteoblastlar, Kollajen Tip 1 bakımından zengin hücre dışı kemik matriksini üreten ve salgılayan salgı hücreleridir. Kemik oluşumu sırasında yüksek oranda protein sentezini sürdürmek için, osteoblastlar sürekli bir amino asit arzı gerektirir. Bu talebi karşılamak için, osteoblastlar aktif olarak amino asitler edinmelidir. Bununla tutarlı olarak, son çalışmalar osteoblast aktivitesinde ve kemik oluşumunda amino asit alımının ve metabolizmasının önemini ortaya koymaktadır 15,16,17,18,19,20.
Osteoblastlar hücresel amino asitleri üç ana kaynaktan elde eder: hücre dışı ortam, hücre içi protein yıkımı ve de novo amino asit biyosentezi. Bu protokol, hücre dışı ortamdan amino asit alımının değerlendirilmesine odaklanacaktır. Amino asit alımını ölçmek için en yaygın yöntemler, radyoaktif etiketli (örneğin, 3H veya 14C) veya ağır izotop etiketli (örneğin, 13C) amino asitlere dayanır. Ağır izotopomer testleri, amino asit alımını ve metabolizmasını daha ayrıntılı ve güvenli bir şekilde analiz edebilir, ancak numunelerin hazırlanması ve türetilmesi bir gün sürdüğü için tamamlanması birkaç gün sürdüğü için tamamlanması daha fazla zaman alır ve numune sayısına bağlı olarak kütle spektrometresinde analiz etmek için birkaç gün sürer21,22. Buna karşılık, radyoaktif etiketli amino asit alım analizleri aşağı akış metabolizması hakkında bilgilendirici değildir, ancak ucuz ve nispeten hızlıdır, deneyin başlangıcından itibaren 2-3 saat içinde tamamlanabilir23,24. Burada, kültürlenmiş primer hücrelerde veya in vitro hücre hatlarında veya bireysel kemik şaftlarında radyoaktif işaretli amino asit alımını değerlendirmek için tasarlanmış kolayca değiştirilebilir bir temel protokolü ex vivo olarak tanımlamaktayız. Bu iki protokolün uygulanması, diğer radyoaktif etiketli amino asitlere ve diğer kemikle ilişkili hücre tiplerine ve dokularına genişletilebilir.

<table><tbody><tr><td>% 0.25 tripsin</td><td>Gibco</td><td>25200</td><td></td></tr><tr><td>12 oyuklu plaka</td><td>Corning</td><td>3513</td><td></td></tr><tr><td>1 mL şırınga</td><td>BD hassas</td><td>309628</td><td></td></tr><tr><td>30G İğne</td><td>BD hassas</td><td>305106</td><td></td></tr><tr><td>Arginin Monohidroklorür L- [2,3,4-3H] -, 1mCi</td><td>PerkinElmer</td><td>NET1123001MC</td><td></td></tr><tr><td>Beckman LS6500 sintilasyon sayacı</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Kalsiyum klorür</td><td>Sigma</td><td>C1016</td><td></td></tr><tr><td>Kolin klorür</td><td>Sigma</td><td>C7077</td><td></td></tr><tr><td>D-(+)-Glikoz çözeltisi</td><td>Sigma</td><td>G8769</td><td></td></tr><tr><td>Diseksiyon Aleti</td><td></td><td></td><td>Forseps, makas, scapels</td></tr><tr><td>DPBS</td><td>Gibco</td><td>14190</td><td></td></tr><tr><td>Etilendiamintetraasetik asit</td><td>Sigma</td><td>E9884</td><td></td></tr><tr><td>HEPES (1M)</td> <td>Gibco</td><td>15630</td><td></td></tr><tr><td>L- [3,4-3H (N)] -Glutamin</td><td>PerkinElmer</td><td>NET551250UC</td><td></td></tr><tr><td>Sıvı sintilasyon şişeleri</td><td>Sigma</td><td>Z190535</td><td></td></tr><tr><td>Lityum klorür çözeltisi, 8M</td><td>Sigma</td><td>L7026</td><td></td></tr><tr><td>Magnezyum klorür</td><td>Sigma</td><td>M8266</td><td></td></tr><tr><td>MEM ve alfa;</td><td>Gibco</td><td>12561</td><td></td></tr><tr><td>Mikrosantrifüj tüpü, 15 mL</td><td>Biotix</td><td>89511-256</td><td></td></tr><tr><td>NP-40 Sigma</td><td></td><td>492016</td><td></td></tr><tr><td>Potasyum klorür</td><td>Sigma</td><td>P3911</td><td></td></tr><tr><td>Sodyum bikarbonat</td><td>Sigma</td><td>S6014</td><td></td></tr><tr><td>Sodyum klorür</td><td>Sigma</td><td>S9888</td><td></td></tr><tr><td>Sodyum Deoksikolat</td><td>Sigma</td><td>D6750</td><td></td></tr><tr><td>Sodyum dodesil sülfat</td><td>Sigma</td><td>436143</td><td></td></tr><tr><td>Sonicator</td><td>Sonic& Malzemeler</td>: <td>VCX130</td><td></td></tr><tr><td>Tris Base</td><td>Sigma</td><td>648311</td><td></td></tr><tr><td>Ultima Gold (Sintilasyon çözeltisi)</td><td>PerkinElmer</td><td>6013329</td><td></td></tr><tr><td>&alfa;- (Metilamino)izobütirik asit</td><td>Sigma</td><td>M2383</td><td></td></tr></tbody></table>

kültürlenmiş kemik hücrelerinde ve İzole kemik Şaftlarında amino asit tüketiminin değerlendirilmesi

Evaluation of Amino Acid Consumption in Cultured Bone Cells and Isolated Bone Shafts

Kemik gelişimi ve homeostazı, kemik oluşturan osteoblastların farklılaşmasına ve aktivitesine bağlıdır. Osteoblast farklılaşması sırasıyla proliferasyon, ardından protein sentezi ve nihayetinde kemik matriksi sekresyonu ile karakterizedir. Proliferasyon ve protein sentezi, sürekli bir amino asit kaynağı gerektirir. Buna rağmen, osteoblastlarda amino asit tüketimi hakkında çok az şey bilinmektedir. Burada, radyoaktif etiketli amino asitleri kullanarak amino asit tüketimini ölçmek için tasarlanmış çok hassas bir protokolü açıklıyoruz. Bu yöntem, osteoblast proliferasyonu veya farklılaşması, ilaç veya büyüme faktörü tedavileri veya çeşitli genetik manipülasyonlarla ilişkili amino asit alımındaki değişiklikleri ölçmek için optimize edilmiştir. Önemli olarak, bu yöntem kültürlenmiş hücre hatlarında veya primer hücrelerde in vitro veya izole kemik şaftlarında ex vivo amino asit tüketimini ölçmek için birbirinin yerine kullanılabilir. Son olarak, yöntemimiz amino asitlerin herhangi birinin, glikozun ve diğer radyoaktif etiketli besin maddelerinin taşınmasını ölçmek için kolayca uyarlanabilir.

Amino asit taşınması, substrat özgüllüğü, kinetik ve iyon ve pH bağımlılığı25 dahil olmak üzere sayısız özelliğe dayanan farklı taşıma sistemlerine kategorize edilmiş birçok membrana bağlı amino asit taşıyıcısı tarafından düzenlenir. Örneğin, glutamin alımına Na + bağımlı taşıma sistemleri A, ASC, γ + L ve N veya Na + bağımsız Sistem L tarafından aracılık edilebilir. Na + bağımlı sistemler, Li + 'yı Na + (Sistem N) yerine koyma yeteneği veya a...

Bu protokol, birincil hücrelerde veya izole kemiklerde amino asit tüketimini değerlendirmek için yararlı olan radyoişaretli bir amino asit alım testi sunar.

Kültürlenmiş Kemik Hücrelerinde ve İzole Kemik Şaftlarında Amino Asit Tüketiminin Değerlendirilmesi

Bone development and homeostasis is dependent upon the differentiation and activity of bone forming osteoblasts. Osteoblast differentiation is ...

Amino asit alımı ve metabolizması, osteoblast spesifikasyonu, farklılaşması ve kemik oluşumu için gereklidir. Bu protokol, amino asit alımını değerlendirmek için hızlı ve hassas bir yöntem sağlar. Protokolümüz, amino asit alımını ölçmek için radyoaktif etiketli amino asitler kullanır.Farklı koşullar için kolayca değiştirilebilen ucuz, hassas ve hızlı bir yöntemdir. Bu protokol, çeşitli dokularda glikoz ve yağ asitleri gibi diğer radyoaktif etiketli besinlerin yanı sıra birincil veya dönüştürücü hücrelerin alımını değerlendirmek için kolayca değiştirilebilir. FBS, penisilin ve streptomisin ile desteklenmiş alfa MEM ortamında 12 kuyucuklu doku kültürü plakasının her bir kuyucuğundaki dördüncü ST2 hücrelerine beş kez 10 ila dördüncü ST2 hücresi amino asit alım plakasına başlamak için.Normalizasyonlar için koşul başına hücre sayısını ölçmek için hücrelerin ekstra kuyucuklarını plakalayın. Daha sonra, nemlendirilmiş bir hücre kültürü inkübatöründeki hücreleri, birleşene kadar iki ila üç gün boyunca% 5 karbondioksit ile% 37 santigrat derecede inkübe edin. Kuluçkadan sonra ortamı aspire edin ve hücreleri pH 7.4'te bir mililitre PBS ile iki kez yıkayın.Daha sonra hücreleri bir mililitre Krebs-Ringer'ın HEPES veya KRH ile bir kez yıkamadan önce PBS'yi aspire edin. Mililitre L34 tritiated glutamin çalışma ortamı başına dört mikrokür içeren 0.5 mililitre taze hazırlanmış KRH içeren hücreleri beş dakika boyunca inkübe edin. Kuluçka sonrası, sıvı atık kabına dağıtmak için radyoaktif ortamı toplayın.Daha sonra reaksiyonu sonlandırmak için hücreleri üç kez buz gibi soğuk KRH ile yıkayın. Daha sonra, her bir oyuğa bir mililitre% 1 sodyum dodesil sülfat ekleyin ve hücreleri lize etmek ve homojenize etmek için karışımı 10 kez tritüre edin. Daha sonra hücre lizatlarını 1.5 mililitrelik bir tüpe aktarın ve 10 dakika boyunca minimum 10.000 G hızında santrifüj yaparak lizatı netleştirin.Süpernatantı sekiz mililitre sintilasyon çözeltisi içeren bir sintilasyon şişesine aktarın ve sintilasyon sayacını kullanarak radyo aktivitesini ve dakika başına sayımları okuyun. Kalan radyoaktif olmayan hücre plakalarından, lize radyoaktif kültürlerdeki hücre sayısını tahmin etmek için hücreleri tripsinize edin, yeniden askıya alın ve sayın. Bir hemasitometre kullanarak, her deneysel durum için radyoaktif olmayan kuyu başına hücre sayısını sayın.Amino asit alımını belirlemek için, kemik milini tartmadan önce kemik iliğini kemikten temizleyin. Kemiği desellülarize etmek için, PBS'de bir humerusu 100 santigrat derecede 10 dakika kaynatın. Hem canlı hem de haşlanmış humeri'yi, hücre kültürü inkübatöründe 37 santigrat derecede 30 dakika boyunca bir mililitre KRH içinde dengeleyin.Daha sonra, deneysel ve haşlanmış kontrol kemiklerini, mililitre L234 trisiye arginin başına dört mikro köri içeren taze hazırlanmış KRH'de ayrı ayrı 37 santigrat derecede 90 dakikaya kadar inkübe edin. Radyoaktif ortamı çıkardıktan sonra, humerusu bir mililitre buz gibi soğuk KRH ile üç kez yıkayarak reaksiyonu sonlandırın. Her kemiği 500 mikrolitre RIPA Tamponu ile 1,5 mililitrelik bir tüpe aktarın.Daha sonra humerus ve RIPA Buffer'ı makasla 100 kez doğrayarak homojenleştirin, ardından% 35 genlikte sonikasyon ve 10 saniye boyunca bir saniye nabız izleyin. Lisat, oda sıcaklığında 10.000 kez G'de 10 dakika boyunca santrifüjleme ile berraklaştırıldı. Santrifüjleme sonrası, süpernatantın 200 mikrolitresini, sekiz mililitre sintilasyon çözeltisi içeren sintilasyon şişelerine aktarın.Parıltı sayacını kullanarak radyo etkinliğini okuyun. İn vitro L34 tritiated glutamin alımı ve konfluent ST2 hücrelerinin kinetik özellikleri, sodyum metil amino izobütirik asit veya lityum varlığında veya yokluğunda değerlendirildi. Sodyumun uzaklaştırılması, glutamin alımında% 90'lık bir azalmaya yol açtı.Lityumun varlığı, sodyum içermeyen duruma kıyasla glutamin alımını% 2 oranında arttırdı. Oysa metil amino izobütirik asit glutamin alımını etkilemedi. Sistem A, N, L veya ASC ve gama artı L'nin tahmin yüzdesi katkıları, çoğu glutamin alımının ASC sistemleri tarafından aracılık edildiğini ve gama artı L.Sistem N'nin kabaca% 2 sodyum bağımlı glutamin alımından sorumlu olduğunu göstermiştir.Ve sistem A% 0 katkı ve alım gösterdi. X-VIVO L34 haşlanmış ve canlı yenidoğan humerisinde tritiated arginin alımı iki saatlik bir süre boyunca analiz edildi. Arginin alımı deney boyunca doğrusal olarak artmış ve humeri yaşamıştır.Haşlanmış humeri, deneyde arginin alımında dinamik bir artış göstermedi. Temsili analiz, normalleştirilmiş ve düzeltilmiş arginin alımını gösterir. Kontralateral kemiğin aktif bir kontrol olarak kaynatılması önemlidir.Bu adım, kemik matrisi radyoaktif amino asitleri emebileceği ve yanlış sonuçlara neden olabileceği için gereklidir. Protokol, amino asit alım kinetiğini hem in vitro hem de in vivo olarak doğrulamamıza izin verdi.

evaluation-amino-acid-consumption-cultured-bone-cells-isolated-bone

Research

JoVE Journal

Medicine

Tıp

Bir faj gösterim kütüphanesi hedef kemiği de peptit dizileri tanımlamak için kullanılır oldu. Amacı, mezenkimal hücre farklılaşması, bu peptitler etkisini araştırmak ve kemik rejenerasyonu üzerindeki etkisini belirlemek için.

Bakteriyofaj Görüntüleme Kütüphane Peptitler Mezenkimal Hücreler Gen ekspresyonunu modüle ve Unicortical Kemik Hastalıkları Osteogenezi potansiyalize

Bu videoda, anyonik bir boya olan Alizarin Red S kullanılarak osteoblast tarafından salgılanan kalsiyum birikintilerinin tespiti için bir yöntem açıklıyoruz. Kültürlenmiş osteoblastlar önce boyanır ve daha sonra boya, kalsiyum birikintilerinin kolorimetrik miktar tayini veya osteoblast mineralizasyon derecesi için geri kazanılır.

İn Vitro Mineralizasyon Deneyi: Alizarin Red S Boyama ve Ekstraksiyonu ile Kemik Grefti İkamesi Üzerindeki Osteoblast Kalsiyum Birikintilerini Ölçmek İçin Kolorimetrik Bir Yöntem

Bu video, kemik iliğinden türetilmiş stromal hücreler tarafından amino asit alımını tahmin etmek için in vitro bir tekniği göstermektedir. Na+'ya bağımlı amino asit taşıyıcıları, hücrelerin içinde radyoaktif işaretli amino asitlerin alımına aracılık eder ve hücresel alım, radyoaktivite ölçülerek tahmin edilir.

Amino Asitlerin Hücresel Alımını Ölçmek için Radyoaktif İşaretli Amino Asit Alım Testi

Biz kemik klimalı ortam (BCM) hazırlamak ve in vitro faaliyetlerini testi nasıl burada açıklamak.

Kemik koşullu ortam: Hazırlama ve Biyo-

Uranyum kemik metabolizması etkilediği bilinmektedir. Burada, doğal uranyum pozlama etkisini canlılığı, farklılaşma ve Osteoklastlar, kemik rezorpsiyonu sorumlu hücrelerin fonksiyonlarını araştıran amaçlı bir iletişim kuralı mevcut.

Vitro Osteoclastogenesis üzerinde doğal uranyum etkileri analiz yöntemleri

Biz iki kemiğin insan hücre hatları ile yayımlanan veziküller mineraller durumunu karşılaştırmak için bir iletişim kuralı mevcut: hFOB 1.19 ve SAO'lar-2. Qafqaz profillerini Alizarin Red-boyama, ultraviyole (UV) ışık görselleştirme, transmisyon elektron mikroskobu (TEM) görüntüleme ve enerji dağıtıcı x-ışını microanalysis (EDX) tarafından S (AR-S) analiz edildi.

Mineraller hFOB 1.19 tarafından üretilen ve SAO'lar-2 hücreleri kullanarak transmisyon elektron mikroskobu ile enerji dağıtıcı x-ışını Microanalysis Analizi

Burada, hem fetal hem de yenidoğan aşamalarında uzun duvar kemiklerinin ex vivo kültürü için bir yöntem sunuyoruz, kontrollü koşullarda kemik ve kıkırdak gelişimini ve homeostazisini analiz etmek için uygun ve in vivo sürecini yeniden özetlemekteyiz.

Kültür ve ölçme fetal ve yenidoğan Murine uzun kemikler

Gerçek zamanlı hücre metabolik akısı testi, pH ve oksijen sensörlerini kullanarak mitokondriyal ve glikolitik adenozin trifosfat üretimine karşılık gelen oksijen tüketim oranını ve hücre dışı asitleşme oranını ölçer. Bu yazıda osteoblastların enerji durumunu ve hücresel biyoenerjetik durumun karakterizasyonu ve yorumlanmasını anlamak için bir yöntem açıklanmaktadır.

Osteoblast Biyoenerjetik Teknolojilerini İzlemek için Gerçek Zamanlı Hücre Metabolik Akı Analizörünü Kullanma

Burada, kalsiyum fosfat kaplı hücre kültürü plakaları kullanılarak rezorpsiyon çukuru testleri için basit ve etkili bir tahlil prosedürü sunuyoruz.

Osteoklastik Rezorpsiyonu In Vitro Görselleştirmek ve Ölçmek için Basit Bir Pit Tahlil Protokolü

Bu protokol, metakrilatlenmiş jelatin (GelMA) hidrojellerine gömülü insan osteositleri kullanılarak 3D kemik yapılarının üretilmesini ve decellularize ekstrasellüler matriks ile desteklenmesini açıklar. Yöntem düşük maliyetli, ölçeklenebilir ve temel laboratuvar ekipmanlarıyla uyumludur; bu da kas-iskelet hastalıkları süreçlerini incelemek için translasyonel bir platform sağlar.

Kas-iskelet hastalıklarının modellenmesi için insan osteositleri ve hücresizleştirilmiş ekstrasellüler matriks kullanan 3D kemik kültürü platformu

Öğrenin, radyoaktif amino asit alım ölçümü ile kemik hücrelerinde amino asit tüketimini değerlendirin. Bu hızlı ve duyarlı yöntem, osteoblast farklılaşması ve kemik metabolizması araştırmalarında kullanılır.

Kültürlenmiş Kemik Hücrelerinde ve İzole Kemik Şaftlarında Amino Asit Tüketiminin Değerlendirilmesi

Daha fazla video keşfet