Caenorhabditis elegans'ta Agrega Niceliğinin Otomatikleştirilmesi
October 14th, 2021
Aşağıdaki protokol, proteostazdaki değişikliklerin bir değerlendirmesi olarak poliglutamin agregalarını ölçmek için solucan kültürleme, floresan görüntüleme ve otomatik görüntü işleme için yüksek verimli bir iş akışının geliştirilmesini ve optimizasyonunu açıklamaktadır.
Poliglutamin agregasyonunu değerlendirerek ve yüksek verimli uygulamalar için kullanılabilecek bir çerçeve sağlayarak proteostazdaki değişiklikleri izlemek için basit bir yaklaşım benimsenmiştir. I tarafından agrega sayısı gibi bir fenotipin puanlanması öznel hale gelebilir. Toplam sayımını otomatikleştirmek, bu tür önyargıları ortadan kaldırmamıza, verimi ve tekrarlanabilirliği artırmamıza olanak tanır.
Bu yöntem, konakçı proteostaz bozulmasına katkıda bulunan bakteriyel genlerin tanımlanmasına yardımcı olur. Bireysel bakteri genlerinin katkısını anlamak, Alzheimer, Parkinson ve Huntington gibi hastalıkların patogenezindeki etkisini anlamamıza yardımcı olacaktır. Solucan içeren plakaları dondurucudan çıkararak ve oda sıcaklığında çözülmelerine izin vererek başlayın.
Ardından fazla yoğuşmayı silin ve görüntülemeden önce kapağı çıkarın. Görüntü yakalama sırasında pozlama süresi 500 milisaniye, 0,63 X kamera adaptörüyle 40 X büyütme ve GFP yoğunluğu %100 olarak ayarlanmış mikroskop ayarlarını kullanın. Şimdi, solucanlar karanlık arka plana kıyasla parlak bir şekilde aydınlatılmış görünene kadar iletilen ışık kontrollerini ayarlayın ve aşırı pozlamayı önleyin.
Solucanları nazikçe istenen konuma itmek için 10 mikrolitrelik bir pipet ucu kullanarak aşırı kümelenmeyi önlemek için solucanların kuyu içindeki konumlarını değiştirin. Her iki görüntü için de bir odak düzlemi oluşturmak üzere kanalı GFP filtresine ayarlayın. Parlak bir alan görüntüsü yakalayın.
Plakayı rahatsız etmeden veya mikroskopun odağını değiştirmeden karşılık gelen bir floresan görüntüsü alın. Şimdi görüntüleri değerlendirmek için önce CellProfiler'ı indirin. Yazılımı açın ve ilgilendiğiniz görüntüleri görüntüler kutusuna sürükleyip bırakın.
Açmak için dosya listesindeki resimlere tıklayın. İlgilenilen bir bölgeyi vurgulamak için büyüteç ve hem solucanların hem de agregaların uzunluğunu ölçmek için ok simgesini seçin. Ekranın alt kısmında görülebilen yoğunluk değerini belirlemek için fareyi istediğiniz nesnenin üzerine getirin.
CellProfiler görüntü analizi işlem hattını kullanmak için, CellProfiler'ı resmi web sitesinden indirdikten sonra görüntü çiftlerini metin el yazmasında açıklandığı gibi doğru bir şekilde adlandırın. İşlem hattını indirin ve dosyadan dosya, içeri aktarma ve işlem hattını seçerek CellProfiler'a yükleyin. Dolaşık olmayan solucanlar modülündeki solucanları tanımlamak için kullanılan bir eğitim kümesini yüklemek üzere ayarlarını açmak için dolaşık olmayan solucanlar modülünü seçin.
Ardından eğitim kümesi dosya adını tanımlayın. Dosya yükle simgesini seçin ve ek dosyayı da yükleyin. Sol üst köşedeki görüntüler modülünü seçerek görüntüleri yükleyin.
Ve sonra düzgün adlandırılmış görüntüleri sürükleyip bırakın. Görüntüleri analiz etmeden önce, programın sol alt köşesinin yakınında bulunan çıktı ayarları düğmesine tıklayarak sonuçları depolamak için kullanılacak istediğiniz çıktı klasörünü seçin. Ardından, istediğiniz çıktı konumunu seçmek için varsayılan çıktının sağındaki klasör simgesini seçin.
Görüntü analizine başlamak için görüntüleri analiz et simgesini seçin. Analizin tamamlanması çok uzun sürerse ve tek bir görüntüyü işlerken takılı kalırsa, çalıştırmayı iptal edin ve çıktı klasöründe sıralama yaparak ve hangi görüntü adının bulunamadığını not ederek işlenmemiş görüntüyü tanımlayın. Tam bir analizin ardından, yazılım sonuçları N sütunundaki tek tek solucanları ve K.CellProfiler'dan çıktı CSV dosyasındaki verileri rahatça düzenlemek için meta veri düzenleyicisini indirin sütunundaki ilgili toplama sayısını içeren bir Excel elektronik tablosunda düzenleyecektir.
Windows işletim sistemi için, indirilen dosyayı bulun ve istediğiniz konuma ayıklayın. gui_Windowsos_64x adlı ayıklanan klasörü bulun ve açın. Ve GUI uygulama simgesine tıklayarak uygulamayı başlatın.
Çalıştırmak için izin isteyen bir istem açılabilir. Daha fazla bilgi seçin ve ardından yine de çalıştır'a tıklayın. Meta veri düzenleyicisi artık CellProfiler çıktı CSV dosyalarını sürükleyip bırakmaya hazırdır.
Mac OS için, indirilen dosyayı bulun ve dosya meta veri düzenleyicisi uygulama dosyasını ayıklayın. İndirmelerde bulunan ayıklanmış klasörü açın. GUI uygulamasına sağ tıklayın ve Aç'ı seçin.
Resmi bir lisansın olmaması nedeniyle açılması için izin isteyen bir istem görünecektir. Aç'ı seçin. Meta veri düzenleyici uygulamanız ilgili işletim sisteminde açıldıktan sonra, dosyalarınızı buraya yükle'ye tıklayın veya istediğiniz CellProfiler CSV dosyalarını sürükleyip bırakın.
Kullanıcıyı dosyaları indir düğmesiyle yeni bir ekrana getirecek olan düzenle düğmesine tıklayın. Düğmeye tıklayın ve çıktı dosyasını kaydetmek için istediğiniz konumu seçin. Çıktı dosyası, dosya adına _organized uzantısı eklenmiş orijinal dosya adı olarak görünecektir.
FUDR varlığında, çeşitli bakterilerle beslenen solucanlar, daha düzgün ve doğru solucan tespitine izin veren ve böylece aşırı kalabalıklaşma sorununu çözen daha tutarlı bir vücut boyutuna sahipti. Solucanların dondurulması, arka plan floresansını ve manuel sayma ile karşılaştırılabilir otomatik sayma doğruluğunu ortadan kaldırarak poliQ agrega algılamasını geliştirdi. PoliQ YFP agregalarını görüntülemek için tüm C.elegans ve GFP kanalını algılamak için ters parlak alan aydınlatması kullanıldı.
Her solucan için solucan algılama, dolaşıklığı çözme ve toplama nicelemesi, tek tek solucan başına toplama sayısının elde edilmesini sağlayan iyileştirilmiş bir CellProfiler görüntü işleme işlem hattı uygulanarak yapılmıştır. Otomatik agrega niceliğinin etkinliği ile CellProfiler boru hattının kullanılması arasındaki fark minimumdu ve bu da otomatik yöntemin büyük ölçekli ekranlara uygulanabileceğini gösteriyordu. Test edilen 90 bakteri suşundan C.elegans bağırsağının bir adayla kolonizasyonu, agrega sayısında önemli bir azalma göstermiştir.
Manuel sayımla yapılan doğrulama deneyleri, agrega sayısını önemli ölçüde azaltan da dahil olmak üzere mutantların hiçbirinin poliQ toplamasını etkilemediğini ortaya koydu. Bu çerçeveyi kullanmaya karar veren araştırmacılar, özetlenen adımların mutlak olmadığını anlamalıdır. Modifikasyon ve CellProfiler'ın nasıl manipüle edileceğine dair temel bir anlayış başarı için gereklidir.
PolyQ agregasyonunu doğrulamak için batı lekelenmesi gibi ek biyokimyasal yaklaşımlar kullanılabilir.
Genel Bakış
Bu çalışma, solucanların kültürlenmesi, floresan görüntüleme ve proteostazdaki değişiklikleri ölçmek için poliglutamin agregalarını nicellemek amacıyla otomatik görüntü işleme için yüksek verimli bir iş akışı geliştirir. Bu yöntem, bu agregaların değerlendirmesini ve özellikle nörodejeneratif hastalıklardaki rollerinin araştırılmasını geliştirir.
Çalışmanın Temel Bileşenleri
Araştırma Alanı
- Proteostaz
- Nörodejeneratif hastalıklar
- Yüksek verimli tarama
Arka Plan
- Poliglutamin agregasyonu Alzheimer, Parkinson ve Huntington gibi hastalıklarla bağlantılıdır.
- Bakteriyel gen katkılarının proteostaz bozulmasına nasıl katkıda bulunduğunu anlamak esastır.
- Agregatlar için geleneksel puanlama yöntemleri öznel olabilir.
Kullanılan Yöntemler
- CellProfiler kullanılarak yüksek verimli görüntüleme ve analiz
- Biyolojik model olarak C. elegans
- Poliglutamin agregalarının otomatik nicellenmesi
Ana Sonuçlar
- Otomatik görüntü işleme, agrega sayımında önyargıların ortadan kaldırılmasını ve tekrarlanabilirliğin artmasını sağlar.
- Bakteryal genlerin konak proteostazını etkilediği ve solucan agrega sayılarında önemli bulgularla tanımlanmıştır.
- Doğrulanmış sonuçlar, otomasyonun büyük ölçekli taramalarda manuel sayıma benzer olduğunu gösterir.
Sonuçlar
- Bu çalışma, poliglutamin agregasyonu aracılığıyla proteostazı incelemek için güvenilir bir çerçeve sağlar.
- Bu yöntemden elde edilen bilgiler, nörodejeneratif hastalıklardaki mekanizmaları anlamak için önemlidir.
Sıkça Sorulan Sorular
Executive Industry Relevance
Automating aggregate quantification in C. elegans addresses the need for high-throughput, bias-free assessment of proteostasis in neurodegenerative disease models. By standardizing image acquisition and CellProfiler-based analysis, the method enables reproducible screening of large compound or genetic libraries. This supports early target validation and mechanistic de-risking in discovery pipelines for protein conformational diseases.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses by quantifying polyglutamine aggregation as a proxy for proteostasis disruption.
- Operational Value: Reduces subjectivity in phenotypic scoring, improving data reliability for target validation campaigns.
- Predictive Value: Supports portfolio triage by providing quantitative, reproducible readouts for mechanism-based compound prioritization.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates standardized, quantitative aggregate counts per worm, enabling robust assay readouts for screening campaigns.
- Operational Value: Increases throughput and reproducibility through automation, reducing manual labor and inter-operator variability.
- Assay Readiness: Produces structured output (Excel spreadsheet with worm and aggregate counts) compatible with downstream data analysis workflows.
Translational & Preclinical Research
- Translational Continuity: Links C. elegans proteostasis models to human neurodegenerative disease mechanisms via conserved polyQ aggregation pathways.
- Mechanistic De-risking: Facilitates identification of bacterial or genetic modifiers of aggregation, supporting target validation in disease-relevant systems.
- Predictive Confidence: Enables cross-functional teams to compare conditions using normalized, automated aggregate quantification.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the discovery continuum from target validation through lead identification, providing quantitative proteostasis readouts that inform go/no-go decisions.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing on proteostasis mechanisms by enabling objective, high-content aggregation phenotyping.
- Screening: Delivers assay-ready, standardized worm imaging and analysis compatible with 96-well or larger format screens.
- Analytics: Produces quantifiable dependent variable measurements (aggregates per worm) that allow statistical comparison across experimental conditions.
- Translational Research: Connects invertebrate model findings to human disease pathways through conserved aggregation biology.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable imaging and analysis pipeline adaptable to multiple proteostasis targets and screening campaigns.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in target validation by eliminating bias from manual aggregate counting.
- Operational Value: Enhances reproducibility and scalability through standardized image processing and automated data output.
- Strategic Value: Improves capital efficiency by enabling large-scale screens with reduced hands-on time and higher data quality.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted advancement decisions through reliable, quantitative proteostasis biomarkers.
Implementation Considerations
- Requires familiarity with fluorescence microscopy and GFP/YFP imaging parameters for polyQ detection.
- Depends on CellProfiler software and associated pipeline configuration for automated worm and aggregate segmentation.
- Necessitates standardized image naming and folder organization for successful batch processing.
- Benefits from FUDR treatment to reduce worm size variability and improve detection accuracy in high-density wells.
- Relies on user training to adapt the pipeline for different worm strains, expression patterns, or imaging setups.
