Name: Caenorhabditis elegansta Agrega Niceliğinin Otomatikleştirilmesi (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-10-14T14:45:00.000+00:00
Duration: 7 min 50 s
Description: Öğrenin, C. elegans'ta poliglutamin agregalarını otomatik sayım yöntemiyle nicelendirmeyi. Bu yüksek verimli görüntüleme tekniği, proteostaz değişikliklerini inceleyerek nörodejeneratif hastalıklardaki mekanizmaları anlamaya yardımcı olur.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Bu çalışma, Ulusal Sağlık Enstitüleri (1RO3AG069056-01) ve DMC'ye fon sağlayan Amerika Bulaşıcı Hastalıklar Derneği tarafından desteklenmiştir. Fon verenlerin çalışma tasarımı, veri toplama ve analizi, yayınlama kararı veya makalenin hazırlanmasında hiçbir rolü yoktu. Czyz Lab üyelerine makaleyi düzelttikleri için teşekkür ederiz. Karikatür figürleri BioRender ücretli lisansı kullanılarak oluşturulmuştur.

<ol><li>Soto, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Unfolding+the+role+of+protein+misfolding+in+neurodegenerative+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Unfolding the role of protein misfolding in neurodegenerative diseases.</a> Nature Reviews Neuroscience. 4 (1), 49-60 (2003).</li>
<li>Fang, P., Kazmi, S. A., Jameson, K. G., Hsiao, E. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+microbiome+as+a+modifier+of+neurodegenerative+disease+risk%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Host+%26+Microbe%22%5BJournal%5D)">The microbiome as a modifier of neurodegenerative disease risk.</a> Cell Host & Microbe. 28 (2), 201-222 (2020).</li>
<li>Kundu, P., Blacher, E., Elinav, E., Pettersson, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Our+gut+microbiome%3A+The+evolving+inner+self%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Our gut microbiome: The evolving inner self.</a> Cell. 171 (7), 1481-1493 (2017).</li>
<li>Sherwin, E., Dinan, T. G., Cryan, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recent+developments+in+understanding+the+role+of+the+gut+microbiota+in+brain+health+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Annals+of+the+New+York+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">Recent developments in understanding the role of the gut microbiota in brain health and disease.</a> Annals of the New York Academy of Sciences. 1420 (1), 5-25 (2018).</li>
<li>Mondal, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Large-scale+microfluidics+providing+high-resolution+and+high-throughput+screening+of+Caenorhabditis+elegans+poly-glutamine+aggregation+model%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Large-scale microfluidics providing high-resolution and high-throughput screening of Caenorhabditis elegans poly-glutamine aggregation model.</a> Nature Communications. 7 (1), 13023(2016).</li>
<li>Guisbert, E., Czyz, D. M., Richter, K., McMullen, P. D., Morimoto, R. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+a+tissue-selective+heat+shock+response+regulatory+network%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Genetics%22%5BJournal%5D)">Identification of a tissue-selective heat shock response regulatory network.</a> PLoS Genetics. 9 (4), 1003466(2013).</li>
<li>Silva, M. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+genetic+screening+strategy+identifies+novel+regulators+of+the+proteostasis+network%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Genetics%22%5BJournal%5D)">A genetic screening strategy identifies novel regulators of the proteostasis network.</a> PLoS Genetics. 7 (12), 1002438(2011).</li>
<li>Nollen, E. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-wide+RNA+interference+screen+identifies+previously+undescribed+regulators+of+polyglutamine+aggregation%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Genome-wide RNA interference screen identifies previously undescribed regulators of polyglutamine aggregation.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101 (17), 6403-6408 (2004).</li>
<li>Walker, A. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Colonization+of+the+Caenorhabditis+elegans+gut+with+human+enteric+bacterial+pathogens+leads+to+proteostasis+disruption+that+is+rescued+by+butyrate%5BTitle%5D)+AND+%22PLOS+Pathogens%22%5BJournal%5D)">Colonization of the Caenorhabditis elegans gut with human enteric bacterial pathogens leads to proteostasis disruption that is rescued by butyrate.</a> PLOS Pathogens. 17 (5), 1009510(2021).</li>
<li>Goya, M. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Probiotic+Bacillus+subtilis+protects+against+%CE%B1-Synuclein+aggregation+in+C.+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Probiotic Bacillus subtilis protects against α-Synuclein aggregation in C. elegans.</a> Cell Reports. 30 (2), 367-380 (2020).</li>
<li>Kumsta, C., Chang, J. T., Schmalz, J., Hansen, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hormetic+heat+stress+and+HSF-1+induce+autophagy+to+improve+survival+and+proteostasis+in+C.+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Hormetic heat stress and HSF-1 induce autophagy to improve survival and proteostasis in C. elegans.</a> Nature Communications. 8, 14337(2017).</li>
<li>Prahlad, V., Morimoto, R. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuronal+circuitry+regulates+the+response+of+Caenorhabditis+elegans+to+misfolded+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Neuronal circuitry regulates the response of Caenorhabditis elegans to misfolded proteins.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108, 14204-14209 (2011).</li>
<li>Mohri-Shiomi, A., Garsin, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Insulin+signaling+and+the+heat+shock+response+modulate+protein+homeostasis+in+the+Caenorhabditis+elegans+intestine+during+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Insulin signaling and the heat shock response modulate protein homeostasis in the Caenorhabditis elegans intestine during infection.</a> Journal of Biological Chemistry. 283 (1), 194-201 (2008).</li>
<li>Hakim, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((WorMachine%3A+machine+learning-based+phenotypic+analysis+tool+for+worms%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Biology%22%5BJournal%5D)">WorMachine: machine learning-based phenotypic analysis tool for worms.</a> BMC Biology. 16 (1), 8(2018).</li>
<li>Wählby, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+image+analysis+toolbox+for+high-throughput+C.+elegans+assays%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">An image analysis toolbox for high-throughput C. elegans assays.</a> Nature Methods. 9 (7), 714-716 (2012).</li>
<li>Jones, T. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CellProfiler+Analyst%3A+data+exploration+and+analysis+software+for+complex+image-based+screens%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">CellProfiler Analyst: data exploration and analysis software for complex image-based screens.</a> BMC Bioinformatics. 9 (1), 482(2008).</li>
<li>CellProfiler: an open-source image analysis software. , Available from: 
 <a target="_blank" href="http://www.cellprofiler.org">http://www.cellprofiler.org</a> (2021).</li>
<li>Held, K., Ramage, E., Jacobs, M., Gallagher, L., Manoil, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sequence-verified+two-allele+transposon+mutant+library+for+Pseudomona+aeruginosa+PA01%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Bacteriology%22%5BJournal%5D)">Sequence-verified two-allele transposon mutant library for Pseudomona aeruginosa PA01.</a> Journal of Bacteriology. 194 (23), 6387-6389 (2012).</li>
<li>Schulenburg, H., Ewbank, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+genetics+of+pathogen+avoidance+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Microbiology%22%5BJournal%5D)">The genetics of pathogen avoidance in Caenorhabditis elegans.</a> Molecular Microbiology. 66 (3), 563-570 (2007).</li>
<li>Feldman, N., Kosolapov, L., Ben-Zvi, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorodeoxyuridine+improves+Caenorhabditis+elegans+proteostasis+independent+of+reproduction+onset%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Fluorodeoxyuridine improves Caenorhabditis elegans proteostasis independent of reproduction onset.</a> PLoS One. 9 (1), 85964(2014).</li>
<li>Van Raamsdonk, J. M., Hekimi, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((FUdR+causes+a+twofold+increase+in+the+lifespan+of+the+mitochondrial+mutant+gas-1%5BTitle%5D)+AND+%22Mechanisms+of+Ageing+and+Development%22%5BJournal%5D)">FUdR causes a twofold increase in the lifespan of the mitochondrial mutant gas-1.</a> Mechanisms of Ageing and Development. 132 (10), 519-521 (2011).</li>
<li>Haldimann, P., Muriset, M., Vígh, L., Goloubinoff, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+novel+hydroxylamine+derivative+ng-094+suppresses+polyglutamine+protein+toxicity+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">The novel hydroxylamine derivative ng-094 suppresses polyglutamine protein toxicity in Caenorhabditis elegans.</a> Journal of Biological Chemistry. 286 (21), 18784-18794 (2011).</li>
<li>Shinn-Thomas, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Wrapping+culture+plates+with+Parafilm+M%C2%AE+increases+Caenorhabditis+elegans+growth%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Research+Notes%22%5BJournal%5D)">Wrapping culture plates with Parafilm M® increases Caenorhabditis elegans growth.</a> BMC Research Notes. 12 (1), (2019).</li>
<li>Alexander-Floyd, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Unexpected+cell+type-dependent+effects+of+autophagy+on+polyglutamine+aggregation+revealed+by+natural+genetic+variation+in+C.+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Biology%22%5BJournal%5D)">Unexpected cell type-dependent effects of autophagy on polyglutamine aggregation revealed by natural genetic variation in C. elegans.</a> BMC Biology. 18 (1), 18(2020).</li>
<li>Moronetti Mazzeo, L. E., Dersh, D., Boccitto, M., Kalb, R. G., Lamitina, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stress+and+aging+induce+distinct+polyQ+protein+aggregation+states%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Stress and aging induce distinct polyQ protein aggregation states.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (26), 10587-10592 (2012).</li>
<li>Sink, R., Gobec, S., Pecar, S., Zega, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((False+positives+in+the+early+stages+of+drug+discovery%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Medicinal+Chemistry%22%5BJournal%5D)">False positives in the early stages of drug discovery.</a> Current Medicinal Chemistry. 17 (34), 4231-4255 (2010).</li>
</ol>

Yazarlar çıkar çatışması olmadığını beyan etmişlerdir.

Açıklanan protokol, açık kaynaklı bir görüntü analiz yazılımı olan CellProfiler'ı içeren C. elegans kültürleme, görüntüleme ve görüntü işleme prosedürlerini özetlemektedir. Temsili sonuçlar tekrarlanabilirliği, önyargının azaltılmasını ve ölçeklenebilirliği gösterir. Bu standartlaştırılmış prosedür, büyük bakteriyel, genomik veya ilaç kütüphanelerinde kullanılan tarama stratejilerini geliştirecektir. Diğer otomatik C. elegans nesne algılama yöntemleri mevcut olsa da, açıklanan teknik, kültürleme, görüntü alma ve analizi entegre eden standartlaştırılmış, daha yüksek verimli bir boru hattı sunar.
Burada açıklanan protokolü optimize etmek için solucan yetiştiriciliğinin çeşitli varyasyonlarının test edilmesi gerekiyordu. Başlangıçta, solucanlar yaş senkronizasyonundan hemen sonra örnek bakterilere aktarıldı (L1 aşaması). Bununla birlikte, böyle bir yaklaşım, aynı kuyudaki solucanlar arasında bile, değişken boyutlarda bir solucan popülasyonu ile sonuçlandı. C. elegans, patojen kaçınma19 ile bilinir, bu da boyuttaki gözlemlenen değişkenliğe katkıda bulunmuş olabilir ve sonuçta özellikle aşağı akış görüntüleme-solucan tespitini etkileyebilir. Bu değişkenliği ortadan kaldırmak için, her kuyucuktaki tüm NGM alanı test bakterileri ile kaplandı. Ayrıca, solucanlar E. coli OP50 ile beslendi ve 25 ° C'de 48 saat boyunca genç yetişkinlere tamamen gelişmesine izin verildi. Solucanların test bakterilerine aktarılmadan önce E. coli OP50'de yetişkinliğe ulaşmalarına izin vermek, daha tutarlı vücut büyüklüğü ile sonuçlandı. Ek olarak, aşırı kalabalık ve döl tarafından hızlı gıda tükenmesi, NGM agarının FUDR ile takviye edilmesiyle ortadan kaldırılmıştır. FUDR'nin uygulanması, ebeveyn popülasyonuyla karışan soy tarafından gizlenen döl ve gelişmiş otomatik solucan tanımlamasını ortadan kaldırdı. Bununla birlikte, FUDR kullanırken dikkatli olmak ve uygun kontrolleri kullanmak önemlidir, çünkü bileşiğin C. elegans proteostazını ve ömrünü20,21 etkilediği bilinmektedir. Bu protokolde açıklanan koşullar altında, FUDR bağırsak poliQ agregasyonunu etkilememiştir (Ek Şekil 5); bu nedenle, kullanımı tarif edilen yönteme uygun ve faydalıydı.
Görüntülemeden önce numunelerin dondurulması, boru hattının başarılı bir şekilde kullanılmasında kritik bir adım olduğu ortaya çıktı. Donmadan önceki toplam sayımlar manuel sayımlardan anlamlı derecede yüksekti (Şekil 3B). Görüntülemeden önce solucanları 18-48 saat boyunca -20 ° C'de tutmak, arka plan floresansını azalttı ve sonuçta agrega algılamasını geliştirdi (Şekil 3A). Donmanın agrega tespiti üzerindeki etkileri sadece poliQ için araştırılmıştır ve bu tür etkiler daha fazla araştırılmadan diğer modellere genelleştirilmemelidir.
Tüm koşulların aynı tutulmasına rağmen, solucan başına ortalama agrega sayısının farklı koşular arasında değişebildiği, OP50 ile kolonileştirilen hayvanlardaki agrega sayısı ile MPAO1 arasındaki oranın tutarlı kaldığı gözlenmiştir (Şekil 6, Ek Şekil 2, Ek Şekil 5). Bu nedenle, her çalıştırmada her zaman E. coli OP50 kontrolünü veya herhangi bir ek uygun referans kontrolünü dahil etmek önemlidir. Deneyler arasındaki toplam sayımlardaki bu değişkenlik, çevresel koşullardan (sıcaklık, nem) 22,23 veya genetik arka plandan etkilenebilir8. Aslında, uzun süreli kültürden sonra, bağırsak floresansının büyük ölçüde azaldığı veya tamamen kaybolduğu, bunun da donmuş stoktan yeni bir suşun çözülmesini gerektirdiği gözlenmiştir. Floresanda gözlenen azalma, poliQ'yu ifade edenler gibi toksik transgenleri baskılayan genetik değişikliklerin bir sonucu olabilir. Bununla birlikte, farklı deneyciler arasında (Ek Şekil 2), biyolojik replikasyonlar arasında (Şekil 5) ve aynı örneklem içinde (Ek Şekil 3) gözlemlenen sonuçların istisnai tekrarlanabilirliği bu yaklaşımın gücünü vurgulamaktadır.
Çok sayıda rapor, proteostaz9,11,12,13,24,25'i incelemek için bağırsak poliQ'sunu kullanmıştır. Ancak deneysel yaklaşımlar ve okuma yöntemleri arasındaki değişkenlik nedeniyle sonuçlar arasında doğrudan bir karşılaştırma yapılamamaktadır. Bununla birlikte, daha önce yayınlanmış verilerden elde edilen birkaç sonuç, burada açıklanan otomatik niceleme ile özetlenmiştir, buna 9,13 agregasyonunun bakteriyel indüksiyonu ve karşılaştırılabilir sayıda agrega 11 dahildir. Toplu olarak, tarif edilen boru hattı proteostazı incelemek için değerli bir araç sunmaktadır.
Burada açıklanan yöntemin bazı doğal zorlukları vardır. Örneğin, bu protokolün tüm bileşenlerine hakim olmak için yeterli zaman gerekir, bu da özellikle protokolün 8. bölümü için geçerlidir, bu da elde edilen görüntülerin işlem hattı analizi için uygun olup olmadığını belirlemek için tahlil hakkında bilgi gerektirir. Bu protokolde kullanılan görüntü yakalama ayarlarından sapmalar mümkündür; ancak, ayarların ve solucan eğitim kümesinin değiştirilmesi gerekebilir. Bu işlem hattı, çeşitli boyutlardaki agregaları ve dokunaklı olanları ayırt edebilir, bu da agregaların "harmanlanmasını" sınırlar ve sonuçta algılama hassasiyetini arttırır. Ancak, kabul edilen boyut aralığını aşan büyük toplamaları tanımlamaya çalışırken sorunlar ortaya çıkabilir, çünkü üst boyut eşiğinin genişletilmesi, dokunulan toplamaların ayırt edilememesi gibi zayıf tanımlamanın neden olduğu hatalara neden olabilir. Görüntü analizinden önce doğruluk, boyut ve yoğunluk arasında bir denge bulunmalıdır. Aggregate tanımlamanın verimliliği, agrega algılamayı geliştirebilen bir sinir ağı oluşturmak için makine öğrenimini dahil ederek daha da geliştirilebilir. Bu tür iyileştirmeler şu anda araştırılmaktadır ve farklı odak düzlemlerinde bulunan veya anormal şekillere sahip agregaların tespiti gibi mevcut sorunların ele alınmasında büyük ölçüde yardımcı olacaktır.
Tarif edilen yöntemin dikkate değer bir zayıflığı, otomatik agrega sayımlarındaki değişkenliktir, çünkü bunlar her zaman farklı bakteri suşlarıyla beslenen solucanlarda manuel sayımlarla özetlenmez. Örneğin, otomatik sayımlara dayanarak, P. aeruginosa mutant 53 (M53) ile beslenen solucanlar, vahşi tip suşa (MPAO1) kıyasla önemli ölçüde daha az agregaya sahipti (Şekil 7); Bununla birlikte, isabetin doğrulanması anlamlı bir fark göstermedi (Ek Şekil 4). Genel olarak, yüksek verimli ilaç ekranları yüksek oranda yanlış pozitif isabet tespitine sahiptir ve açıklanan yöntem istisna değildir26. Bu nedenle, tüm potansiyel isabetleri doğrulamak protokolün kritik bir parçasıdır.
Bu protokol, konakçı proteostazını etkileyen bakterileri tanımlamak için bir tarama stratejisine uyacak şekilde optimize edilmiş olsa da, her adım genomik RNAi kütüphanelerinin, küçük moleküllerin veya diğer koşulların etkisini test etmek için daha da değiştirilebilir. Her adımda, belirli bir tarama stratejisinin gereksinimlerine uyacak şekilde ek değişiklikler yapılabilir. Ayrıca, bu teknik, her adımın belirli bir modele uyacak şekilde optimize edilmesini sağlayan bir esneklik düzeyi sağlar. Örneğin, bu yaklaşım diğer dokularda poliQ agregasyonuna veya indüklenebilir floresan muhabirleri (örneğin, ısı şoku genleri) kullanarak gen ekspresyonunu izlemek, proteinlerin hücre altı lokalizasyonunu değerlendirmek (örneğin, DAF-16'nın nükleer lokalizasyonu), diğer hastalık modellerinde (Aβ 1-42, α-sinüklein,TDP-43, vb.) agregasyonu incelemek veya fizyolojik fenotipleri değerlendirmek gibi görüntülerde tespit edilen diğer özelliklerin çıkarılmasına genişletilebilir. solucan boyutu gibi.

Alzheimer, Parkinson ve Huntington hastalıkları veya amiyotrofik lateral skleroz gibi yaşa bağlı nörodejeneratif protein konformasyonel hastalıkları (PCD'ler), agregasyona, hücre ölümüne ve doku dejenerasyonuna yol açan protein yanlış katlanması ile karakterizedir1. Protein yanlış katlanması suçlu olarak kabul edilirken, bu hastalıkların etiyolojisi açık değildir. Bu nedenle, etkili tedavilerin geliştirilmesi, hastalığın başlangıcına ve ilerlemesine katkıda bulunan faktörler ve koşullar hakkında bilgi eksikliği nedeniyle engellenmiştir. Son zamanlarda yapılan çalışmalar, mikrobiyomdaki değişikliklerin PCD'lerin başlangıcını, ilerlemesini ve şiddetini etkilediğini göstermektedir 2,3,4. Bununla birlikte, insanın, hatta murinin mikrobiyomunun karmaşıklığı, mikropların konakçıları üzerindeki kesin etkisini ortaya çıkaracak çalışmalar yapmayı zorlaştırmaktadır. Bu nedenle, Caenorhabditis elegans gibi daha basit organizmalar genellikle bir keşif aracı olarak kullanılır 5,6,7,8. Son zamanlarda yapılan çalışmalarda C. elegans, bakterilerin konakçı proteostazı ve hastalık patogenezi üzerindeki etkisini araştırmak için kullanılmıştır 9,10. Bakteriyel kolonizasyon, hormesis ve genomik değişiklikler, poliglutamin (poliQ) yollarının toplanmasını etkileyen örnek durumlar arasındadır 9,11,12. Ek olarak, bu yanlış katlanmış protein kümeleri, konakçı içinde poliQ uzunluğu ve yaşa bağlı birikim sergiler ve bozulmuş motiliteyle ilişkilidir 9,13. Floresan olarak etiketlenmiş puncta'yı ölçmenin nispeten basit bir yaklaşımı, protein katlanmasını ve toplanmasını etkileyen koşullar, faktörler veya ilaçlar hakkında önemli veriler üretebilir.
Floresan punktanın nicelleştirilmesinin güvenilir ve nispeten basit bir prosedür olduğu kanıtlanmış olsa da, protein agregasyonunu etkileyen bileşiklerin, bakterilerin veya koşulların büyük ölçekli taranmasını kolaylaştıracak bir protokol geliştirmek için zorluk devam etmektedir. Otomatik C. elegans görüntü işleme ve puncta niceleme kavramı tamamen yeni değildir, çünkü bir dizi pratik destek aracı geliştirilmiştir14,15. Bununla birlikte, kültürleme, görüntü alma ve bir işleme boru hattının entegrasyonu, sonuçlardaki değişkenliği ortadan kaldırmak ve daha yüksek verimli ekranlara izin vermek için çok önemlidir.
Bu nedenle, bu makalenin amacı, proteostazdaki değişiklikleri tespit etmek için bir vekil olarak C. elegans'ta poliQ agregasyonunu ölçmek için kullanılan prosedürü standartlaştırmaktır. Bu görev, otomatik solucan ve toplu tanımlama yeteneğine sahip açık kaynaklı bir görüntü analiz yazılımıolan 16 olan CellProfiler kullanılarak gerçekleştirildi ve solucanları kültürlemek, görüntü almak ve verileri işlemek için daha büyük bir protokole entegre edildi.

<table><tbody><tr><td>1.7 mL Mikrotüpler</td><td>Olympus Plastics</td><td>Cat # 24-282</td><td>Mikrosantrifüj tüpleri</td></tr><tr><td>10 mL Serolojik Pipetler</td><td>GenClone</td><td>Cat # 12-104</td><td>Plastik pipetler</td></tr><tr><td>15 mL Santrifüj Tüpleri, Raflı</td><td>Olympus Plastics</td><td>Cat # 28-101</td><td>Konik tüpler</td></tr><tr><td>5-Floro-2 & prime;-deoksiüridin</td><td>Fisher Scientific</td><td>D2235100MG</td><td>FUDR</td></tr><tr><td>Accu-jet Pro Pipet Kontrol Cihazı</td><td>Genesee Scientific</td><td>91-600RB</td><td>Pipet tabancası</td></tr><tr><td>Agar</td><td>Fisher Scientific Cat</td><td>#BP1423-2</td><td>Granül agar</td></tr><tr><td>BioRender</td><td>BioRender</td><td></td><td>Grafiksel şekil üreteci</td></tr><tr><td>Çamaşır Suyu (Normal)</td><td>Clorox</td><td>Bar# 044600324111, Sıçramasız Çamaşır Suyu</td><td>%4,5 sodyum hipoklorit</td></tr><tr><td>C. elegans: AM140: rmIs132 [unc-54p::q35::yfp]</td><td>Morimoto Laboratuvarı (Northwestern Üniversitesi)</td><td>AM140, Q35::YFP</td><td>Kas poliQ</td></tr><tr><td>C elegans: AM738: rmIs297[vha-6p:: q44::yfp; rol-6(su1006)]</td><td>Morimoto Lab (Northwestern Üniversitesi)</td><td>AM738, Q44::YFP</td><td>Bağırsak poliQ</td></tr><tr><td>CaCl2&middot; 2H2O</td><td>Fisher Scientific</td><td>Cat#C79-500</td><td>Kalsiyum klorür dihidrat</td></tr><tr><td>CellProfiler</td><td>Broad Institute</td><td></td><td>Görüntü analiz yazılımı</td></tr><tr><td>Kolesterol</td><td>Fisher Scientific Cat</td><td>#ICN10138201</td><td>Kolesterol</td></tr><tr><td>Sirkülasyonlu Su Banyosu Başlığı</td><td>Lauda</td><td>26LE</td><td>Lauda E 100</td></tr><tr><td>CoolLED pE300lite 365 dir montajlı STEREO</td><td>CoolLED</td><td>8114931</td><td>Floresan ışık kontrolü ve yayıcı</td></tr><tr><td>16 mL Kültür Tüpleri</td><td>Olympus Plastics</td><td>21-129</td><td>Kültür tüpleri, 17 mm x 100 mm</td></tr><tr><td>Escherichia coli OP50</td><td>Caenorhabdit Genetik Merkezi</td><td>OP50</td><td>E. coli kontrol suşu</td></tr><tr><td>Etanol, 200 Kanıt</td><td>Decon Labs, Inc.</td><td>2701</td><td></td></tr><tr><td>Mercek 10x/23B, ayarlanabilir, 3d nesil</td><td>Leica Microsystems</td><td>10450910</td><td>Mercek seti</td></tr><tr><td>Filtre Seti ET GFP - MZ10F</td><td>Leica Microsystems</td><td>10450588</td><td>Filtre küpü</td></tr><tr><td>GraphPad Prism v9.2.0</td><td>GraphPad Software, Inc.</td><td></td><td>İstatistiksel analiz aracı</td></tr><tr><td>Heratherm İnkübatör IMP180</td><td>Termo</td><td>51031562</td><td>Soğutmalı inkübatör</td></tr><tr><td>Innova 4000</td><td>New Brunswick Scientific</td><td>M1192-0000</td><td>Çalkalama inkübatörü</td></tr><tr><td>K5 Kamera</td><td>Leica Microsystems</td><td>11547112</td><td>Stereomikroskop kamera</td></tr><tr><td>KH2P04</td><td>Fisher Scientific</td><td>Cat#P285-3</td><td>Potasyum fosfat monobazik</td></tr><tr><td>LAS X Görüntüleme Yazılımı</td><td>Leica Microsystems</td><td></td><td>Mikroskop görüntüleme yazılımı</td></tr><tr><td>Leica MZ10 F Optik Taşıyıcı</td><td>Leica Microsystems</td><td>10450103</td><td>Stereomikroskop</td></tr><tr><td>Levamizol</td><td>Fisher Scientific Cat</td><td>#0215522805</td><td>Levamizol hidroklorür</td></tr><tr><td>Luria Suyu (Lennox)</td><td>Apex Bioresearch Products</td><td>Kedi# 11-125</td><td>LB</td></tr><tr><td>Manyetik Karıştırma Plakası</td><td>Fisher Scientific</td><td>11-100-49S</td><td>Karıştırma plakası</td></tr><tr><td>MgSO4 & middot; 7H<>sub2O</td><td>Alfa Aesar</td><td>A14491</td><td>Magnezyum sülfat heptahidrat</td></tr><tr><td>Mikroskop Slaytları</td><td>Premiere</td><td>8205</td><td>Tek buzlu mikroskop slaytları</td></tr><tr><td>Na2HPO4&middot; 7H2O</td><td>Fisher Bilimsel</td><td>Kedi # S373-500</td><td>Sodyum fosfat dibazik heptahidrat</td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Fisher Bilimsel Kedi</td><td># S671-500</td><td>Sodyum klorür</td></tr><tr><td>NaOH</td><td>Fisher Bilimsel</td><td>Kedi # S318-3</td><td>Sodyum hidroksit peletleri</td></tr><tr><td>Objektif Akromat, f = 100 mm</td><td>Leica Microsystems</td><td>10411597</td><td>Objektif mikroskop lensi</td></tr><tr><td>Petri Kapları</td><td>Genesee Scientific</td><td>Cat # 32-107G</td><td>100 mm x 15 mm</td></tr> <tr><td>Pseudomonas aeruginosa Mutant Kütüphanesi</td><td>Manoil Lab (Washington Üniversitesi)</td><td></td> <td>P. aeruginosa Mutant</td></tr><tr><td>Kütüphanesi Süspansiyon Kültür Plakası 24 Kuyulu, Düz Tabanlı</td><td>Olympus Plastics</td><td>25-102</td><td>Solucan büyümesi ve görüntüleme için kullanılır</td></tr><tr><td>Trinoküler Tüp %100 M-serisi</td><td>Leica Mikrosistemler</td><td>10450043</td><td></td></tr><tr><td>Triptikaz Pepton</td><td>ThermoFisher, Difco</td><td>Cat # 211921</td><td></td></tr><tr><td>TX-400 Rotor</td><td>Thermo Scientific</td><td>Cat # 75003181</td><td>Salıncak kova rotoru</td></tr><tr><td>Vakum Tahrikli Filtre Sistemi</td><td>GenClone</td><td>Cat # 25-227</td><td>500 mL, PES Membran, .22 ve mikro; C</td></tr><tr>Montajlı <td>Leica Microsystems</td><td>10447367</td><td>0.63x kamera adaptör tüplü</td> m<td>Video Objektifi</td></tr></tbody></table>

caenorhabditis elegans'ta agrega niceliğinin otomatikleştirilmesi

Automating Aggregate Quantification in Caenorhabditis elegans

Nörodejeneratif protein konformasyonel hastalıklarının (PCD'ler) prevalansındaki artış, yıllar içinde bu konuya büyük bir ilgi uyandırmıştır. Bu artan dikkat, PCD'li insanlarda gözlenen hastalık fenotiplerini çoğaltabilen hayvan modellerinin çeşitlendirilmesi ve iyileştirilmesi çağrısında bulunmuştur. Murin modellerinin paha biçilmez olduğu kanıtlanmış olsa da, pahalıdır ve zahmetli, düşük verimli yöntemlerle ilişkilidir. PCD'leri incelemek için Caenorhabditis elegans nematod modelinin kullanılması, yüksek verimli uygulamalara izin veren göreceli bakım kolaylığı, düşük maliyet ve hızlı üretim süresi ile gerekçelendirilmiştir. Ek olarak, C. elegans ve insan genomları arasındaki yüksek koruma, bu modeli paha biçilmez bir keşif aracı haline getirmektedir. Floresan etiketli dokuya özgü poliglutamin (poliQ) yollarını eksprese eden nematodlar, floresan odaklarla karakterize edilen yaşa ve poliQ uzunluğuna bağlı agregasyon sergiler. Bu tür muhabirler genellikle dokulardaki proteostazdaki değişiklikleri izlemek için vekil olarak kullanılır. Manuel agrega ölçümü zaman alıcıdır ve deneysel verimi sınırlar. Ayrıca, manuel odakların nicelleştirilmesi, toplam tanımlama oldukça öznel olabileceğinden, önyargıya neden olabilir. Burada, solucan kültürleme, görüntü toplama ve veri işlemeden oluşan bir protokol, bağırsağa özgü poliQ'yu eksprese eden C. elegans kullanılarak yüksek verimli agrega nicelemesini desteklemek için standartlaştırılmıştır. Bir görüntü analiz yazılımı olan CellProfiler'ı kullanarak C. elegans tabanlı bir görüntü işleme işlem hattı uygulayarak, bu yöntem tek tek solucanları ayırmak ve tanımlamak ve ilgili toplamlarını numaralandırmak için optimize edilmiştir. Otomasyon kavramı tamamen benzersiz olmasa da, tekrarlanabilirlik, manuel sayımdan kaynaklanan önyargının ortadan kaldırılması ve verimin artırılması için bu tür prosedürleri standartlaştırma ihtiyacı yüksektir. Bu yöntemlerin, C. elegans modelini kullanarak büyük bakteriyel, genomik veya ilaç kütüphanelerinin tarama sürecini büyük ölçüde basitleştirebileceği tahmin edilmektedir.

Aşağıdaki protokol, proteostazdaki değişikliklerin bir değerlendirmesi olarak poliglutamin agregalarını ölçmek için solucan kültürleme, floresan görüntüleme ve otomatik görüntü işleme için yüksek verimli bir iş akışının geliştirilmesini ve optimizasyonunu açıklamaktadır.

Caenorhabditis elegans'ta Agrega Niceliğinin Otomatikleştirilmesi

A rise in the prevalence of neurodegenerative protein conformational diseases (PCDs) has fostered a great interest in this subject over the years. This ...

Poliglutamin agregasyonunu değerlendirerek ve yüksek verimli uygulamalar için kullanılabilecek bir çerçeve sağlayarak proteostazdaki değişiklikleri izlemek için basit bir yaklaşım benimsenmiştir. I tarafından agrega sayısı gibi bir fenotipin puanlanması öznel hale gelebilir. Toplam sayımını otomatikleştirmek, bu tür önyargıları ortadan kaldırmamıza, verimi ve tekrarlanabilirliği artırmamıza olanak tanır.Bu yöntem, konakçı proteostaz bozulmasına katkıda bulunan bakteriyel genlerin tanımlanmasına yardımcı olur. Bireysel bakteri genlerinin katkısını anlamak, Alzheimer, Parkinson ve Huntington gibi hastalıkların patogenezindeki etkisini anlamamıza yardımcı olacaktır. Solucan içeren plakaları dondurucudan çıkararak ve oda sıcaklığında çözülmelerine izin vererek başlayın.Ardından fazla yoğuşmayı silin ve görüntülemeden önce kapağı çıkarın. Görüntü yakalama sırasında pozlama süresi 500 milisaniye, 0,63 X kamera adaptörüyle 40 X büyütme ve GFP yoğunluğu %100 olarak ayarlanmış mikroskop ayarlarını kullanın. Şimdi, solucanlar karanlık arka plana kıyasla parlak bir şekilde aydınlatılmış görünene kadar iletilen ışık kontrollerini ayarlayın ve aşırı pozlamayı önleyin.Solucanları nazikçe istenen konuma itmek için 10 mikrolitrelik bir pipet ucu kullanarak aşırı kümelenmeyi önlemek için solucanların kuyu içindeki konumlarını değiştirin. Her iki görüntü için de bir odak düzlemi oluşturmak üzere kanalı GFP filtresine ayarlayın. Parlak bir alan görüntüsü yakalayın.Plakayı rahatsız etmeden veya mikroskopun odağını değiştirmeden karşılık gelen bir floresan görüntüsü alın. Şimdi görüntüleri değerlendirmek için önce CellProfiler'ı indirin. Yazılımı açın ve ilgilendiğiniz görüntüleri görüntüler kutusuna sürükleyip bırakın.Açmak için dosya listesindeki resimlere tıklayın. İlgilenilen bir bölgeyi vurgulamak için büyüteç ve hem solucanların hem de agregaların uzunluğunu ölçmek için ok simgesini seçin. Ekranın alt kısmında görülebilen yoğunluk değerini belirlemek için fareyi istediğiniz nesnenin üzerine getirin.CellProfiler görüntü analizi işlem hattını kullanmak için, CellProfiler'ı resmi web sitesinden indirdikten sonra görüntü çiftlerini metin el yazmasında açıklandığı gibi doğru bir şekilde adlandırın. İşlem hattını indirin ve dosyadan dosya, içeri aktarma ve işlem hattını seçerek CellProfiler'a yükleyin. Dolaşık olmayan solucanlar modülündeki solucanları tanımlamak için kullanılan bir eğitim kümesini yüklemek üzere ayarlarını açmak için dolaşık olmayan solucanlar modülünü seçin.Ardından eğitim kümesi dosya adını tanımlayın. Dosya yükle simgesini seçin ve ek dosyayı da yükleyin. Sol üst köşedeki görüntüler modülünü seçerek görüntüleri yükleyin.Ve sonra düzgün adlandırılmış görüntüleri sürükleyip bırakın. Görüntüleri analiz etmeden önce, programın sol alt köşesinin yakınında bulunan çıktı ayarları düğmesine tıklayarak sonuçları depolamak için kullanılacak istediğiniz çıktı klasörünü seçin. Ardından, istediğiniz çıktı konumunu seçmek için varsayılan çıktının sağındaki klasör simgesini seçin.Görüntü analizine başlamak için görüntüleri analiz et simgesini seçin. Analizin tamamlanması çok uzun sürerse ve tek bir görüntüyü işlerken takılı kalırsa, çalıştırmayı iptal edin ve çıktı klasöründe sıralama yaparak ve hangi görüntü adının bulunamadığını not ederek işlenmemiş görüntüyü tanımlayın. Tam bir analizin ardından, yazılım sonuçları N sütunundaki tek tek solucanları ve K.CellProfiler'dan çıktı CSV dosyasındaki verileri rahatça düzenlemek için meta veri düzenleyicisini indirin sütunundaki ilgili toplama sayısını içeren bir Excel elektronik tablosunda düzenleyecektir.Windows işletim sistemi için, indirilen dosyayı bulun ve istediğiniz konuma ayıklayın. gui_Windowsos_64x adlı ayıklanan klasörü bulun ve açın. Ve GUI uygulama simgesine tıklayarak uygulamayı başlatın.Çalıştırmak için izin isteyen bir istem açılabilir. Daha fazla bilgi seçin ve ardından yine de çalıştır'a tıklayın. Meta veri düzenleyicisi artık CellProfiler çıktı CSV dosyalarını sürükleyip bırakmaya hazırdır.Mac OS için, indirilen dosyayı bulun ve dosya meta veri düzenleyicisi uygulama dosyasını ayıklayın. İndirmelerde bulunan ayıklanmış klasörü açın. GUI uygulamasına sağ tıklayın ve Aç'ı seçin.Resmi bir lisansın olmaması nedeniyle açılması için izin isteyen bir istem görünecektir. Aç'ı seçin. Meta veri düzenleyici uygulamanız ilgili işletim sisteminde açıldıktan sonra, dosyalarınızı buraya yükle'ye tıklayın veya istediğiniz CellProfiler CSV dosyalarını sürükleyip bırakın.Kullanıcıyı dosyaları indir düğmesiyle yeni bir ekrana getirecek olan düzenle düğmesine tıklayın. Düğmeye tıklayın ve çıktı dosyasını kaydetmek için istediğiniz konumu seçin. Çıktı dosyası, dosya adına _organized uzantısı eklenmiş orijinal dosya adı olarak görünecektir.FUDR varlığında, çeşitli bakterilerle beslenen solucanlar, daha düzgün ve doğru solucan tespitine izin veren ve böylece aşırı kalabalıklaşma sorununu çözen daha tutarlı bir vücut boyutuna sahipti. Solucanların dondurulması, arka plan floresansını ve manuel sayma ile karşılaştırılabilir otomatik sayma doğruluğunu ortadan kaldırarak poliQ agrega algılamasını geliştirdi. PoliQ YFP agregalarını görüntülemek için tüm C.elegans ve GFP kanalını algılamak için ters parlak alan aydınlatması kullanıldı.Her solucan için solucan algılama, dolaşıklığı çözme ve toplama nicelemesi, tek tek solucan başına toplama sayısının elde edilmesini sağlayan iyileştirilmiş bir CellProfiler görüntü işleme işlem hattı uygulanarak yapılmıştır. Otomatik agrega niceliğinin etkinliği ile CellProfiler boru hattının kullanılması arasındaki fark minimumdu ve bu da otomatik yöntemin büyük ölçekli ekranlara uygulanabileceğini gösteriyordu. Test edilen 90 bakteri suşundan C.elegans bağırsağının bir adayla kolonizasyonu, agrega sayısında önemli bir azalma göstermiştir.Manuel sayımla yapılan doğrulama deneyleri, agrega sayısını önemli ölçüde azaltan da dahil olmak üzere mutantların hiçbirinin poliQ toplamasını etkilemediğini ortaya koydu. Bu çerçeveyi kullanmaya karar veren araştırmacılar, özetlenen adımların mutlak olmadığını anlamalıdır. Modifikasyon ve CellProfiler'ın nasıl manipüle edileceğine dair temel bir anlayış başarı için gereklidir.PolyQ agregasyonunu doğrulamak için batı lekelenmesi gibi ek biyokimyasal yaklaşımlar kullanılabilir.

automating-aggregate-quantification-in-caenorhabditis-elegans

Research

JoVE Journal

Biology

Biyoloji

Kavşaklarda bulunan kümelenmiş nörotransmitter reseptörlerinin bolluğu güçlü sinaptik gücü etkiler. Bu yöntem tek-sinaps çözünürlükte üç boyutlu olarak floresan etiketli nörotransmitter reseptörleri...

Içinde Synaptic florasan Otomatik Sayısallaştırma<em&gt; C. elegans</em

C. elegans yumurtlama davranışı, gelişimsel, üreme ve anatomik çalışmalarda önemli bilgiler sağlayabilir. Bu video, bir yumurtlama testinin önemli adımlarını tanıtır ve bir ilacın üreme toksisitesi açısından test edildiği örnek bir deneyi gösterir.

Yumurtlama Deneyi: C. elegans'ın Yumurtlama Davranışını Ölçmek İçin Bir Yöntem

Burada, bir çerçeve geniş menzilli diyet kısıtlaması gen ekspresyonu ve ömrü ile ilgili mevcut. Biz iletişim kuralları bu paradigma altında gen ekspresyonu kantitatif görüntüleme ve geniş menzilli diyet kısıtlaması için açıklar. Daha fazla bilgi işleme özellikleri genetik devrelerin temel gıda algılamalı içinde söz konusu ortaya çıkarmak için hesaplama analizleri anahat.

C. elegans gen ifade seviyeleri sırasında ömrü modülasyon altında geniş menzilli diyet kısıtlama tarafından kodlanmış bilginin bir miktar

Biz yüksek üretilen iş Caenorhabditis elegansbüyük popülasyonlarda fenotipik karakterizasyonu sağlayan geniş görüş alanı nematodunun izleme platformu (WF-NTP) kullanarak iletişim kurallarını açıklar. Bu protokoller mutant suşları veya yüksek ölçeklenebilir bir moda farmakolojik tedaviye yanıt ince davranış değişiklikleri tanımlamak için kullanılabilir.

Otomatik davranış analizi büyük C. elegans nüfus kullanarak bir geniş alan bakış açısı izleme platformu

Bu çalışmada, sinaptik boyut ve lokalizasyon, kas Morfoloji ve marochondrial şekil nicel ölçümler serbestçe kullanılabilir görüntü işleme araçları kullanarak C. elegans özetliyor. Bu yaklaşım, C. elegans 'da gelecekteki çalışmaların, genetik mutasyonların bir sonucu olarak doku ve organel yapısal değişikliklerin kapsamını nicel olarak karşılaştırmasına olanak sağlar.

Caenorhabditis elegans hücresel yapıları ve organelle morfoloji eğitim için nicel yaklaşımlar

Bu makalede, tek veya toplu C. elegans örneklerinde gen ekspresyon seviyelerinin hızlı ve güvenilir bir şekilde belirlenmesi için yüksek aktarım hızı protokolü açıklanmıştır. Bu protokol RNA yalıtımı gerektirmez ve doğrudan örneklerden cDNA üretir. Yüksek verimli çok katlı nanoakışkan gerçek zamanlı qPCR platformları ile birlikte kullanılabilir.

Nanoakışkan Teknoloji Kullanarak Tek ve Toplu C. elegans Örneklerinde Yüksek Verimli Nicel RT-PCR

Bu protokol, C. elegans hücreleri tarafından membrana bağlı ekophers şeklinde üretilen büyük agrega ve/veya organel ekstrüzyonların (~4 μm) tespiti ve niceliği için yaklaşımları açıklamaktadır. Bu enkaz kovma mekanizmasının diseksiyonunu kolaylaştırmak için gerekli suşları, büyüme koşullarını, puanlama kriterlerini, zamanlamayı ve mikroskopi hususlarını tanımlıyoruz.

C. elegans'ta Büyük Ekofher Veziküllerde İnvivo Nöronal Agrega ve Organel Ekstrüzyon Puanlama da Kantitatif Yaklaşımlar

Bu çalışma, C. elegans complex I hastalığı gaz-1(fc21)solucanlarında, yani ZebraLab (orta verimli bir test) ve WormScan'da (yüksek verimli bir test) iki yarı otomatik lokomotor aktivite analizi yaklaşımı için protokoller sunar ve nematod davranışını ve entegre nöromüsküler işlevi ölçmek için çok çeşitli araştırma yöntemleri arasında karşılaştırmalı analiz sağlar.

Caenorhabditis elegans Mitokondriyal Hastalık Modellerinde Hayvan Aktivitesini Ölçmek için Deneysel Yöntemlerin Karşılaştırmalı Analizi

Burada, nematod Caenorhabditis elegans'ta protein agregasyon kinetiğinin analizi için bir yöntem sunulmuştur. Yaş senkronize edilmiş bir popülasyondan gelen hayvanlar farklı zaman noktalarında görüntülenir, ardından CellProfiler'da yarı otomatik dahil etme sayımı ve AmyloFit'teki matematiksel bir modele uyar.

Caenorhabditis elegans'ta Otomatik Inklüzyon Sayımı Kullanarak Protein Agregasyon Kinetiğinin In Vivo'da İzlenmesi

Bu protokol, kendi kendine Caenorhabditis nematodlarının büyük ölçekli ekolojik araştırmalarını gerçekleştirmek için kullanılabilir. Bu yöntemin birincil avantajı, doğadan toplanan nematodlarla ilişkili ekolojik ve moleküler verilerin verimli bir şekilde düzenlenmesi ve analiz edilmesidir.

Kendinden Çıkan Caenorhabditis Nematodlarının Ekolojik Araştırmalarını Gerçekleştirmek için Yüksek Oranda Ölçeklenebilir Bir Yaklaşım

Öğrenin, C. elegans'ta poliglutamin agregalarını otomatik sayım yöntemiyle nicelendirmeyi. Bu yüksek verimli görüntüleme tekniği, proteostaz değişikliklerini inceleyerek nörodejeneratif hastalıklardaki mekanizmaları anlamaya yardımcı olur.

Caenorhabditis elegans'ta Agrega Niceliğinin Otomatikleştirilmesi

Daha fazla video keşfet