Caenorhabditis elegans'ta Agrega Niceliğinin Otomatikleştirilmesi
14 Ekim 2021
Aşağıdaki protokol, proteostazdaki değişikliklerin bir değerlendirmesi olarak poliglutamin agregalarını ölçmek için solucan kültürleme, floresan görüntüleme ve otomatik görüntü işleme için yüksek verimli bir iş akışının geliştirilmesini ve optimizasyonunu açıklamaktadır.
Poliglutamin agregasyonunu değerlendirerek ve yüksek verimli uygulamalar için kullanılabilecek bir çerçeve sağlayarak proteostazdaki değişiklikleri izlemek için basit bir yaklaşım benimsenmiştir. I tarafından agrega sayısı gibi bir fenotipin puanlanması öznel hale gelebilir. Toplam sayımını otomatikleştirmek, bu tür önyargıları ortadan kaldırmamıza, verimi ve tekrarlanabilirliği artırmamıza olanak tanır.
Bu yöntem, konakçı proteostaz bozulmasına katkıda bulunan bakteriyel genlerin tanımlanmasına yardımcı olur. Bireysel bakteri genlerinin katkısını anlamak, Alzheimer, Parkinson ve Huntington gibi hastalıkların patogenezindeki etkisini anlamamıza yardımcı olacaktır. Solucan içeren plakaları dondurucudan çıkararak ve oda sıcaklığında çözülmelerine izin vererek başlayın.
Ardından fazla yoğuşmayı silin ve görüntülemeden önce kapağı çıkarın. Görüntü yakalama sırasında pozlama süresi 500 milisaniye, 0,63 X kamera adaptörüyle 40 X büyütme ve GFP yoğunluğu %100 olarak ayarlanmış mikroskop ayarlarını kullanın. Şimdi, solucanlar karanlık arka plana kıyasla parlak bir şekilde aydınlatılmış görünene kadar iletilen ışık kontrollerini ayarlayın ve aşırı pozlamayı önleyin.
Solucanları nazikçe istenen konuma itmek için 10 mikrolitrelik bir pipet ucu kullanarak aşırı kümelenmeyi önlemek için solucanların kuyu içindeki konumlarını değiştirin. Her iki görüntü için de bir odak düzlemi oluşturmak üzere kanalı GFP filtresine ayarlayın. Parlak bir alan görüntüsü yakalayın.
Plakayı rahatsız etmeden veya mikroskopun odağını değiştirmeden karşılık gelen bir floresan görüntüsü alın. Şimdi görüntüleri değerlendirmek için önce CellProfiler'ı indirin. Yazılımı açın ve ilgilendiğiniz görüntüleri görüntüler kutusuna sürükleyip bırakın.
Açmak için dosya listesindeki resimlere tıklayın. İlgilenilen bir bölgeyi vurgulamak için büyüteç ve hem solucanların hem de agregaların uzunluğunu ölçmek için ok simgesini seçin. Ekranın alt kısmında görülebilen yoğunluk değerini belirlemek için fareyi istediğiniz nesnenin üzerine getirin.
CellProfiler görüntü analizi işlem hattını kullanmak için, CellProfiler'ı resmi web sitesinden indirdikten sonra görüntü çiftlerini metin el yazmasında açıklandığı gibi doğru bir şekilde adlandırın. İşlem hattını indirin ve dosyadan dosya, içeri aktarma ve işlem hattını seçerek CellProfiler'a yükleyin. Dolaşık olmayan solucanlar modülündeki solucanları tanımlamak için kullanılan bir eğitim kümesini yüklemek üzere ayarlarını açmak için dolaşık olmayan solucanlar modülünü seçin.
Ardından eğitim kümesi dosya adını tanımlayın. Dosya yükle simgesini seçin ve ek dosyayı da yükleyin. Sol üst köşedeki görüntüler modülünü seçerek görüntüleri yükleyin.
Ve sonra düzgün adlandırılmış görüntüleri sürükleyip bırakın. Görüntüleri analiz etmeden önce, programın sol alt köşesinin yakınında bulunan çıktı ayarları düğmesine tıklayarak sonuçları depolamak için kullanılacak istediğiniz çıktı klasörünü seçin. Ardından, istediğiniz çıktı konumunu seçmek için varsayılan çıktının sağındaki klasör simgesini seçin.
Görüntü analizine başlamak için görüntüleri analiz et simgesini seçin. Analizin tamamlanması çok uzun sürerse ve tek bir görüntüyü işlerken takılı kalırsa, çalıştırmayı iptal edin ve çıktı klasöründe sıralama yaparak ve hangi görüntü adının bulunamadığını not ederek işlenmemiş görüntüyü tanımlayın. Tam bir analizin ardından, yazılım sonuçları N sütunundaki tek tek solucanları ve K.CellProfiler'dan çıktı CSV dosyasındaki verileri rahatça düzenlemek için meta veri düzenleyicisini indirin sütunundaki ilgili toplama sayısını içeren bir Excel elektronik tablosunda düzenleyecektir.
Windows işletim sistemi için, indirilen dosyayı bulun ve istediğiniz konuma ayıklayın. gui_Windowsos_64x adlı ayıklanan klasörü bulun ve açın. Ve GUI uygulama simgesine tıklayarak uygulamayı başlatın.
Çalıştırmak için izin isteyen bir istem açılabilir. Daha fazla bilgi seçin ve ardından yine de çalıştır'a tıklayın. Meta veri düzenleyicisi artık CellProfiler çıktı CSV dosyalarını sürükleyip bırakmaya hazırdır.
Mac OS için, indirilen dosyayı bulun ve dosya meta veri düzenleyicisi uygulama dosyasını ayıklayın. İndirmelerde bulunan ayıklanmış klasörü açın. GUI uygulamasına sağ tıklayın ve Aç'ı seçin.
Resmi bir lisansın olmaması nedeniyle açılması için izin isteyen bir istem görünecektir. Aç'ı seçin. Meta veri düzenleyici uygulamanız ilgili işletim sisteminde açıldıktan sonra, dosyalarınızı buraya yükle'ye tıklayın veya istediğiniz CellProfiler CSV dosyalarını sürükleyip bırakın.
Kullanıcıyı dosyaları indir düğmesiyle yeni bir ekrana getirecek olan düzenle düğmesine tıklayın. Düğmeye tıklayın ve çıktı dosyasını kaydetmek için istediğiniz konumu seçin. Çıktı dosyası, dosya adına _organized uzantısı eklenmiş orijinal dosya adı olarak görünecektir.
FUDR varlığında, çeşitli bakterilerle beslenen solucanlar, daha düzgün ve doğru solucan tespitine izin veren ve böylece aşırı kalabalıklaşma sorununu çözen daha tutarlı bir vücut boyutuna sahipti. Solucanların dondurulması, arka plan floresansını ve manuel sayma ile karşılaştırılabilir otomatik sayma doğruluğunu ortadan kaldırarak poliQ agrega algılamasını geliştirdi. PoliQ YFP agregalarını görüntülemek için tüm C.elegans ve GFP kanalını algılamak için ters parlak alan aydınlatması kullanıldı.
Her solucan için solucan algılama, dolaşıklığı çözme ve toplama nicelemesi, tek tek solucan başına toplama sayısının elde edilmesini sağlayan iyileştirilmiş bir CellProfiler görüntü işleme işlem hattı uygulanarak yapılmıştır. Otomatik agrega niceliğinin etkinliği ile CellProfiler boru hattının kullanılması arasındaki fark minimumdu ve bu da otomatik yöntemin büyük ölçekli ekranlara uygulanabileceğini gösteriyordu. Test edilen 90 bakteri suşundan C.elegans bağırsağının bir adayla kolonizasyonu, agrega sayısında önemli bir azalma göstermiştir.
Manuel sayımla yapılan doğrulama deneyleri, agrega sayısını önemli ölçüde azaltan da dahil olmak üzere mutantların hiçbirinin poliQ toplamasını etkilemediğini ortaya koydu. Bu çerçeveyi kullanmaya karar veren araştırmacılar, özetlenen adımların mutlak olmadığını anlamalıdır. Modifikasyon ve CellProfiler'ın nasıl manipüle edileceğine dair temel bir anlayış başarı için gereklidir.
PolyQ agregasyonunu doğrulamak için batı lekelenmesi gibi ek biyokimyasal yaklaşımlar kullanılabilir.
Genel Bakış
Bu çalışma, proteostazdaki değişikliklerin bir ölçütü olarak poliglutamin agregatlarını nicelendirmek amacıyla solucan kültürü, floresan görüntüleme ve otomatik görüntü işleme için yüksek kapasiteli bir iş akışı geliştirmektedir. Bu yöntem, özellikle nörodejeneratif hastalıklardaki rollerinin araştırılmasında, söz konusu agregatların değerlendirilmesini geliştirmektedir.
Temel Çalışma Bileşenleri
Araştırma Alanı
- Proteostaz
- Nörodejeneratif hastalıklar
- Yüksek kapasiteli tarama
Arka Plan
- Poliglutamin agregasyonu; Alzheimer, Parkinson ve Huntington gibi hastalıklarla ilişkilendirilmektedir.
- Bakteriyel genlerin proteostaz bozulmasına olan katkılarının anlaşılması esastır.
- Agregatlar için kullanılan geleneksel skorlama yöntemleri subjektif olabilir.
Kullanılan Yöntemler
- CellProfiler kullanılarak yüksek kapasiteli görüntüleme ve analiz
- Biyolojik model olarak C. elegans
- Poliglutamin agregatlarının otomatik kantifikasyonu
Ana Sonuçlar
- Otomatik görüntü işleme, agregat sayımında yanlılığın ortadan kaldırılmasını ve tekrarlanabilirliğin artırılmasını sağlar.
- Konak proteostazını etkileyen bakteriyel genler belirlenmiş ve solucan agregat sayılarında anlamlı bulgular elde edilmiştir.
- Doğrulanmış sonuçlar, otomasyonun manuel sayımla karşılaştırılabilir olduğunu göstermekte ve geniş ölçekli taramaları desteklemektedir.
Sonuçlar
- Bu çalışma, poliglutamin agregasyonu aracılığıyla proteostazın incelenmesi için güvenilir bir çerçeve sunmaktadır.
- Bu yöntemden elde edilen bilgiler, nörodejeneratif hastalıklardaki mekanizmaların anlaşılması açısından önem taşımaktadır.
Sıkça Sorulan Sorular
Sektörle İlgili Yönetici Özeti
C. elegans'ta agregat kantifikasyonunun otomatikleştirilmesi, nörodejeneratif hastalık modellerinde proteostazın yüksek kapasiteli ve yanlılıktan uzak bir şekilde değerlendirilmesi ihtiyacını karşılamaktadır. Görüntüleme ve CellProfiler tabanlı analizin standardize edilmesiyle bu yöntem, geniş bileşik veya genetik kütüphanelerin tekrarlanabilir şekilde taranmasına olanak tanır. Bu durum, protein konformasyonel hastalıklarına yönelik keşif süreçlerinde erken hedef doğrulamasını ve mekanistik risk azaltmayı desteklemektedir.
Biyofarma Ar-Ge'sinde Stratejik Uygulamalar
Erken Keşif ve Hedef Doğrulama
- Bilimsel Değer: Proteostaz bozulmasının bir göstergesi olarak poliglutamin agregasyonunu nicelendirerek terapötik hipotezlerin sorgulanmasına olanak tanır.
- Operasyonel Değer: Fenotipik skorlamadaki öznelliği azaltarak hedef doğrulama kampanyaları için veri güvenilirliğini artırır.
- Öngörücü Değer: Mekanizma tabanlı bileşik önceliklendirmesi için nicel ve tekrarlanabilir okumalar sağlayarak portföy triyajını destekler.
Tarama ve Analiz Geliştirme
- Bilimsel Değer: Solucan başına standartlaştırılmış, kantitatif agregat sayımları oluşturarak tarama kampanyaları için güvenilir analiz çıktıları sağlar.
- Operasyonel Değer: Otomasyon yoluyla verimliliği ve tekrarlanabilirliği artırır, manuel iş gücünü ve operatörler arası değişkenliği azaltır.
- Analize Hazırlık: Alt veri analizi iş akışlarıyla uyumlu, yapılandırılmış çıktılar (solucan ve agregat sayımlarını içeren Excel hesap tablosu) üretir.
Translasyonel ve Preklinik Araştırmalar
- Translasyonel Süreklilik: Konserve polyQ agregasyon yolları aracılığıyla C. elegans proteostaz modellerini insan nörodejeneratif hastalık mekanizmalarıyla ilişkilendirir.
- Mekanistik Risk Azaltma: Agregasyonun bakteriyel veya genetik modifikatörlerinin belirlenmesini kolaylaştırarak, hastalıkla ilgili sistemlerde hedef validasyonunu destekler.
- Öngörü Güveni: Fonksiyonlar arası ekiplerin, normalize edilmiş ve otomatik agregat kantifikasyonu kullanarak koşulları karşılaştırmasına olanak tanır.
İş Hattı ve İş Akışı Entegrasyonu
Bu yöntem, hedef doğrulamasından öncü bileşik tanımlamaya kadar uzanan keşif sürekliliğine uyum sağlayarak, devam/durdur kararlarına veri sağlayan kantitatif proteostaz sonuçları sunar.
- Keşif Biyolojisi: Objektif ve yüksek içerikli agregasyon fenotiplendirmesi sağlayarak proteostaz mekanizmaları üzerindeki hipotez testlerini destekler.
- Tarama: 96 kuyucuklu veya daha büyük formatlı taramalarla uyumlu, analize hazır, standartlaştırılmış solucan görüntüleme ve analizi sunar.
- Analitik: Deneysel koşullar arasında istatistiksel karşılaştırmaya olanak tanıyan, nicelleştirilebilir bağımlı değişken ölçümleri (solucan başına agregat) üretir.
- Translasyonel Araştırma: Korunmuş agregasyon biyolojisi aracılığıyla omurgasız model bulgularını insan hastalık yollarıyla ilişkilendirir.
- Kurumsal Yeniden Kullanım: Birden fazla proteostaz hedefi ve tarama kampanyasına uyarlanabilen, yeniden kullanılabilir bir görüntüleme ve analiz hattı oluşturur.
Operasyonel ve Kurumsal Etki
- Bilimsel Değer: Manuel agregat sayımından kaynaklanan yanlılığı ortadan kaldırarak hedef doğrulamadaki öngörü güvenilirliğini artırır.
- Operasyonel Değer: Standartlaştırılmış görüntü işleme ve otomatik veri çıktısı aracılığıyla tekrarlanabilirliği ve ölçeklenebilirliği geliştirir.
- Stratejik Değer: Azaltılmış manuel çalışma süresi ve daha yüksek veri kalitesi ile büyük ölçekli taramaları mümkün kılarak sermaye verimliliğini artırır.
- Portföy Etkisi: Güvenilir, kantitatif proteostaz biyobelirteçleri aracılığıyla riske göre ayarlanmış ilerleme kararlarını destekler.
Uygulama Hususları
- polyQ saptaması için floresan mikroskopi ve GFP/YFP görüntüleme parametrelerine aşinalık gerektirir.
- Otomatik solucan ve agregat segmentasyonu için CellProfiler yazılımına ve ilgili boru hattı yapılandırmasına bağlıdır.
- Başarılı toplu işlem için standartlaştırılmış görüntü isimlendirmesi ve klasör organizasyonu gereklidir.
- Yüksek yoğunluklu kuyucuklarda solucan boyutu değişkenliğini azaltmak ve saptama doğruluğunu artırmak için FUDR uygulamasından fayda sağlar.
- Boru hattının farklı solucan suşlarına, ekspresyon modellerine veya görüntüleme kurulumlarına uyarlanması için kullanıcı eğitimine dayanır.
