Mikroakışkan Cihaz Kullanılarak siRNA Yüklü Lipid Nanopartiküllerinin Üretimi
22 Mart 2022
RNA teslimatı da dahil olmak üzere ilaç dağıtım sistemlerinde (DDS) mikroakışkan bazlı lipid nanopartikül (LNP) üretim yöntemleri dikkat çekmiştir. Bu protokol, iLiNP adlı orijinal mikroakışkan cihazımızı kullanarak imalat, LNP (siRNA yüklü LNP) üretimi ve LNP değerlendirme süreçlerini açıklar.
Lipid nanopartikül boyutu biyodistribution, anti-tümör etkisi ve gen susturma performansını etkiler. Bu nedenle, LNP boyut kontrol yöntemi, RNA dağıtım sistemleri de dahil olmak üzere nano ilaçlar üretmek için etkili bir tekniktir. iLiNP cihazı olarak adlandırılan bu orijinal mikroakışkan cihaz, 20 ila 100 nanometre arasında değişen LNP boyutunu 10 nanometre aralıklarla kontrol edebildi.
iLiNP cihazı yalnızca siRNA yüklü LNP'ler değil, aynı zamanda tüm mRNA yüklü LNPS ve ribonucleoprotein yüklü LNP'ler üretebilir. Başlamak için lipid etanol çözeltilerini alın ve DOTAP, DSPC, kolesterol ve DMG-PEG2k çözeltilerini 50 ila 10 ila 38,5 ila 1,5 molar oranında karıştırarak siRNA yüklü LNP'leri üretin. Toplam lipit konsantrasyonu sekiz milimolar olarak ayarlayın.
Daha sonra pH 4'te 154 milimoler salin ve 25 milimolar asetat tamponunun sulu çözeltilerini alın ve 0,2 mikrometre membran filtresi veya şırınga filtresinden filtreleyin. 70 mikrogram siGL4'i 25 milimolar asetat tamponun bir mililitresi içinde eriterek siRNA tampon çözeltisini hazırlayın. Bir mililitre cam şırınnayı sırasıyla lipid ve sulu çözeltilerle doldurun.
Şırınd konektörlerini kullanarak cam şırınnaları tepe kılcal damarlarına bağlayın, ardından lipit ve sulu çözeltilerin akış hızını ayarlayın ve lipid ve sulu çözeltileri şırınna pompaları kullanarak iLiNP cihazına ayrı ayrı sokun. LNP süspansiyonlarını iLiNP cihazının çıkışından bir mikrotüpte toplayın. Dört derecede 12 ila 14 kiloDalton moleküler ağırlık kesmeleri diyaliz zarı kullanarak LNP süspansiyonunu dialyze, sırasıyla POPC LNP'ler ve siRNA yüklü LNP'ler için salin veya DPBS'ye karşı bir gecede santigrattır.
Çaprazlanmış LNP süspansiyonlarını mikrotüplerde toplayın ve ardından LNP süspansiyonunun 20 ila 30 mikrolitresini bir mikro kuvars hücresine borulayın. Son olarak, dinamik ışık saçılım ile LNP boyutunu, LNP boyut dağılımını ve çoklu dağılım dizinini ölçün. Toplam akış hızı ve akış hızı oranları gibi farklı akış koşullarında üretilen POPC LNP boyut dağılımı burada gösterilmiştir.
20 ila 100 nanometre arasında değişen hassas LNP boyutları bu iLiNP cihazı kullanılarak kontrol edilebilir. Küçük boyutlu LNP'ler yüksek toplam akış hızı koşullarında oluşturulur. Ayrıca, FRR 5'te oluşturulan LNP boyutları, toplam akış hızından bağımsız olarak FRR 3'ün boyutlarından daha küçüktür.
SiRNA yüklü LNP'lerin boyut dağılımı burada gösterilmiştir. siRNA'lar, katyonik lipit DOTAP ve negatif yüklü siRNA'lar arasındaki elektrostatik etkileşimle LNP'lere kapsüllenir. iLiNP cihazı, dar bir dağılıma sahip 90 nanometre siRNA yüklü katyonik LNP üretti.
Cationic lipid ile negatif yüklü siRNA'lar arasındaki elektrostatik etkileşim nedeniyle siRNA kapsülleme verimliliği %95 idi. Sitotoksiklik ve 19 nanometre siRNA yüklü LNP'lerin gen susturma aktivitesi değerlendirildi. siRNA yüklü LNP'ler 10 ila 100 nanomoler siRNA dozda sitotoksisite gösterdi.
SiRNA konsantrasyonuna bağlı olarak luciferaz ekspresyon seviyesi azaldı. SiRNA yüklü LNP'ler 100 nanomoler siRNA dozda% 80 luciferaz ekspresyonunu bastırdı. Akış koşullarının optimizasyonları, istenen boyutta LNP'leri elde etmek için protokoldeki en önemli adımlardır.
iLiNP cihazı da dahil olmak üzere mikroakışkan tabanlı LNP üretim yöntemi karmaşık bir prosedür gerektirmez ve standart LNP üretim yöntemi olarak istihdam edilmesi beklenir.
Genel Bakış
Bu makale, iLiNP adlı mikroakışkan bir cihaz kullanılarak siRNA yüklü lipid nanopartiküllerin (LNP'ler) üretimi için bir protokol sunmaktadır. Bu yöntem, etkili ilaç taşıma sistemleri için kritik öneme sahip olan LNP boyutunun hassas bir şekilde kontrol edilmesine olanak tanır.
Temel Çalışma Bileşenleri
Bilim Alanı
- İlaç taşıyıcı sistemler
- Lipit nanopartiküller
- Mikroakışkanlar
Arka Plan
- Lipid nanoparçacık boyutu, biyodağılımı ve terapötik etkinliği etkiler.
- RNA iletimini optimize etmek için LNP boyutunun kontrol edilmesi gereklidir.
- iLiNP cihazı, 20 ile 100 nanometre arasında boyut kontrolü sağlar.
- Elektrostatik etkileşimler, siRNA'nın LNP'lere enkapsülasyonunu kolaylaştırır.
Çalışmanın Amacı
- siRNA yüklü LNP'lerin üretimi için güvenilir bir yöntem geliştirmek.
- LNP boyutunun gen susturma etkinliği üzerindeki etkisini değerlendirmek.
- İstenen LNP özellikleri için akış koşullarını optimize etmek.
Kullanılan Yöntemler
- LNP üretimi için lipid ve sulu çözeltilerin hazırlanması.
- Karıştırma ve LNP oluşumu için iLiNP cihazının kullanımı.
- Fazla maddeleri uzaklaştırmak için LNP süspansiyonlarının diyalizi.
- LNP boyutunu ve dağılımını ölçmek için dinamik ışık saçılımı.
Ana Sonuçlar
- iLiNP cihazı, 90 nanometre boyutunda ve %95 enkapsülasyon verimliliğine sahip siRNA yüklü LNP'ler üretmiştir.
- Yüksek toplam akış hızı koşulları altında küçük LNP'ler oluşmuştur.
- siRNA yüklü LNP'ler sitotoksisite ve etkili gen susturma göstermiştir.
- İstenen LNP boyutlarına ulaşmak için optimize edilmiş akış koşulları kritik öneme sahipti.
Sonuçlar
- iLiNP cihazı kullanılarak uygulanan mikroakışkan yöntem, LNP üretimini kolaylaştırmaktadır.
- Bu yaklaşımın, araştırmalarda LNP üretimini standardize etmesi beklenmektedir.
- Gelecekteki çalışmalar, bu yöntemin çeşitli RNA iletim sistemlerindeki uygulamasını araştırabilir.
Sıkça Sorulan Sorular
Yürütücü Endüstriyel Uygunluk
Lipid nanopartikül (LNP) boyutunun hassas kontrolü, RNA tabanlı ilaç taşıma sistemlerinde biyodağılımın, terapötik etkinliğin ve gen susturma performansının optimize edilmesi için kritiktir. iLiNP mikroakışkan cihazı, 20 ile 100 nanometre arasında ayarlanabilir boyutlarda tekrarlanabilir LNP üretimine olanak tanıyarak erken evre hedef doğrulama ve öncü bileşik tanımlama iş akışlarını destekler. Bu yetenek, nanopartikül performansındaki değişkenliği azaltarak preklinik modellerdeki öngörü güvenini artırır ve bu durum, translasyonel ilerlemedeki risklerin azaltılmasında kilit bir faktördür.
Biyofarma Ar-Ge'sinde Stratejik Uygulamalar
Erken Keşif ve Hedef Doğrulama
- Bilimsel Değer: Hedef doğrulama deneylerinde, siRNA yüklü LNP'lerin boyuta bağlı biyolojik aktivitelerinin sorgulanmasına olanak tanır.
- Operasyonel Değer: Fenotipik tarama ve mekanistik risk azaltma çalışmalarındaki gürültüyü azaltmak için standartlaştırılmış LNP formülasyonları sağlar.
Tarama ve Analiz Geliştirme
- Bilimsel Değer: Güvenilir bileşik değerlendirmesi için tanımlanmış boyuta ve %95 enkapsülasyon verimliliğine sahip monodispers siRNA-LNP'ler üretir.
- Operasyonel Değer: iLiNP cihazındaki akış hızı ayarıyla tekrarlanabilir LNP boyut kontrolü sağlayarak analiz standardizasyonunu destekler.
Translasyonel ve Preklinik Araştırmalar
- Bilimsel Değer: LNP boyutunun, hastalıkla ilgili sistemlerde gen susturma etkinliği ve sitotoksisite ile korelasyonunu kolaylaştırır.
- Operasyonel Değer: Preklinik süreklilik için mRNA, siRNA ve ribonükleoprotein yüklü LNP'lerin ölçeklenebilir üretimine olanak tanır.
Boru Hattı ve İş Akışı Entegrasyonu
iLiNP mikroakışkan yöntemi, özellikle boyut bağımlı iletimin etkinliği etkilediği RNA terapötikleri için, erken aşama hedef doğrulamadan öncü bileşik tanımlamaya ve preklinik geliştirmeye kadar uzanan keşif sürekliliğine uygundur.
- Keşif Biyolojisi: Hücresel alımı ve hedef etkileşimini değerlendirmek için LNP boyutunun sistematik varyasyonuna olanak tanıyarak hipotez testlerini destekler.
- Tarama: Tekrarlanabilir bileşik taraması için tutarlı boyut dağılımına ve yüksek siRNA enkapsülasyonuna sahip, analize hazır LNP formülasyonları sunar.
- Analitik: Karar verme süreçlerini bilgilendirmek amacıyla dinamik ışık saçılımı yoluyla kantitatif boyut, polidispersite ve zeta potansiyeli çıktıları sağlar.
- Translasyonel Araştırma: Standartlaştırılmış boyut kontrollü nanokullanımlı ilaçlar aracılığıyla, keşif aşamasındaki LNP optimizasyonunu preklinik değerlendirme ile bağdaştırır.
- Kurumsal Yeniden Kullanım: Birden fazla projede çeşitli RNA yüklü LNP'lerin (siRNA, mRNA, RNP) üretimi için yeniden kullanılabilir bir platform oluşturur.
Operasyonel ve Kurumsal Etki
- Bilimsel Değer: LNP fizikokimyasal özelliklerini gen susturma gibi fonksiyonel sonuçlarla ilişkilendirerek hedef güvenini artırır.
- Operasyonel Değer: Mikroakışkan hassasiyeti sayesinde LNP üretiminin tekrarlanabilirliğini ve ölçeklenebilirliğini geliştirir.
- Stratejik Değer: Taşıyıcı araç performansının erken aşamada risk analizine olanak tanıyarak geç aşama biyolojik risklerini azaltır.
- Portföy Etkisi: Teslimat verimliliğine dayalı olarak RNA terapötik adaylarının riskle ayarlanmış önceliklendirmesine bilgi sağlar.
Uygulama Hususları
- Lipid formülasyonu, mikroakışkan işlemler ve nükleik asit yükleme konularında uzmanlık gerektirir.
- LNP saflaştırması için şırınga pompalarına, cam şırıngalara ve diyaliz altyapısına bağımlıdır.
- Ekipler arasında akış hızı oranlarının ve toplam akış koşullarının standardizasyonunu gerektirir.
- Lipid kompozisyonları veya RNA kargo türleri değiştirildiğinde adaptasyon değerlendirmeleri gerektirir.
- Üretim sonrası diyaliz ve kalite kontrol için dinamik ışık saçılımı ihtiyacı ile sınırlıdır.
Biyofarma SSS
Chapters in this video
0:04
Introduction
0:54
Preparation of Lipid Solutions and the siRNA/ Buffer Solution
1:58
Set-Up of the iLiNP Device and Production of LNPs
2:35
Dialysis of the LNP Suspension and LNP Size Measurement
3:24
Results: POPC LNP Size Distributions Produced by the iLiNP Device at Different Flow Rate Ratios and Characterization and Cytotoxicity of siRNA-Loaded LNPs
5:22
Conclusion
