Name: Oda ve Plaka Tabanlı Respirometreler Kullanarak Hücrelerdeki ve Dokulardaki Biyoenerjetik Değerleri Değerlendirmek için Yüksek Çözünürlüklü Respirometri (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-10-26T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 53 s
Description: Öğrenin, oda ve plaka tabanlı yüksek çözünürlüklü respirometreler kullanarak HEK293 hücrelerinde mitokondriyal oksidatif fosforilasyonu ve biyoenerjetik değerleri nasıl değerlendireceğinizi.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Bu çalışma, Finlandiya Akademisi (CBJ), Magnus Ehrnroot Vakfı (CBJ) ve Entegre Yaşam Bilimleri Enstitüsü (RA) Doktora bursu ile desteklenmiştir.

Açıklanacak çıkar çatışması yok.

Geleneksel olarak, mitokondriyal biyoenerjetik Clark tipi oksijen elektrotları ile çalışılmıştır. Bununla birlikte, çözünürlük ve verim eksikliği, teknolojik ilerleme için garanti edildi. Bugüne kadar, O2k (cHRR olarak adlandırılır) ve Seahorse XF96 Akı Analizörü (mHRR olarak adlandırılır) hücresel biyoenerjetik alanında yaygın olarak benimsenmiştir. Burada, cHRR veya mHRR kullanarak mitokondriyal solunumun değerlendirilmesi yoluyla hücresel enerji metabolizmasının analizi için anlaşılabilir bir protokol koleksiyonu sunu...

Mitokondri, enerjinin temel hükmünü yerine getirir ve nükleotitlerin, lipitlerin ve amino asitlerin anabolizması, demir-kükürt kümesi biyogenezi gibi temel hücresel biyoenerjetik ve metabolik süreçlere katkıda bulunan bölümlere ayrılmış bir organeldir ve kontrollü hücre ölümü gibi sinyalleşmeye dahil edilir 1,2,3 . Oksidatif fosforilasyon yoluyla mitokondriyal biyoenerjetik maddeler, hücre içindeki hemen hemen tüm hücresel süreçlere katkıda bulunur ve sonuç olarak, birincil veya ikincil kökenli mitokondriyal işlev bozuklukları, geniş bir hastalık koşulları spektrumu ile ilişkilidir 4,5. Mitokondriyal disfonksiyon sadece yapı veya mitokondriyal yoğunluktaki değişiklikleri değil, aynı zamanda solunum sisteminin kalitesinde ve düzenlenmesinde de değişiklikler içerir6. Bu kalitatif eleman substrat kontrolünü, kuplaj özelliklerini, post-translasyonel modifikasyonları, krista dinamiklerini ve solunum süperkomplekslerini kapsar 7,8. Bu nedenle, hücrenin enerji metabolizmasını değerlendirmek için deneysel ve tanısal yaklaşımlar için mitokondriyal biyoenerjetik ilaçların doğru analizi sağlık ve hastalıkta önemlidir.
Mitokondriyal oksidatif fosforilasyon (OXPHOS), adenozin trifosfat (ATP)9 yoluyla hücresel enerji üretimi için solunum sistemi veya elektron transfer sistemi (ETS) içindeki bir dizi reaksiyondur. I ve II kompleksleri boyunca elektron akışından karmaşık IV'e kadar enerjiyi kullanmak için çok enzimatik adım, iç mitokondriyal membran boyunca bir elektrokimyasal proton gradyanı üretir ve daha sonra adenozin difosfatın (ADP) karmaşık V (F1FO ATP sentaz) yoluyla ATP'ye fosforilasyonu için kullanılır (Şekil 1A).
İlk olarak, trikarboksilik döngü (TCA), glikoliz ve piruvat oksidasyonu sırasında iki elektron taşıyıcıları üretilir: nikotinamid adenin dinükleotid (NADH) ve dihidroflavin adenin dinükleotid (FADH2). NADH, kompleks I'de (NADH dehidrojenaz) oksitlenir, bu sırada iki elektron koenzim Q'ya aktarılır (kinon kinol'e indirgenir), protonlar membranlar arası boşluğa (IMS) pompalanır. İkincisi, kompleks II (Süksinat dehidrojenaz) FADH2'yi oksitler ve protonları pompalamadan elektronları koenzim Q'ya besler. Üçüncüsü, kompleks III'te (Sitokrom c oksidoredüktaz), koenzim Q'dan gelen elektronlar sitokrom c'ye aktarılırken, protonlar IMS'ye pompalanır. Dördüncüsü, sitokrom c, elektronları protonları pompalamak için son kompleks olan ve oksijenin protonları asimile etmek için bir elektron alıcısı olarak işlev gördüğü ve sonuçta su oluşturan kompleks IV'e (Sitokrom c oksidaz) aktarır. Mitokondrinin tükettiği ve bir oksigrafla ölçülebilen bu oksijendir. Son olarak, karmaşık I, karmaşık III ve karmaşık IV'ten üretilen protonlar, karmaşık V'yi döndürmek için kullanılır, böylece ATP9 üretilir.
Önemli olarak, elektron transferi sadece doğrusal bir şekilde gerçekleşmez, aksi takdirde elektron taşıma zinciri olarak gösterilir. Bunun yerine, elektronlar çoklu solunum yolları aracılığıyla koenzim Q havuzuna aktarılabilir ve yakınsak elektron akışını kolaylaştırabilir. Örneğin NADH-substratları ve süksinat, sırasıyla karmaşık I ve karmaşık II yoluyla girebilir. Yağ asidi oksidasyonundan elde edilen elektronlar, elektron transfer flavoprotein kompleksi aracılığıyla bağışlanabilir. Gerçekten de, OXPHOS'un kapsamlı bir analizi, uygun yakıt substratları ile bütünsel bir yaklaşım gerektirir (Şekil 1A).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63000/63000fig1v2.jpg"> Şekil 1: Mitokondriyal oksidatif fosforilasyon ve spesifik substrat ve inhibitör protokolleri. (A) Mitokondri ve elektron transfer sisteminin şeması (CI-CIV) ve mitokondriyal F1F0 ATP sentaz (CV). Tüm yapılar PDB'dendir. Rakamlar sadece bu çalışmada açıklanan substratları ve inhibitörleri göstermektedir). (B) Bir mHRR cihazında standart protokol kullanarak bozulmamış HEK293 hücrelerinde oksijen akışının örnek izi. (C) Bir cHRR cihazında standart protokol kullanarak bozulmamış HEK293 hücrelerinde oksijen akışının örnek izi. (D) İlgili SUIT protokolüne sahip sağlıklı bir donörden geçirgenleştirilmiş insan fibroblastlarındaki oksijen akışının örnek izi. Kısaltmalar: 1 = Bozulmamış hücrelerin rutin solunumu; 2 = Devlet 2; 3 = Durum 3(I); 4 = cytC ile Durum 3(I); 5 = Durum 3 (I+II); 6 = Sızıntı (OM); 7 = ETS kapasitesi; 8 = S (ÇÜRÜKLÜK); 9 = ROX; 10 = TMPD; 11 = Az. ROT = Rotenon, = Antimisin, ATP = Adenozin trifosfat, Az = Azid, OM = Oligomisin, FCCP = Karbonil siyanür p-trifloro-metoksifenil-hidrazon; Asc = Askorbat, TMPD = N,N,N′,N′-tetrametil-p-fenilendiamin, Succ = Süksinat, M = Malat, P = Piruvat, ADP = Adenozin difosfat, NAD = Nikotinamid adenin dinükleotid, IMS = Membranlararası boşluk, FAD = Flavin adenin dinükleotid. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63000/63000fig01large.jpg" target="_blank">Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
HRR kullanılarak mitokondriyal OXPHOS kapasitesinin analizi, sadece primer mitokondriyal defektler10,11 için değil, kanser ve yaşlanma12 gibi biyolojinin diğer tüm alanlarına uzanan tanısal değeri olan enstrümantal bir biyokimyasal yöntem haline gelmiştir. HRR, bireysel veya kombine mitokondriyal solunum kompleksi eksikliğini doğrudan yansıtan ve dolaylı olarak hücresel işlev bozukluğu ve değişmiş enerji metabolizması9 ile ilişkili mitokondriyal OXPHOS kapasitesinin analizi ile hücresel solunumun belirlenmesine izin verir. Metodolojik olarak, solunum ölçümleri hücreler, doku veya izole mitokondri11,13,14 kullanılarak gerçekleştirilir, dondurulmuş materyal sadece kısmen uygun15,16 ile gerçekleştirilir. Dondurulmuş dokunun, süperkompleks stabilitesi korunmuş sağlam bir ETS'ye sahip olduğu gösterilmiştir15. Böylece, geleneksel TCA ara ürünlerinin aksine, ilgili substratlar doğrudan ETS'ye beslenir. Bununla birlikte, ETS ve ATP sentezi arasındaki bağlantı, membran bütünlüğü donma hasarı (buz kristali oluşumu) nedeniyle tehlikeye girdiğinden kaybolur.
Solunum deneyleri normalde geçirgenleşmemiş veya geçirgenleştirilmiş hücrelerde veya dokularda endotermler için 37 ° C'lik fizyolojik bir sıcaklıkta gerçekleşir. Birincisi sitozolik metabolik bağlamı göz önünde bulundururken, ikincisi, spesifik substratların (ve inhibitörlerin) eklenmesiyle bireysel OXPHOS komplekslerinin ve ATPaz'ın enerjik katkısını sağlar. Substratların ve inhibitörlerin dizilimi ve varyasyonu, OXPHOS fonksiyonunun çeşitli bilimsel sorularını ele almak için çeşitli SUIT protokolleri17 ve tahliller18'in geliştirilmesine yol açmıştır (12 altında gözden geçirilmiştir). Hücresel solunumun temel protokolü dört farklı durumu değerlendirir: i) rutin solunum - herhangi bir substrat veya inhibitör eklemeden ilgili solunum ortamındaki solunum, ancak endojen substratları tüketir. Bu durum, örneğin değiştirilmiş metabolit profillerinin neden olduğu genel OXPHOS veya ikincil kaynaklı solunum kusurlarını ortaya çıkarabilir. Daha sonra, ATPaz inhibitörü oligomisinin eklenmesi, iç mitokondriyal membranın protonlara geçirgenliğini ortaya çıkarır, ii) sızıntı solunumu olarak tanımlanır. Eşinsiz karbonil siyanür p-trifloro-metoksifenil-hidrazon (FCCP) gibi bir protonoforun müteakip titrasyonlanması, iii) ayrışmamış solunum olarak tanımlanan açık transmembranlı proton devre modunda ETS kapasitesinin maksimum olduğu durumun belirlenmesini sağlar. Önemli olarak, mitokondriyal membranlara aşırı mekanik hasar yoluyla deneysel müdahalelerle de ayrılmamış bir durum ortaya çıkabilir. Tersine, bağlanmamış durum, fizyolojik olarak kontrol edilen içsel bir mekanizma ile solunum ayrışmasını ifade eder. Son olarak, kompleks III inhibitörü antimisin ve kompleks I inhibitörü rotenonun eklenmesiyle ETS'nin tamamen inhibe edilmesi, mitokondriyal olmayan oksijen tüketen süreçlerden kalan oksijen tüketimini (ROX) belirler (Şekil 1A-C).
Mitokondriyal biyoenerjetik beş ayrı solunum durumundan oluşur19,20. Durum 1 solunum, endojen olarak mevcut olanlar dışında, herhangi bir ek substrat veya ADP içermez. ADP'nin eklenmesinden sonra, ancak yine de, hiçbir substrat yok, durum 2 solunumu elde edilir. Elektron transferine ve ATP sentezine izin veren substratlar eklendiğinde, durum 3 solunumuna ulaşılır. Bu durumda, OXPHOS kapasitesi ADP, inorganik fosfat, oksijen, NADH ve süksinat bağlantılı substratların doygunluk konsantrasyonlarında tanımlanabilir. Durum 4 solunumu veya LEAK solunumu, yeterli substratlara sahipken ADP'siz veya kimyasal olarak inhibe edilmiş ATP sentezleri olmayan bir durum olarak tanımlanabilir. Son olarak, kapalı bir oda ortamında tüm oksijen tükendiğinde (anoksik), durum 5 solunumu gözlenir.
Deneysel modele ve araştırma sorusuna bağlı olarak farklı uygulanabilirliğe sahip kapalı odacıklı bir sistemde zaman içinde oksijendeki azalmanın işlevi olarak ölçülen oksijen tüketiminin analizi yoluyla OXPHOS'un mevcut gerçek zamanlı değerlendirmesine hakim olan iki cihazla hücresel enerji durumlarını14 ile değerlendirmek için çeşitli yöntemler mevcuttur: Oroboros 2k yüksek çözünürlüklü respirometre ve Seahorse XF hücre dışı akı analizörü. Her iki cihaz da oksijen tüketim oranlarını, saniyede oksijen pikomollerinde (pmol) (O2) bir azalma olarak, oda veya mikroplaka kuyusu içinde mutlak bir değer olarak kaydeder. Kütle başına spesifik oksijen tüketimi, ilgili oksijen tüketiminin hücre sayısı (milyonlarca), doku ağırlığı (mg) veya protein miktarı başına belirli bir tampon tarifinde normalleştirilmesiyle elde edilir.
O2k (Oroboros Instruments), polarografik oksijen sensörü (oda tabanlı yüksek çözünürlüklü respirometre olarak kısaltılır: cHRR) ile donatılmış kapalı iki odacıklı bir sistemdir. Her deney odası, manyetik karıştırıcılar tarafından homojen tutulan 2 mL sıvı tutar. Polarografik oksijen sensörü, oksijeni ölçmek için amperometrik bir yaklaşım kullanır: altın bir katot, bir gümüş / gümüş klorür anot ve bir KCI çözeltisi arasında, üzerine bir voltajın (0.8 V) uygulandığı bir elektrokimyasal hücre oluşturur. Tahlil ortamından gelen oksijen, 25 μm florlu etilen propilen membrandan (O2-geçirgen) yayılır ve katotta indirgenerek hidrojen peroksit üretir. Anotta, gümüş hidrojen peroksit tarafından oksitlenir ve bir elektrik akımı üretir. Bu elektrik akımı (amper) doğrusal olarak kısmi oksijen basıncı ile ilişkilidir. Oksijen konsantrasyonunu hesaplamak için kısmi oksijen basıncı ve tahlil ortamının oksijen çözünürlük faktörü kullanılır. Oksijen kısmi basıncı deneysel sıcaklığa bağlı olduğundan ve polarografik ölçümler sıcaklığa duyarlı olduğundan, sıcaklıktaki dalgalanmalar bir Peltier ısıtma bloğu tarafından hassas (±0.002 ° C) düzenlemeye ihtiyaç duyar. Sıcaklık 4 °C ile 47 °C aralığında kontrol edilebilir.
Seahorse XF hücre dışı akı analizörü (Agilent), üç floresan elektrodunun her bir kuyucukta zaman içinde oksijen tüketimini ölçtüğü 24 veya 96 delikli mikroplaka formatına sahip plaka tabanlı bir sistemdir (mikroplaka tabanlı yüksek çözünürlüklü respirometre olarak kısaltılır: mHRR). Tahlil sırasında otomatik enjeksiyon için tahlil kartuşundaki maksimum dört port mevcuttur. Bir tahlil, her biri üç fazlı birden fazla döngü içerir: 1) karıştırma, 2) bekleme ve 3) ölçüm. Ölçüm aşamasında, sensör probları mikroplakaya indirilir ve yayılan ışığı ölçmek için 7-10 μL hacim içeren geçici olarak kapalı bir oda oluşturulur. Bu ışık, fosforesans söndürmeye dayalı olarakO2'yi algılayan sensör problarının ucundaki polimer gömülü floroforlar tarafından yayılır. Floresan sinyalinin yoğunluğuO2 ile orantılıdır ve sensörün ve tahlil ortamının sıcaklığından etkilenir. Bu nedenle, doğru oksijen tahmini, herhangi bir numune olmadan arka plan kuyusu ile göreceli bir yaklaşım gerektirir. Oksijen konsantrasyonunun geri kazanılması, karıştırma aşamasında, sensör geçici odanın üzerindeki hacmi karıştırmak için yukarı ve aşağı hareket ettiğinde gerçekleşir. Her döngü bir oksijen tüketim oranını hesaplar. Sıcaklık 16 °C ile 42 °C aralığında kontrol edilebilir.
HRR, primer ve mitokondri ile ilişkili hastalıklarda ve genel hücresel metabolizmada hücresel biyoenerjetik değerleri değerlendirmek için altın standarttır. Bu çalışmada, hücre ve dokularda OXPHOS fonksiyonunu değerlendirmek için HRR için temel protokoller sağlanmıştır.
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63000/63000fig2v2.jpg"> Şekil 2: cHRR için hücre ve doku preparatları için iş akışı ve mHRR respirometrisi için hücre hazırlığı . (A) Sağlanan protokollerin ana hatları. (B) Memeli hücreleri (adım 1.2): HEK293 pelet 3 x 106 hücreye eşittir (sol panel). Fibröz olmayan doku (adım 1.3): 2 mL Teflon çömlekçide (orta panel) murin beyincik lizatının hazırlanması. cHRR respirometrisi için saponun neden olduğu iskelet kası geçirgenliği (adım 1.4) sağ panel). (C) Standart mikroplaka tohumlama düzeni (adım 2.4) ve mHRR respirometrisi için ökaryotik hücrelerin (HEK293) analizi için akıcılık kontrolü. (D, E) mHRR respirometrisi için enjeksiyon port yükleme şeması (adım 2.4). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63000/63000fig02large.jpg" target="_blank">Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>

<table><tbody><tr><td>2 mL Potter-Elvehjem Cam / PTFE Doku Öğütücü / Homojenizatör</td><td>Omni International</td><td>07-358029</td><td></td></tr><tr><td>%95 O2, %5 CO2 tıbbi gaz karışımı</td><td></td><td></td><td>Potter doku taşlama için</td></tr><tr><td>ADP</td><td>Sigma</td><td>A 4386</td><td></td></tr><tr><td>Antimisin A</td><td>Sigma</td><td>A 8674</td><td>Kimyasal</td></tr><tr><td>Askorbat</td><td>Merck</td><td>PHR1279-1G</td><td>Kimyasal, etanolde çözün</td></tr><tr><td>BSA (yağ içermez)</td> <td>Sigma</td><td>A 6003</td><td>Kimyasal</td></tr><tr><td>CaCO3</td><td>Sigma</td><td>C 4830</td><td>Kimyasal</td></tr><tr><td>Sitokrom c</td><td>Sigma</td><td>C 7752</td><td>Kimyasal</td></tr><tr><td>Digitonin</td><td>Sigma</td><td>D 5628</td><td>Kimyasal</td></tr><tr><td>Dithiothreitol</td><td>Sigma</td><td>D 0632</td><td>Kimyasal, DMSO</td></tr><tr><td>D-Sükroz</td><td>Roth</td><td>4621.1</td><td>Kimyasal</td></tr><tr><td>Dulbecco' içinde çözün s değiştirilmiş Kartal' s orta (Yüksek glikoz)</td><td>Fisher Scientific</td><td>41965-039</td><td>Kimyasal</td></tr><tr><td>Dulbecco' s değiştirilmiş Kartal' S Orta&nbsp; (Glikoz yok)</td><td>Fisher Scientific</td><td>A14430-01</td><td></td></tr><tr><td>EGTA</td><td>Sigma</td><td>E 4378</td><td></td></tr><tr><td>Etomoksir</td><td>Sigma</td><td>E1905</td><td>Kimyasal</td></tr><tr><td>Falcon 15 ml Konik Santrifüj Tüpleri</td><td>Fisher Scientific</td><td>AM12500</td><td></td></tr><tr><td>Chemical Falcon 50 ml Konik Santrifüj Tüpleri</td><td>Fisher Scientific</td><td>AM12501</td><td></td></tr><tr><td>FCCP</td><td>Sigma</td><td>C 2920</td><td></td></tr><tr><td>Glikoz</td><td>Sigma</td><td>G7021</td><td>Kimyasal, etanol içinde çözün</td></tr><tr><td>Glutamat</td><td>Sigma</td><td>G 1626</td><td></td></tr><tr><td>Kimyasal GlutaMax&nbsp;( 100x)&nbsp; (200 nM&nbsp; L-alanil-L-glutamin dipeptit)</td><td>Fisher Scientific</td><td>35050061</td><td>Kimyasal</td></tr><tr><td>HEK293 hücreleri</td><td>ATTC</td><td>CRL-1573</td><td></td></tr><tr><td>Hemositometre</td><td>Fisher Scientific</td><td>0267151B</td><td>Hücre sayımı için alet</td></tr><tr><td>Hepes</td><td>Sigma</td><td>H 7523</td><td></td></tr><tr><td>Kimyasal İmidazol</td><td>Fluka</td><td>56750</td><td>Kimyasal</td></tr><tr><td>KCl</td><td>Merck</td><td>1.04936</td><td>Kimyasal</td></tr><tr><td>L-karnitin</td><td>Sigma</td><td>C0283</td><td>Kimyasal</td></tr><tr><td>Malat</td><td>Sigma</td><td>M 1000</td><td>Kimyasal</td></tr><tr><td>MES hidrat</td><td>Sigma</td><td>M8250</td><td>Kimyasal</td></tr><tr><td>MgCl2</td><td>Sigma</td><td>M 9272</td><td>Kimyasal</td></tr><tr><td>Na2ATP</td><td>Sigma</td><td>A 2383</td><td>Kimyasal</td></tr><tr><td>Na2</alt>Fosfokreatin</td><td>Sigma</td><td>P 7936</td><td>Kimyasal</td></tr><tr><td>Na-piruvat&nbsp;( 100 mM)&nbsp; (100 kat)</td><td>Fisher Bilimsel</td><td>11360070</td><td></td></tr><tr><td>NEAA&nbsp;( Esansiyel olmayan amino asitler) 100x</td><td>Fisher Scientific</td><td>11140035</td><td></td></tr><tr><td>Normal FBS&nbsp;( 10x)</td><td>Fisher Scientific</td><td>10500064</td><td></td></tr><tr><td>O2k-Core: Oxygraph-2k</td><td>Oroboros Instruments</td><td>10000-02</td><td>Yüksek çözünürlüklü respirometri cihazı</td></tr><tr><td>O2k-Titrasyon Seti</td><td>Oroboros Instruments</td><td>20820-03</td><td>Kimyasal enjeksiyonlar için Hamilton şırıngaları</td></tr><tr><td>Oligomisin</td><td>Sigma</td><td>O 4876</td><td>Kimyasal, etanolde çözün</td></tr><tr><td>Palmitoilkarnitin</td><td>Sigma</td><td>P 4509</td><td>Kimyasal</td></tr><tr><td>Penisilin-Streptomisin</td><td>Fisher Scientific</td><td>15140122</td><td></td></tr><tr><td>Pierce BCA Protein Test</td><td>Kiti Fisher Scientific</td><td>23227</td><td></td></tr><tr><td>Piruvat</td><td>Sigma</td><td>P 2256</td><td>Kimyasal</td></tr><tr><td>RIPA-Tampon</td><td>Fisher Scientific</td><td>89900</td><td>Kimyasal</td></tr><tr><td>Rotenon</td><td>Sigma</td><td>R 8875</td><td>Kimyasal, etanol içinde çözün</td></tr><tr><td>Saponin</td><td>Sigma</td><td>S7900</td><td>Kimyasal</td></tr><tr><td> Denizatı XF DMEM tahlili orta paketi, pH 7.4</td><td> Agilent, Santa Clara, CA</td><td>103680-100</td><td></td></tr><tr><td>Denizatı XFe96 Hücre Dışı Akı Analizörü</td><td> Agilent, Santa Clara, CA</td><td></td><td>Yüksek verimli respirometri cihazı</td></tr><tr><td>Denizatı XFe96 FluxPak</td><td> Agilent, Santa Clara, CA</td><td></td><<td>br/> Tahlil plakaları, kartuşlar, bileşikleri tahlil kartuşuna aktarmak için yükleme kılavuzları ve kalibant çözeltisi içerir.</td></tr><tr><td>Küçük makas</td><td>Fisher Scientific</td><td>08-951-20</td><td></td></tr><tr><td>Sodyum azid</td><td>Sigma</td><td>S2002</td><td>Kimyasal</td></tr><tr><td>Süksinat</td><td>Sigma</td><td>S 2378</td><td>Kimyasal</td></tr><tr><td>Taurin</td><td>Sigma</td><td>T 8691</td><td>Kimyasal</td></tr><tr><td>TMPD</td><td>Sigma</td><td>T 3134</td><td></td></tr><tr><td>Kimyasal Tripan Mavi çözeltisi</td><td>Merck</td><td>72-57-1</td><td>Kimyasal</td></tr><tr><td>Tripsin% 0.25 EDTA</td><td>Fisher Scientific</td><td>25200056</td><td></td></tr><tr><td>İki ince kenarlı forseps</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-000-122</td><td></td></tr><tr><td>Üridin stoğu (500x)</td><td>Sigma</td><td>U3750</td><td>Kimyasal</td></tr></tbody></table>

oda ve plaka tabanlı respirometreler kullanarak hücrelerdeki ve dokulardaki biyoenerjetik değerleri değerlendirmek için yüksek Çözünürlüklü respirometri

High-Resolution Respirometry to Assess Bioenergetics in Cells and Tissues Using Chamber- and Plate-Based Respirometers

Yüksek çözünürlüklü respirometri (HRR), bireysel hücresel enerji durumlarının analizi ve çeşitlendirilmiş substrat-unkuplör-inhibitör titrasyonu (SUIT) protokolleri kullanılarak solunum komplekslerinin değerlendirilmesi için oksidatif fosforilasyonun gerçek zamanlı olarak izlenmesine olanak tanır. Burada, iki yüksek çözünürlüklü respirometri cihazının kullanımı gösterilmiştir ve kültürlenmiş hücrelerin, iskelet ve kalp kası liflerinin ve beyin ve karaciğer gibi yumuşak dokuların analizi için geçerli temel bir protokol koleksiyonu sunulmaktadır. Kültürlenmiş hücreler ve dokular için protokoller, her ikisi de standart solunum protokollerini kapsayan oda bazlı bir respirometre ve mikroplaka tabanlı bir respirometre için kültürlenmiş hücreler için sağlanmıştır. Karşılaştırmalı amaçlar için, çoklu solunum sistemi eksikliğine neden olan mitokondriyal translasyonda eksik olan CRISPR mühendisliği HEK293 hücreleri, solunumdaki hücresel kusurları göstermek için her iki cihazla birlikte kullanılır. Her iki respirometre de, incelenen araştırma sorusuna ve modeline bağlı olarak ilgili teknik yararları ve uygunlukları ile hücresel solunumun kapsamlı bir şekilde ölçülmesine izin verir.

Burada, ökaryotik hücrelerdeki, fibröz olmayan dokudaki (örneğin, beyincik) ve fibröz dokudaki (örneğin, iskelet kası) mitokondriyal biyoenerjetik maddeleri belirlemek için protokoller sunuyoruz. Ökaryotik hücreler için, mitokondriyal translasyonla ilişkili iki farklı proteinin CRISPR mühendisliği nakavtına sahip HEK293, çoklu (CRISPRKO1) ve şiddetli / tam OXPHOS eksikliği (CRISPRKO2) ile sonuçlanan cHRR (Şekil 3A-C) veya mHRR (Şekil 3A-D</stron...

Yüksek çözünürlüklü respirometreler kullanılarak oksidatif fosforilasyonun değerlendirilmesi, mitokondri ve hücresel enerji metabolizmasının fonksiyonel analizinin ayrılmaz bir parçası haline gelmiştir. Burada, oda ve mikroplaka tabanlı yüksek çözünürlüklü respirometreler kullanılarak hücresel enerji metabolizmasının analizi için protokoller sunuyoruz ve her cihazın temel faydalarını tartışıyoruz.

Oda ve Plaka Tabanlı Respirometreler Kullanarak Hücrelerdeki ve Dokulardaki Biyoenerjetik Değerleri Değerlendirmek için Yüksek Çözünürlüklü Respirometri

High-resolution respirometry (HRR) allows monitoring oxidative phosphorylation in real-time for analysis of individual cellular energy states and ...

Mitokondri, hücre içindeki hemen hemen tüm işlemlere katkıda bulunan oksidatif fosforilasyon yoluyla hücresel enerji sağlar. Sonuç olarak, mitokondriyal disfonksiyonlar geniş bir hastalık yelpazesi ile ilişkilidir. Bu tekniğin temel avantajı, mitokondriyal biyoenerjetik maddelerin oksijen tüketimi ile gerçek zamanlı olarak ölçülmesi ve böylece toplam hücresel enerji metabolizmasının doğru bir şekilde değerlendirilmesidir.Yüksek çözünürlüklü respirometri, oksidatif fosforilasyon sisteminde neyin başarısız olduğunun doğrudan değerlendirilmesine izin verir, potansiyel olarak birincil mitokondriyal hastalıklarda ve birçok bozuklukla ilişkili sekonder mitokondriyal disfonksiyonlarda tanısal ipuçları sağlar. Prosedürü gösteren, laboratuvarımda doktora öğrencisi olan Ryan Awadhpersad olacak. Başlamak için, respirometreleri 2.1 mililitre mitokondriyal solunum ortamında 37 santigrat derecede 45 dakikadan fazla çalıştırarak oksijen kalibrasyonunu gerçekleştirin ve temel varyasyon saniyede dört pikomol içindeyse devam edin.Yüksek glikozlu DMEM'deki kültür HEK293 hücreleri,% 10 ısıl aktive FBS, GlutaMAX, esansiyel olmayan amino asitler, sodyum piruvat ve idrar ile desteklenmiştir 37 santigrat derecede% 5 karbondioksitte. Deney gününde, hücreleri toplayıp sayın ve 2,5 mililitre solunum ortamında 2,5 milyon hücreyi yeniden askıya alın. Rutin solunumu değerlendirmek için, odaya 2.3 mililitre sıcak solunum orta hücre süspansiyonu ekleyin.Odaları 37 santigrat derecede ve 700 RPM'lik bir karıştırma hızında çalıştırın. Ortamın gazdan arındırılmasına izin vermek için en az üç dakika bekleyin, ardından durdurucuyu dönen bir hareketle döndürerek odaları kapatın. Daha sonra, tıpanın üstündeki fazla sıvıyı aspire edin.10 dakika sonra, rutin veya durum I solunumu kaydetmek için sabit bir oksijen akısı sinyali alın. Sağlam hücrelerde OXPHOS analizi yapmak için, 10-nanomolar'ın son konsantrasyonu için iki mikrolitre 0.01-milimolar oligomisin ekleyin. FCCP'yi iki milimolar stoktan titre ederek 0.2 mikrolitrelik adımlarda 0.6 mikrolitre ekleyerek solunumda herhangi bir artış gözlenmez ve solunum maksimum olarak ayrılır.Daha sonra, 0.5 mikromolar'lık son bir konsantrasyon için bir mikrolitre bir milimolar rotenon ekleyin. Daha sonra, mililitre başına bir mikrogramlık son konsantrasyon için mililitre antimisin stoğu başına bir miligramlık iki mikrolitre ekleyin. Pistonu kaldırarak odayı aynı oksijen seviyesine, yaklaşık 150 mikromolara kadar yeniden oksijenlendirin.Daha sonra, iki milimolar'ın son konsantrasyonu için beş mikrolitre 0.8 molar askorbat ekleyin. Daha sonra, 0.5 milimolarlık bir son konsantrasyon için derhal beş mikrolitre 0.2-molar TMPD ekleyin ve kompleks IV aktivitesini değerlendirin. TMPD ile tepe oksijen akısına ulaşıldığında, 10 milimolar'lık son bir konsantrasyon için beş mikrolitre veya dört molar azid ekleyin.Ardından, karmaşık IV baz seviyesi hesaplaması için TMPD'nin otomatik oksidasyonunu test etmek üzere en az beş dakika boyunca çalışmaya devam edin. Çalıştırmadan sonra, her odadan bir mililitre numune süspansiyonu toplayın ve geçirgenleştirilmiş hücreler için 1.000 G'de veya doku lizatı için 20.000 G'de santrifüj yapın. Ardından, süpernatantı atın ve daha fazla aşağı akış analizi için peleti eksi 80 santigrat derecede dondurun.İlk olarak, hücreleri bireysel hücre hatlarının büyüme oranlarına göre tohumlayın. Oligomisin, FCCP, rotenon ve antimisin'i üç mikrolitre tahlil ortamında sırasıyla 1.5-mikromolar, 1.125-mikromolar ve bir mikromolar nihai konsantrasyonuna kadar seyreltin. Daha sonra, bunları ayrı bağlantı noktalarına doldurun.Numunelerin eşit bir şekilde yüklenmesini sağlamak için enjeksiyon portlarını gözlemleyin. Mikroplaka tabanlı sistemi ve bilgisayarı açın ve en az üç saat boyunca 37 santigrat derecede dengeleyin. Mikroplaka bazlı tahlil gününde, hücre kültürü plakasının akıcılığını, hücrelerin morfolojisini doğrulayın ve arka plan kuyularının boş olduğundan emin olun.Ardından, her bir kuyucuktan 20 mikrolitre kültür ortamı dışındaki her şeyi çıkarın. Daha sonra, her bir kuyucuğu 90 mikrolitre tahlil ortamı ile yıkayın ve 120 mikrolitreye kadar nihai bir hacim yapmak için 100 mikrolitre tahlil ortamı ekleyin. Daha sonra, plakayı 60 dakika boyunca karbondioksitsiz bir inkübatörde 37 santigrat derecede inkübe edin.Plakayı inkübatörden aldıktan sonra, kapağı çıkarın ve mikro plakayı yuvaya yerleştirin. Çalıştırmayı başlatmak için Devam'a tıklayın. Çalıştırma bittikten sonra, plakayı çıkarın ve hücreleri rahatsız etmeden kalan tahlil ortamını çıkarın.Ardından, tüm plakayı eksi 80 santigrat derecede dondurun. Digitonin geçirgenlik ve solunum deneyleri yapıldıktan sonra, vahşi tip HEK293 hücrelerinin ve CRISPR aracılı gen nakavtına sahip HEK293 hücrelerinin ham oksijen tüketim izleri kaydedildi ve çoklu OXPHOS eksikliklerine neden oldu. Üst üste binmiş hücre girişi normalleştirilmiş oksijen tüketim izleri elde edildi.CRISPR nakavt 1, bozulmuş solunum, CRISPR nakavt 2, hücre numarasına normalleştirildiğinde vahşi tipe kıyasla solunum göstermez. Solunum durumlarının mutlak değerlerini ve ilgili akı kontrol oranlarını belirlemek için protein miktarları ölçüldü ve solunum değerleri protein miktarına normalleştirildi. CRISPR nakavt 2'de OXPHOS eksikliği için hücre dışı asitleşme oranlarının arttığı bulunmuştur, bu da HEK293 hücrelerinde mitokondriyal oksidatif fosforilasyon eksikliğinin artmış glikoliz yoluyla telafi edildiğini düşündürmektedir.Ayrıca solunum değerleri oligomisin, FCCP ve rotenon varlığında belirlendi ve elde edilen değerler protein miktarına normalleştirildi. Çoklu OXPHOS eksikliğine neden olan CRISPR aracılı mitokondriyal translasyon eksikliği olan vahşi tip HEK293 hücrelerinin ve HEK293 hücrelerinin protein normalize oksijen tüketimi izleri incelenmiştir. Islak ağırlıkta doku normalize oksijen tüketimi ile fare beyinciği ve fare soleus kası izleri elde edildi.Soleus kasları, beyincikten üç kat daha yüksek OXPHOS ve solunum kapasitesi gösterir. Oda bazlı respirometri ile hızlı çalışmak önemlidir, çünkü numunelerinizi topladığınız anda mitokondriyal fonksiyon azalacaktır ve plaka bazlı respirometri ile değişkenliği en aza indirmek için optimum tohumlama yoğunluğu elde etmek çok önemlidir. Daha fazla analiz için, protein niceliği veya immüno-lekelenme mümkündür.Bu, mitokondriyal solunum fonksiyonundaki bir değişikliğin OXPHOS komplekslerinin bolluğundan mı yoksa mitokondriyal miktardan mı kaynaklandığını belirleyebilir. Zaten bir yüzyıl önce, kanser hücrelerinin mitokondriyal OXPHOS'a ek olarak anaerobik glikoliz gerçekleştirdiği bulundu. Bu, mitokondriyal biyoenerjetik testleri test etme ihtiyacının altını çizmektedir.Burada bugünün altın standardı olarak kabul edilen iki respirometreyi gösterdik.

high-resolution-respirometry-to-assess-bioenergetics-cells-tissues

Research

JoVE Journal

Biology

Biyoloji

Yüksek çözünürlüklü Solunum mitokondriyal oksijen tüketimini belirlemek için kullanılır. Bu mitokondriyal solunum zinciri kompleksleri '(I-IV) solunum hızları, maksimum mitokondriyal elektron transport sistem kapasitesi ve mitokondriyal dış membran bütünlüğü belirlemek için basit bir tekniktir.

Yüksek çözünürlüklü Solunum permeabilize ve bozulmamış Hücreleri Mitokondrial fonksiyonu değerlendirmek için

Bu iletişim kuralı bozulmadan 832/13 beta yüksek çözünürlüklü basınçlırespirometri kullanarak hücreleri glikoz-aracılı değişiklikler doğal bileşikler huzurunda mitokondrial solunum etkisini ölçmek için hedeftir.

Doğal bileşikler varlığında olduğu gibi Beta hücrelerinin mitokondriyal işlev ölçmek için yüksek çözünürlüklü basınçlırespirometri

Bu iletişim kuralı calorespirometry, ısı dağılımı ve enerji metabolizmasını değerlendirmek için invaziv olmayan bir yaklaşım sağlar solunum yolu tarif etmek ve aynı anda ölçümü anlatılmaktadır. Bu teknik enerji kullanımı aerobik ve anaerobik yolları katkısı toplam hücresel enerji akışı izleyerek değerlendirmek için kullanılır.

Calorespirometry: Hücresel enerji metabolizması araştırmak için bir güçlü, invaziv olmayan bir yaklaşım

İnsan retinal pigment epitel hücrelerinin (H-RPE) metabolik durumu, sağlıklarını ve işlevlerini yansıtır. Burada, yüksek çözünürlüklü respirometri kullanarak H-RPE'nin gerçek zamanlı metabolik akısını incelemek için optimize edilmiş bir protokol sunulmaktadır.

Primer İnsan Retinal Pigment Epitel Hücrelerinde Yüksek Çözünürlüklü Respirometri Kullanılarak Biyoenerjetik Biyoenerjetik Analizinin Gerçek Zamanlı Analizi

Sperm mitokondriyal fonksiyonunun yüksek çözünürlüklü respirometri ile analizi, kapalı bir oda sisteminde serbestçe hareket eden spermatozoanın oksijen tüketiminin ölçülmesine izin verir. Teknik, sperm mitokondriyal özellikleri ve bütünlüğü hakkında bilgi sağlayan insan spermatozoasında solunumu ölçmek için uygulanabilir.

İnsan Spermatozoasında Mitokondriyal Fonksiyonu Değerlendirmek için Yüksek Çözünürlüklü Respirometri

İzole edilmiş periferik kan mononükleer hücreleri, bağışıklık fonksiyonlarının ve bozukluklarının, metabolik hastalıkların veya mitokondriyal fonksiyonların analizi için kullanılabilir. Bu çalışmada, PBMC'lerin tam kandan hazırlanması ve ardından kriyoprezervasyon için standartlaştırılmış bir yöntem tanımlanmıştır. Kriyoprezervasyon bu zaman ve mekandan bağımsız hale getirir.

İnsan Periferik Kan Mononükleer Hücrelerinin Kriyoprezervasyonu ve Biyoenerjetik Değerlendirmesi

Burada, yüksek çözünürlüklü respirometri için 0.5 mL odacığın, uygun enstrümantal O2 arka plan düzeltmesi uygulandığında 2.0 mL oda ile tutarlı sonuçlar gösterdiğini gösteriyoruz. Daha az numune gerektirir, bu da sınırlı kullanılabilirlik veya düşük solunum kapasitesi olan çalışmalar için avantajlıdır.

Küçük hacimli bir odada yüksek çözünürlüklü respirometri

Burada plaka tabanlı katı diyet kısıtlaması yapmak için bir protokol...

Katı Plaka tabanlı Diyet Kısıtlama Caenorhabditis elegans</em

Yüksek çözünürlüklü erime analizi (HRMA) ile bir araya PCR zebrafish genotip için hızlı ve etkili bir yöntem olarak gösterilmiştir.

Yüksek çözünürlüklü Melt Analizi ile PCR kullanarak hızlı ve verimli Zebra Genotiplemesi

Metabolik bozukluklar, insanlarda en yaygın hastalıklardan biri arasında yer alıyor. Genetik uysal bir model organizma D. melanogaster metabolizmasını düzenleyen yeni genleri tanımlamak için kullanılabilir. Bu çalışma da CO 2 üretimini ölçerek sinekler metabolizma hızı okuyan sağlayan nispeten basit bir yöntem tarif etmektedir.

Metabolik Oranı Ölçümü<em&gt; Drosophila</em&gt; Respirometrik kullanarak

Öğrenin, oda ve plaka tabanlı yüksek çözünürlüklü respirometreler kullanarak HEK293 hücrelerinde mitokondriyal oksidatif fosforilasyonu ve biyoenerjetik değerleri nasıl değerlendireceğinizi.

Oda ve Plaka Tabanlı Respirometreler Kullanarak Hücrelerdeki ve Dokulardaki Biyoenerjetik Değerleri Değerlendirmek için Yüksek Çözünürlüklü Respirometri (Video) | JoVE Journal

Oda ve Plaka Tabanlı Respirometreler Kullanarak Hücrelerdeki ve Dokulardaki Biyoenerjetik Değerleri Değerlendirmek için Yüksek Çözünürlüklü Respirometri

Daha fazla video keşfet