Sivrisinek Aedes aegypti'de Yüksek Çözünürlüklü Eriyik Analizi Kullanarak CRISPR/Cas9 Mutagenesis'i Takip Eden Indel Tespiti
10 Eylül 2021
Bu makalede, CRISPR/Cas9 tarafından indüklenen indellerin hızlı tanımlanması ve sivrisinek Aedes aegypti'deki mutant çizgilerinin yüksek çözünürlüklü eriyik analizi kullanılarak seçilmesi için bir protokol ayrıntılı olarak açıklanmıştır.
Bu protokol, CRISPR/Cas9 teknolojisi tarafından üretilen mutantları çok sayıda kişiden tespit etmenin çok basit ve verimli bir yoludur. Bu tekniğin iki temel avantajı, birkaç saat içinde yapılabilmesi ve çok sayıda organizma için uygulanabilir olmasıdır. Astar tasarımı belirli genler için zorlu olabilir ve HRMA'yı verimli hale getirmek için birden fazla astar tasarımı ve doğrulaması gerekebilir.
Degrade PCR gerçekleştirmek için ana karışım hazırlayarak başlayın. Ardından şablon olmayan kontrol veya NTC için 19 mikrolitre ana karışımı 96 kuyulu bir plakada çıkarın. Ardından, şablonu kalan ana karışıma ekleyin.
Aliquot 20 mikrolitre numune karışımı 96 kuyu plakasına. Bisiklet parametrelerini izleyerek PCR yapın ve daha sonra yazıda belirtilen parametreleri kullanarak termal eriyik profillerini oluşturun. Gerekli tüm malzemeleri topladıktan sonra, genotiplenecek kişi başına 0,5 mikrolitre DNA salınım reaktifi ve 20 mikrolitre seyreltme tamponu ile bir ana karışım hazırlayın.
Çok kanallı bir pipet kullanarak, karışımın 20 mikrolitresini bir PCR plakasına aliquotlayın ve PCR plakasını buz üzerinde bırakın. Daha sonra, uyuşturulmuş G1 sivrisineklerini sakinleştirmek için cam bir Petri kabına yerleştirin ve ikinci Petri kabına sekiz vahşi tip sivrisinek yerleştirin. Bir çift cımbızı% 70 etanol ile silin ve sivrisineklerin arka ayaklarından birini çıkarmak için dezenfekte edilmiş cımbızı kullanın.
Daha sonra bacağı DNA salınım reaktif çözeltisine batırın. Sivrisinekleri ilgili şişeye yerleştirin ve şişeyi bir süngerle kapatın. Tamamlandığında, bacağı bir sonraki sivrisinekten çıkarmadan önce 96 kuyu plakası tamamlanana kadar cımbızı% 70 etanol ile silin.
Daha sonra, plakayı optik bir PCR plaka contası ile kapatın ve bacakları oda sıcaklığında içeren PCR plakasını iki ila beş dakika kuluçkaya yatırın, ardından iki dakika boyunca 98 santigrat derecede inkübasyon yapın. Plakanın oda sıcaklığına soğumasını bekleyin. PCR için, tercih edilen bileşenleri içeren bir ana karışım hazırlayın ve ardından 19 mikrolitre ana karışımı 96 kuyu plakasının her kuyusuna aktarmak için çok kanallı bir pipet kullanın.
Daha önce hazırlanmış sivrisinek DNA'sını içeren DNA salınım çözeltisinin bir mikroliterini plakaya aktardıktan sonra, plakayı optik bir PCR plaka contası ile kapatın. El yazmasında açıklanan parametreleri izleyerek termal eriyik profilleri oluşturmak için PCR'yi uygun döngü parametreleriyle gerçekleştirin, ardından referans kümesine vahşi tip kontrol atayarak erime profillerini inceleyin. Farklı kümeleri 96 kuyu şablonunda karşılık gelen renklerle işaretleyin.
Daha sonra, ilgi kıvrımları olan bireyleri seçin ve seçilen bireyleri tüplerden arka çapraza çıkarın. Kan besleme dişi yaptı, ardından G2As toplamak. Temsili analizde, Aedes aegypti'nin ZIP11 mutantının sıra analizi gösterilmiştir.
Aedes aegypti ZIP11 heterozid mutantlarından alınan elektroferogram, indelin meydana geldiği nükleotid pozisyonunu gösteriyordu. Çok biçimli pozisyonlar her iki nükleotidleri de eşlik ettiği için indel, tekten çift tepeye bir kayma ile temsil edilir. Çalıştırmanın sonunda, silinen veya eklenen temel çiftlerin sayısı tek tepeler sayılarak hesaplandı.
Aedes aegypti ZIP11 ve myo-fem genlerinde mutasyonlar içeren sivrisinekler genotiplendi ve HRMA'nın yüksek çözünürlüklü eriyik analizi kullanılarak sıralandı. Örneklerin floresan sinyalleri bir ila sıfır arasında göreceli değerlere normalleştirildi. Ayrıca, her eğri vahşi tür başvurusundan çıkarılır ve karşılık gelen büyütmeyi gösterilir.
Gruplar arasında uygun bir ayrımın yapılmadığı temsili sonuçlarda başarısız bir otomatik küme ataması gösterilir. Ayrıca, her örnek ayrı ayrı analiz edildi ve heterozozygotlar, homozigotlar ve transheterozigotların referans örneklerine benzerlik esas alınarak doğru gruplara atandı. HRMA'ları gerçekleştirdikten sonra, mutasyona uğramış bireylerden DNA'nın sıraya konması, indelleri analiz etmek ve hedeflenen dizideki diğer mutasyonları tanımlamak için gereklidir.
Tam transkripti görüntüleyin ve binlerce bilimsel videoya erişin
Genel Bakış
Bu makale, yüksek çözünürlüklü erime analizi kullanılarak Aedes aegypti sivrisineğinde CRISPR/Cas9 ile indüklenen indel'lerin hızlıca tanımlanması ve mutant hatların seçilmesi için bir protokolü detaylandırmaktadır. Bu yöntem verimlidir, çeşitli organizmalara uygulanabilir ve mutantların hızlı bir şekilde tespit edilmesine olanak tanır.
Çalışmanın Temel Bileşenleri
Bilim Alanı
- Genetik
- Moleküler Biyoloji
- Entomoloji
Arka Plan
- CRISPR/Cas9 teknolojisi, gen düzenleme için yaygın olarak kullanılmaktadır.
- Mutasyonların etkili bir şekilde tanımlanması, genetik çalışmalar için kritik öneme sahiptir.
- Yüksek çözünürlüklü erime analizi (HRMA), hızlı bir tespit yöntemi sunar.
- Primer tasarımındaki zorluklar, HRMA'nın verimliliğini etkileyebilir.
Çalışmanın Amacı
- CRISPR kaynaklı mutasyonların tanımlanması için bir protokol sağlamak.
- HRMA'nın çeşitli organizmalardaki uygulanabilirliğini göstermek.
- Mutant hat seçimi sürecini optimize etmek.
Kullanılan Yöntemler
- PCR için bir master mix hazırlanması.
- 96 kuyucuklu plakada şablon içermeyen kontrollerin (NTC) kullanımı.
- Koşulları optimize etmek için gradyan PCR.
- İndellerin saptanması için yüksek çözünürlüklü erime analizi.
Ana Sonuçlar
- Protokol, mutantların hızlı bir şekilde tanımlanmasına olanak tanır.
- HRMA birkaç saat içinde tamamlanabilir.
- Verimlilik için birden fazla tur primer tasarımı gerekebilir.
- Yöntem, farklı türler genelinde çok yönlüdür.
Sonuçlar
- Bu protokol, mutant tespitinin verimliliğini artırır.
- Sivrisineklerdeki genetik araştırmalar için değerli bir araç sağlar.
- Gelecekteki çalışmalar, daha geniş uygulamalar için bu yöntemin üzerine inşa edilebilir.
Sıkça Sorulan Sorular
Yönetici Endüstriyel Uygunluğu
CRISPR/Cas9 tarafından indüklenen indel'lerin hızlı tespiti, vektör kontrol araştırmalarında hedef doğrulamayı verimli hale getirerek fonksiyonel gen çalışmaları için gereken süreleri kısaltır. Yüksek çözünürlüklü erime analizi (HRM), organizma kurban edilmesine gerek kalmadan ölçeklenebilir genotiplemeyi destekleyerek sonraki fenotipik deneylerin ve genetik çaprazlamaların önünü açar. Bu yaklaşım, minimal doku örneklerinden kantitatif mutasyon tespiti sağlayarak erken keşif aşamasındaki öngörü güvenilirliğini artırır.
Biyofarma Ar-Ge'sinde Stratejik Uygulamalar
Erken Keşif ve Hedef Doğrulama
- Bilimsel Değer: CRISPR mutajenezini takiben hızlı indel tespiti yoluyla terapötik hipotezlerin sorgulanmasına olanak tanır.
- Operasyonel Değer: Organizmaları feda etmeden mutant alellerin belirlenmesini sağlayarak biyolojik risk azaltmayı destekler ve örneklerin takip analizleri için korunmasını sağlar.
- Portföy Etkisi: Hedef doğrulama iş akışlarını hızlandırarak, hastalıkla ilgili sistemlerde gen hedeflerinin daha hızlı önceliklendirilmesine imkan verir.
Tarama ve Analiz Geliştirme
- Bilimsel Değer: Yaban tip ve mutant genotiplerin kantitatif karşılaştırılmasını sağlayan normalize edilmiş floresan erime eğrileri üretir.
- Operasyonel Değer: 96 kuyucuklu plaka formatlarıyla uyumludur ve düzenlenmiş bireylerin orta ölçekli taramasını destekler.
- Analiz Hazırlığı: Heterozigotlar, homozigotlar ve transheterozigotlar için ayırt edilebilir erime profilleri oluşturarak güvenilir küme atamasına olanak tanır.
Translasyonel ve Preklinik Araştırmalar
- Translasyonel Süreklilik: Genotiplendirmeyi takiben fenotiplendirme veya kan beslemesine olanak tanıyarak, hastalık modellerinde genetik modifikasyonu fonksiyonel sonuçlarla ilişkilendirir.
- Mekanistik Risk Azaltma: Ardışık sekanslama yoluyla indel karakterizasyonunu kolaylaştırarak, hedef üzerindeki etkileri doğrular ve potansiyel hedef dışı modifikasyonları tanımlar.
- Preklinik Model Desteği: Arbovirüs iletim çalışmaları için temel bir vektör olan Aedes aegypti türünde mutant hatların oluşturulmasını sağlar.
Boru Hattı ve İş Akışı Entegrasyonu
Bu yöntem, CRISPR mutajenezinden öncü bileşik tanımlamaya kadar uzanan keşif sürecine uyum sağlayarak, fonksiyonel doğrulama öncesinde bir genotipleme kontrol noktası sunar.
- Keşif Biyolojisi: Hedef yolaklarda gen fonksiyonunu bozan indel'lerin hızla tanımlanmasıyla hipotez testlerini destekler.
- Tarama: Normalize edilmiş erime eğrisi analizi ve referans tabanlı kümeleme yoluyla assay standardizasyonuna olanak tanır.
- Analitikler: Indel boyutuyla ilişkili olan kantitatif erime profili kaymaları oluşturarak örnekler arasında karşılaştırmalı analize imkan verir.
- Translasyonel Araştırma: Genotipleme sonrası canlı organizma kullanımına izin vererek genetik modifikasyonu fenotipik değerlendirme ile ilişkilendirir.
- Kurumsal Yeniden Kullanım: Primer tasarım adaptasyonu ile geniş hedef uygulanabilirliğini destekleyerek farklı organizmalar ve genler genelinde yeniden kullanılabilir.
Operasyonel ve Kurumsal Etki
- Bilimsel Değer: Gen düzenleme sonuçlarına dair doğrudan kanıtlar sağlayarak hedef doğrulamadaki öngörü güvenini artırır.
- Operasyonel Değer: Yerleşik kontroller içeren standartlaştırılmış PCR ve eritme analizi protokolleri sayesinde tekrarlanabilirliği geliştirir.
- Stratejik Değer: Mutant taraması için gereken zaman ve kaynakları azaltarak sermaye verimliliğini artırır.
- Portföy Etkisi: Fenotipik analizlere yatırım yapmadan önce mutasyon varlığını onaylayarak riskten arındırılmış ilerlemeye olanak tanır.
Uygulama Hususları
- Bazı genlerin verimli HRMA için birden fazla tasarım yinelemesine ihtiyaç duyabilmesi nedeniyle, primer tasarımı ve optimizasyonu konusunda uzmanlık gerektirir.
- Yüksek çözünürlüklü erime analizi için hassas sıcaklık artış kontrolü ve floresans deteksiyonuna sahip cihazlara bağımlıdır.
- Tutarlı girdi kalitesini sağlamak için bacak dokusu ve DNA salınım reaktifleri kullanılarak standartlaştırılmış örnek hazırlama gerektirir.
- Doğru küme ataması ve erime profili normalizasyonu için yaban tipi referans örnekler gerektirir.
- İndellerin tam olarak karakterize edilmesi ve hedef dizideki ek mutasyonların tespit edilmesi için HRMA sonrası sekanslama ihtiyacı nedeniyle sınırlıdır.
Biyofarma SSS
Chapters in this video
0:05
Introduction
0:33
A Gradient PCR Using Genomic DNA (gDNA) from a Single Individual
1:09
Preparation of Genomic DNA from Mosquito Legs
2:31
Perform PCR
3:35
Results: Detection of CRISPR/Cas9-Induced Indels and the Establishment of Mutant Lines in the Mosquito Aedes aegypti
5:02
Conclusion
