Name: Yapışma Ayak İzi Tahlili ile Hücre Yuvarlanmasında Görüntüleme Moleküler Yapışması (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-09-27T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 24 s
Description: Öğrenin, hücre yuvarlanma yapışmasında moleküler kuvvetleri görüntülemek ve nicelendirmek için yapışma ayak izi tahlili yöntemini. Bu protokol, bireysel yapışma olaylarını TIRF mikroskobisi ile inceleyerek hücre davranışı ve mekanobiyoloji araştırmalarına katkı sağlar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Bu çalışma Kanada İnovasyon Vakfı (CFI 35492), Kanada Doğa Bilimleri ve Mühendislik Araştırma Konseyi Discovery Grant (RGPIN-2017-04407), New Frontiers in Research Fund (NFRFE-2018-00969), Michael Smith Sağlık Araştırmaları Vakfı (SCH-2020-0559) ve British Columbia Üniversitesi Saygınlık Fonu tarafından desteklendi.

<ol><li>McEver, R. P., Zhu, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rolling+cell+adhesion%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Cell+and+Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Rolling cell adhesion.</a> Annual Review of Cell and Developmental Biology. 26 (1), 363-396 (2010).</li>
<li>Ley, K., Laudanna, C., Cybulsky, M. I., Nourshargh, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Getting+to+the+site+of+inflammation%3A+The+leukocyte+adhesion+cascade+updated%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Immunology%22%5BJournal%5D)">Getting to the site of inflammation: The leukocyte adhesion cascade updated.</a> Nature Reviews Immunology. 7 (9), 678-689 (2007).</li>
<li>Zarbock, A., Ley, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neutrophil+adhesion+and+activation+under+flow%5BTitle%5D)+AND+%22Microcirculation%22%5BJournal%5D)">Neutrophil adhesion and activation under flow.</a> Microcirculation. 16 (1), 31-42 (2009).</li>
<li>Etzioni, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adhesion+molecules+-+Their+role+in+health+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Pediatric+Research%22%5BJournal%5D)">Adhesion molecules - Their role in health and disease.</a> Pediatric Research. 39 (2), 191-198 (1996).</li>
<li>van de Vijver, E., vanden Berg, T. K., Kuijpers, T. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Leukocyte+adhesion+deficiencies%5BTitle%5D)+AND+%22Hematology%2FOncology+Clinics+of+North+America%22%5BJournal%5D)">Leukocyte adhesion deficiencies.</a> Hematology/Oncology Clinics of North America. 27 (1), 101-116 (2013).</li>
<li>Hanna, S., Etzioni, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Leukocyte+adhesion+deficiencies%5BTitle%5D)+AND+%22Annals+of+the+New+York+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">Leukocyte adhesion deficiencies.</a> Annals of the New York Academy of Sciences. 1250 (1), 50-55 (2012).</li>
<li>Geng, Y., Marshall, J. R., King, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glycomechanics+of+the+metastatic+cascade%3A+Tumor+cell-endothelial+cell+interactions+in+the+circulation%5BTitle%5D)+AND+%22Annals+of+Biomedical+Engineering%22%5BJournal%5D)">Glycomechanics of the metastatic cascade: Tumor cell-endothelial cell interactions in the circulation.</a> Annals of Biomedical Engineering. 40 (4), 790-805 (2012).</li>
<li>Yasmin-Karim, S., King, M. R., Messing, E. M., Lee, Y. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((E-selectin+ligand-1+controls+circulating+prostate+cancer+cell+rolling%2Fadhesion+and+metastasis%5BTitle%5D)+AND+%22Oncotarget%22%5BJournal%5D)">E-selectin ligand-1 controls circulating prostate cancer cell rolling/adhesion and metastasis.</a> Oncotarget. 5 (23), 12097-12110 (2014).</li>
<li>Marshall, B. T., Long, M., Piper, J. W., Yago, T., McEver, R. P., Zhu, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+observation+of+catch+bonds+involving+cell-adhesion+molecules%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Direct observation of catch bonds involving cell-adhesion molecules.</a> Nature. 423 (6936), 190-193 (2003).</li>
<li>Hammer, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adhesive+dynamics%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biomechanical+Engineering%22%5BJournal%5D)">Adhesive dynamics.</a> Journal of Biomechanical Engineering. 136 (2), 021006(2014).</li>
<li>Yasunaga, A. B., Murad, Y., Kapras, V., Menard, F., Li, I. T. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+interpretation+of+cell+rolling+velocity+distribution%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Journal%22%5BJournal%5D)">Quantitative interpretation of cell rolling velocity distribution.</a> Biophysical Journal. 120 (12), 2511-2520 (2021).</li>
<li>Li, I. T. S., Ha, T., Chemla, Y. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mapping+cell+surface+adhesion+by+rotation+tracking+and+adhesion+footprinting%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Mapping cell surface adhesion by rotation tracking and adhesion footprinting.</a> Scientific Reports. 7 (1), 44502(2017).</li>
<li>Yasunaga, A. B., Li, I. T. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantification+of+fast+molecular+adhesion+by+fluorescence+footprinting%5BTitle%5D)+AND+%22Science+Advances%22%5BJournal%5D)">Quantification of fast molecular adhesion by fluorescence footprinting.</a> Science Advances. 7 (34), (2021).</li>
<li>Dempsey, G. T., Vaughan, J. C., Chen, K. H., Bates, M., Zhuang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+fluorophores+for+optimal+performance+in+localization-based+super-resolution+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Evaluation of fluorophores for optimal performance in localization-based super-resolution imaging.</a> Nature Methods. 8 (12), 1027-1040 (2011).</li>
<li>Zhu, M., Lerum, M. Z., Chen, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((How+to+prepare+reproducible%2C+homogeneous%2C+and+hydrolytically+stable+aminosilane-derived+layers+on+silica%5BTitle%5D)+AND+%22Langmuir%22%5BJournal%5D)">How to prepare reproducible, homogeneous, and hydrolytically stable aminosilane-derived layers on silica.</a> Langmuir. 28 (1), 416-423 (2012).</li>
<li>Chandradoss, S. D., Haagsma, A. C., Lee, Y. K., Hwang, J. H., Nam, J. M., Joo, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Surface+passivation+for+single-molecule+protein+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">Surface passivation for single-molecule protein studies.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (86), e50549(2014).</li>
<li>Schnitzbauer, J., Strauss, M. T., Schlichthaerle, T., Schueder, F., Jungmann, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Super-resolution+microscopy+with+DNA-PAINT%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Super-resolution microscopy with DNA-PAINT.</a> Nature Protocols. 12 (6), 1198-1228 (2017).</li>
<li>Chalfoun, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MIST%3A+Accurate+and+scalable+microscopy+image+stitching+tool+with+stage+modeling+and+error+minimization%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">MIST: Accurate and scalable microscopy image stitching tool with stage modeling and error minimization.</a> Scientific Reports. 7 (1), 4988(2017).</li>
<li>Wang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Constructing+modular+and+universal+single+molecule+tension+sensor+using+protein+G+to+study+mechano-sensitive+receptors%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Constructing modular and universal single molecule tension sensor using protein G to study mechano-sensitive receptors.</a> Scientific Reports. 6, 1-10 (2016).</li>
<li>Crockett-Torabi, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selectins+and+mechanisms+of+signal+transduction%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Leukocyte+Biology%22%5BJournal%5D)">Selectins and mechanisms of signal transduction.</a> Journal of Leukocyte Biology. 63 (1), 1-14 (1998).</li>
<li>Ye, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+P-selectin+and+PSGL-1+axis+accelerates+atherosclerosis+via+activation+of+dendritic+cells+by+the+TLR4+signaling+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Death+and+Disease%22%5BJournal%5D)">The P-selectin and PSGL-1 axis accelerates atherosclerosis via activation of dendritic cells by the TLR4 signaling pathway.</a> Cell Death and Disease. 10 (7), 507(2019).</li>
<li>Saha, K., Bender, F., Gizeli, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparative+study+of+IgG+binding+to+proteins+G+and+A%3A+Nonequilibrium+kinetic+and+binding+constant+determination+with+the+acoustic+waveguide+device%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Comparative study of IgG binding to proteins G and A: Nonequilibrium kinetic and binding constant determination with the acoustic waveguide device.</a> Analytical Chemistry. 75 (4), 835-842 (2003).</li>
<li>Murad, Y., Li, I. T. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantifying+molecular+forces+with+serially+connected+force+sensors%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Journal%22%5BJournal%5D)">Quantifying molecular forces with serially connected force sensors.</a> Biophysical Journal. 116 (7), 1282-1291 (2019).</li>
<li>Yasunaga, A. B., Murad, Y., Li, I. T. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantifying+molecular+tension-classifications%2C+interpretations+and+limitations+of+force+sensors%5BTitle%5D)+AND+%22Physical+Biology%22%5BJournal%5D)">Quantifying molecular tension-classifications, interpretations and limitations of force sensors.</a> Physical Biology. 17 (1), 011001(2020).</li>
</ol>

Yazarlar çıkar çatışması olmadığını beyanda bulunun.

Yapışma ayak izi tahlili, hücre yuvarlama yapışması sırasında PSGL-1 ve P-selectin arasındaki moleküler yapışma olaylarının görselleştirilmesini sağlar. Bu işlem P-selectin aracılı yakalama ve ardından akışkan kesme stresi altında yuvarlanma ile başlatılır. Deney sırasındaki potansiyel sorunlar genellikle hücreler iyi yuvarlandığında bile zayıf hücre yuvarlanmasını veya floresan izlerinin eksik olduğunu içerir. Bu sorunlar genellikle sorun giderme tablosunda listelendiği gibi protokoldeki kritik adımlardaki kalite kontro...

Yuvarlanan yapışma kaskadı, dolaşımdaki hücrelerin kan damarı duvarına nasıl bağlı olduğunu ve yuvarlanmasını açıklar1. Pasif haddeleme öncelikle hücresel yapışma moleküllerinin (CAM)1 ana sınıfı olan selectinler tarafından aracılık edilir. Kanın kesme akışı altında, P-selectin glikoprotein ligand-1'i (PSGL-1) ifade eden lökositler, iltihaplı endotel hücrelerinin yüzeyinde ifade edilebilecek P-selectin ile oldukça geçici bağlar oluşturur. Bu işlem lökositlerin iltihaplanma bölgesine göç etmesi için kritik öneme sahiptir2. Buna ek olarak, PSGL-1 aynı zamanda P-selectin3 ile etkileşimi üzerine yuvarlanan yapışma basamaklamanın sonraki sıkı yapışma aşamasını tetikleyebilen bir mekanosensitive reseptördür.
CAM fonksiyonunu etkileyen genetik mutasyonlar, lökosit yapışma eksikliğinin (LAD) nadir görülen hastalığı gibi bağışıklık sistemini ciddi şekilde etkileyebilir, burada yuvarlanmaya aracılık eden yapışma moleküllerinin arızalanması ciddi şekilde bağışıklık sistemi baskılanmış bireylere yol açar4,5,6. Ek olarak, dolaşımdaki tümör hücrelerinin benzer bir yuvarlanma sürecini takiben göç ettiği ve metastaz7,8'e yol açtığına gösterilmiştir. Bununla birlikte, hücre haddeleme hızlı ve dinamik olduğundan, geleneksel deneysel mekanobiyoloji yöntemleri hücre yuvarlanması sırasında moleküler etkileşimleri incelemek için uygun değildir. Atomik kuvvet mikroskopisi ve optik cımbız gibi tek hücreli ve tek moleküllü manipülasyon yöntemleri, P-selectin'in PSGL-1 ile tek molekül seviyesinde kuvvete bağımlı etkileşimi9 gibi moleküler etkileşimleri inceleyebilebilirken, hücre yuvarlanması sırasında canlı yapışma olaylarını araştırmak için uygun değildir. Ek olarak, in vitro karakterize etkileşim, moleküler yapışma in vivo hakkındaki soruyu doğrudan cevaplayamaz. Örneğin, hücreler kendi ortamlarında çalışırken hangi moleküler gerilim aralığı biyolojik olarak ilgilidir? Yapışkan dinamiği simülasyonu10 veya basit sabit durum modeli11 gibi hesaplama yöntemleri, belirli moleküler ayrıntıları ve yuvarlanma davranışını nasıl etkilediklerini yakalamış, ancak modelleme parametrelerinin ve varsayımlarının doğruluğuna son derece bağlıdır. Çekme kuvveti mikroskopisi gibi diğer teknikler hücre göçü sırasında kuvvetleri tespit edebilir, ancak moleküler gerilim hakkında yeterli mekansal çözünürlük veya nicel bilgi sağlamaz. Bu tekniklerin hiçbiri, kendi ortamlarındaki hücre fonksiyonu ve davranışıyla doğrudan ilişkili olan moleküler kuvvetlerin zamansal dinamikleri, mekansal dağılımı ve büyüklük heterojenliği hakkında doğrudan deneysel gözlemler sağlayamaz.
Bu nedenle, selep aracılı etkileşimleri doğru bir şekilde ölçebilen bir moleküler kuvvet sensörü uygulamak, yuvarlanma yapışma anlayışımızı geliştirmek için çok önemlidir. Burada, PSGL-1 kaplamalı boncukların p-selectin fonksiyonelleştirilmiş gerilim ölçer tethers (TGTs)13 sunan bir yüzeye yuvarlandığı yapışkan ayak izi tahlil12 protokolünü açıklıyoruz. Bu TGT'ler, floresan okuma şeklinde kalıcı yırtılma olaylarının geçmişine neden olan geri dönüşü olmayan DNA tabanlı kuvvet sensörleridir. Bu, TGT'nin (dsDNA) yırtılması ve daha sonra yırtılan TGT'nin (ssDNA) floresan etiketli tamamlayıcı iplikçikle etiketlenerek elde edilir. Bu sistemin en büyük avantajlarından biri, hem kırınım sınırlı hem de süper çözünürlüklü görüntüleme ile uyumluluğudur. Floresan etiketli tamamlayıcı iplikçik, kırınım sınırlı görüntüleme için kalıcı olarak (>12 bp) veya DNA PAINT aracılığıyla süper çözünürlüklü görüntüleme için geçici olarak bağlanabilir (7-9 bp). Bu, TGT'ler aktif haddeleme sırasında yırtıldığı için yuvarlanma yapışıklıklarını incelemek için ideal bir sistemdir, ancak floresan okuma yuvarlanma sonrası analiz edilir. İki görüntüleme yöntemi ayrıca kullanıcıya yuvarlanan yapışıklıkları araştırmak için daha fazla özgürlük sağlar. Tipik olarak, kırınım sınırlı görüntüleme floresan yoğunluğu üzerinden moleküler yırtılma kuvveti çıkarmak için yararlıdır13, süper çözünürlüklü görüntüleme ise reseptör yoğunluğunun nicel analizine izin verir. Haddeleme yapışmasının bu özelliklerini araştırma yeteneği ile bu yaklaşım, yuvarlanan hücrelerin kesme akışı altında moleküler yapışması üzerindeki kuvvet düzenleme mekanizmasını anlamak için umut verici bir platform sağlar.

<table><tbody><tr><td>4 kanallı matkap kılavuzu</td> ABS filament ile <td>özel yapım</td><td></td><td>3D baskılı</td></tr><tr><td>4 delikli kızak</td><td>Özel yapım</td><td></td><td>Alüminyum kelepçe üzerindeki 8-32 dişli deliğin merkezleriyle eşleşen bir düzene sahip 4 kanallı bir matkap kılavuzu üzerinde elmas kaplı matkap uçlarına sahip bir Dremel kullanarak temiz mikroskop kızağı delin.</td></tr><tr><td>Aseton</td><td>VWR</td><td>BDH1101-4LP</td><td></td></tr><tr><td>Akrilik ara parça</td><td>Özel yapım</td><td></td><td>40 mm x 30 mm x 2,5 mm boyutlarında iki blok akrilik levha kesin. Her blokta, alüminyum tutucu üzerindeki 3-4 deliklerle tam olarak hizalanmış iki adet 40 mm'lik delik açın.</td></tr><tr><td>Alüminyum talaş tutucu</td><td>Özel yapım</td><td></td><td>Makine eloksallı alüminyum blok, dış boyutu 640 mm x 500 mm x 65 mm ve açıklık boyutu 400 mm x 380 mm x 65 mm olan C şeklinde bir tutucuya yerleştirilmiştir. Giriş ve çıkışlar 8-32 diş ile vidalanır.</td></tr><tr><td>Aminosilan</td><td>AlfaAesar</td><td>L14043</td><td>CAS 1760-24-3</td></tr><tr><td>Antibiyotik/antimikotik çözelti</td><td>Cytiva HyClone</td><td>SV3007901</td><td>Kalem/Strep/Fungiezon</td></tr><tr><td>Boncuklar, ProtG kaplı polistiren</td><td>Spherotech</td><td>PGP-60-5</td><td></td></tr><tr><td>Sığır serum albümini</td><td>VWR</td><td>332</td><td></td></tr><tr><td>Tampon, DNA BOYA</td><td></td><td></td><td>%0,05 Tween-20, 5 mM Tris, 75 mM MgCl2</alt>, 1 mM EDTA</td></tr><tr><td>Tamponu, T50M5</td><td></td><td></td><td>10mM Tris, 50 mM NaCl, 5 mM MgCl<alt>2</alt></td></tr><tr><td>Tampon,</td> 2mM CaCl ile Haddeleme <td></td><td></td><td>HBSS < alt >2< / alt >, 2 mM MgCl<alt >2< / alt >, 10 mM Hepes,% 0.1 BSA</td></tr><tr><td>Tamponu, Yıkama</td><td></td><td></td><td>10 mM Tris, 50 mM NaCl, 5 mM MgCl<alt>2</alt> ve 2 mM CaCl<alt>2</alt>, %0,05 Tween 20</td></tr><tr><td>Kalsiyum klorür</td><td>VWR</td><td>BDH9224</td><td></td></tr><tr><td>Hücre kültürü şişeleri</td><td>VWR</td><td>10062-868</td><td></td></tr><tr><td>Konsantre sülfürik asit</td><td>VWR</td><td>BDH3072-2.5LG</td><td>% 95-98</td></tr> <tr><td>Lamel tutma cımbız</td><td>Techni-Tool</td><td>758TW150</td><td></td></tr><tr><td>Elmas kaplı matkap bitler</td><td>Aşındırıcı teknoloji</td><td>C5250510</td><td>0,75 mm elmas matkap</td></tr><tr><td>DNA, amin-ssDNA (üst iplikçik)</td><td>IDT DNA</td><td>Özel oligo</td><td>CCGGGCGACGCAGGAGGG /3AmMO/</td></tr><tr><td>DNA, biotin-ssDNA (alt iplikçik)</td><td>IDT DNA</td><td>Özel oligo</td><td>/5BiotinTEG/ TTTTT CCCTCCTGCGTCGCCCGG</td></tr><tr><td>DNA, DNA-PAINT</td><td>IDT DNA</td> için görüntüleyici iplikçik <td>Özel oligo</td><td>GAGGGAAA TT/3Cy3Sp/</td></tr><tr><td>DNA, kalıcı etiketleme için görüntüleyici iplikçik</td><td>IDT DNA</td><td>Özel oligo</td><td>CCGGGCGACGCAGG /3Cy3Sp/</td></tr><tr><td>Çift taraflı bant</td><td>Scotch</td><td>237</td><td>3/4 inç genişlik, kalıcı çift taraflı bant</td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Thermofisher</td><td>15575020</td><td>0,5 M EDTA, pH 8.0</td></tr><tr><td>Epoksi</td><td>Goril</td><td>42001</td><td>5 dakika kürlenme süresi</td></tr><tr><td>Fetal Sığır Serumu (FBS)</td><td>Avantor</td><td>97068-085</td><td></td></tr><tr><td>GelGreen</td><td>Biotium</td><td>41005</td><td></td></tr><tr><td>Buzlu asetik asit</td><td>VWR</td><td>BDH3094-2.5LG</td><td></td></tr><tr><td>Cam, Lameller</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-548-5P</td><td></td></tr><tr><td>Cam, Mikroskop lamı</td><td>VWR</td><td>48300-026</td><td>75 mm x 25 mm x 1 mm</td></tr><tr><td>Cam, Boyama kavanozu</td><td>VWR</td><td>74830-150</td><td>Buğday Boyama Kavanozu (900620)</td></tr><tr><td>Hanks'in Dengeli Tuz çözeltisi (HBSS)</td><td>Lonza</td><td>04-315Q</td><td></td></tr><tr><td>Hemositometre</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Z359629-1EA</td><td></td></tr><tr><td>HL-60 hücreleri</td><td>ATCC</td><td>CCL-240</td><td></td></tr><tr><td>Nem odası slayt desteği</td> ABS filament ile <td>özel yapım</td><td></td><td>3D baskılı</td></tr><tr><td>Hidrojen peroksit</td><td>VWR</td><td>BDH7690-1</td><td>%30</td></tr> <tr><td>İmidazol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I2399</td><td></td></tr><tr><td>Girişler/çıkışlar</td><td>Özel yapım</td><td></td><td>Kobalt matkap uçları kullanarak sekiz adet 8-32 ayar vidasını delin. 1,5 cm&nbsp; polietilen boru (Tygon, ID 1/32 "OD 3/32") her içi boş ayar vidasına</td></tr><tr><td>Iscove Modifiye Dulbecco Media (IMDM)</td> <td>Lonza</td><td>12-722F</td><td></td></tr><tr><td>Magnezyum klorür</td><td>VWR</td><td>BDH9244</td><td></td></tr><tr><td>Manyetik Ni-NTA boncukları</td><td>Invitrogen</td><td>10103D</td><td></td></tr><tr><td>Posta tüpleri</td><td>EMS</td><td>EMS71406-10</td><td></td></tr><tr><td>Metanol</td><td>VWR</td><td>BDH1135-4LP</td><td></td></tr><tr><td>Mikro Bio-Spin P-6 Jel Sütunları</td><td>Biorad</td><td>7326200</td><td>SSC Tamponunda</td></tr><tr><td>PEG</td><td>Laysan Bio</td><td>MPEG-SVA-5000</td><td></td></tr><tr><td>PEG-biotin</td><td>Laysan Bio</td><td>Biotin-PEG-SVA-5000</td><td></td></tr><tr><td>Potasyum hidroksit</td><td>VWR</td><td>470302-132</td><td></td></tr><tr><td>Protein, Protein G</td><td>Abcam</td><td>ab155724</td><td>N-terminal His-Tag ve C-terminali sistein</td></tr><tr><td>Proteini, P-selektin-Fc</td><td>R& D Sistemi</td><td>137-PS</td><td>Rekombinant İnsan P-Selectin/CD62P Fc Chimera Proteini, CF</td></tr><tr><td>Proteini, Streptavidin</td><td>Sedir</td><td>CL1005-01-5MG</td><td></td></tr><tr><td>Pompa Şırıngası</td><td>Harvard Aparatı</td><td>704801</td><td></td></tr><tr><td>Sodyum bikarbonat</td><td>Koğuş ' s Science</td><td>470302-444</td><td></td></tr><tr><td>Sodyum klorür</td><td>VWR</td><td>97061-274</td><td></td></tr><tr><td>Sulfo-SMCC</td><td>Thermofisher</td><td>22322</td><td></td></tr><tr><td>Şırınga</td><td>Hamilton</td><td>81520</td><td>PTFE luer kilitli şırıngalar, 5 mL</td></tr><tr><td>Şırınga iğneleri</td><td>BD</td><td>305115</td><td>Hassas Kayma 26 G, 5/8 İnç Uzunluk</td></tr><tr><td>TCEP</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C4706-2G</td><td></td></tr><tr><td>Tris</td><td>VWR</td><td>BDH4502-500GP</td><td></td></tr><tr><td>Boru, Adaptör</td><td>Tygon</td><td>ABW00001</td><td>Formülasyon 3350, ID 1/32"; OD 3/32"</td></tr><tr><td>Boru, Polietilen</td><td>BD Intramedic</td><td>427406</td><td>Intramedic (PE20) İç Çap 0.38mm; OD 1.09mm</td></tr><tr><td>Ara-20</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>93773</td><td></td></tr></tbody></table>

yapışma ayak İzi tahlili ile hücre yuvarlanmasında görüntüleme moleküler yapışması

Imaging Molecular Adhesion in Cell Rolling by Adhesion Footprint Assay

Selelin aracılı etkileşimlerle kolaylaştırılan yuvarlanan yapışıklık, lökositlerin iltihaplanma bölgesine alınmasında son derece dinamik, pasif bir hareketliliktir. Bu fenomen, kan akışının endotel hücreleri üzerinde yuvarlanan bir hareketle lökositleri ittiği postkapsiller venülelerde ortaya çıkar. Kararlı haddeleme, yapışma bağı oluşumu ile mekanik olarak tahrik edilen ayrışmaları arasında hassas bir denge gerektirir ve hücrenin akış yönünde yuvarlanırken yüzeye bağlı kalmasını sağlar. Nispeten statik ortamlarda meydana gelen diğer yapışma işlemlerinin aksine, yuvarlanan hücreler saniyede onlarca mikronda binlerce mikronun üzerinde hareket ettiği için yuvarlanan yapışma son derece dinamiktir. Sonuç olarak, çekiş kuvveti mikroskopisi gibi geleneksel mekanobiyoloji yöntemleri, gerekli kısa zaman ölçeği ve yüksek hassasiyet nedeniyle bireysel yapışma olaylarını ve ilişkili moleküler kuvvetleri ölçmek için uygun değildir. Burada, P-selectin: PSGL-1 etkileşimlerini moleküler düzeyde yuvarlanma yapışmasında görüntüleyene kadar yapışma ayak izi testinin en son uygulamasını açıklıyoruz. Bu yöntem, floresan izleri şeklinde moleküler yapışma olaylarının kalıcı bir geçmişini üretmek için geri dönüşü olmayan DNA tabanlı gerilim ölçer tethers kullanır. Bu izler iki şekilde görüntülenebilir: (1) geniş bir görüş alanı oluşturmak için kırınım sınırlı binlerce görüntüyü bir araya getirmek, her yuvarlanan hücrenin binlerce mikron uzunluğundaki yapışma ayak izinin çıkarılmasını sağlamak, (2) floresan izlerinin süper çözünürlüklü görüntülerini küçük bir görüş alanı içinde yeniden oluşturmak için DNA-PAINT gerçekleştirmek. Bu çalışmada, farklı kesme gerilmelerinde yuvarlanan HL-60 hücrelerini incelemek için yapışkan ayak izi tahlili kullanılmıştır. Bunu yaparken, P-selectin: PSGL-1 etkileşiminin mekansal dağılımını görüntüleyebildik ve floresan yoğunluğu ile moleküler güçleri hakkında fikir edindik. Bu nedenle, bu yöntem moleküler düzeyde yuvarlanan yapışmada yer alan çeşitli hücre-yüzey etkileşimlerinin nicel olarak araştırılması için zemin hazırlar.

Yukarıdaki protokol, yapışkan ayak izi testinin deneysel prosedürünü açıklar. Genel deney iş akışı Şekil 1'de, akış odası montajından (Şekil 1A) yüzey fonksiyonelleştirmesine (Şekil 1B) ve deney ve görüntüleme adımlarına (Şekil 1C) kadar gösterilmiştir.
Şekil 2 , ProtG-ssDNA biyokonjugasyon karakterizasyonu için temsili bir sonuçtur. Nihai üründe...

Bu protokol, hızlı hücre yuvarlaması yapışması sırasında yapışma olaylarını görüntüleyene kadar yapışma ayak izi testini gerçekleştirmek için deneysel prosedürleri sunar.

Yapışma Ayak İzi Tahlili ile Hücre Yuvarlanmasında Görüntüleme Moleküler Yapışması

Rolling adhesion, facilitated by selectin-mediated interactions, is a highly dynamic, passive motility in recruiting leukocytes to the site of ...

Bu protokol, moleküler düzeyde yuvarlanan yapışma ve uzamsal haritalama ve ölçmeye izin vermenin yanı sıra moleküler kuvvet ve hücre yuvarlanma davranışı arasındaki bağlantıyı kurmaya yardımcı olur. Bu teknik, gerçek hücre yuvarlanması sırasında bireysel yapışma olaylarını incelememizi sağlayarak fizyolojik ilgili moleküler yapışma kuvvetini doğrudan ölçmemizi sağlar. Her adımda uygun konsantrasyon ve kuluçka süresini kullanarak yüzey hazırlığı, yüksek kaliteli yüzey fonksiyonelleştirmesi elde etmek için çok önemlidir.Biyokonjugasyonların kalitesi ve uygun koşullar da çok önemlidir. Görsel gösterim, araştırmacıların bu protokolü çoğaltmasına yardımcı olmak için kritik öneme sahiptir. Özellikle, akış odası montajı ve işlem sonrası görüntüler gibi adımlar görsel bir gösteriden büyük fayda sağlayacaktır.Çift taraflı bandın her iki tarafına jiletle az miktarda epoksi serperek başlayın. Lazer kullanarak, dört kanal oluşturmak için epoksi kaplı bandı kesin. Epoksi bandı dört delikli bir slayt ve PEG kapak kapağı arasına sıkıştırarak akış çipini oluşturun.Pipet ucu kullanarak, iyi bir conta oluşturmak için kanalların uzunluğu boyunca hafif basınç uygulayın, ardından epoksiyi en az bir saat boyunca iyileştirin. Çipi, her kanalın açılması adaptörün merkezlerine yer olacak şekilde hizalayın. Ardından çipin üzerine iki şeffaf akrilik ara parça yerleştirin.Bloğun ortasına sıkı basınç uygulayın ve her ara çubuğun uçlarını vidalayın. Girişleri braketin diğer tarafındaki dişli deliklere vidaleyin ve şeffaf akrilik blok aracılığıyla sızdırmazlık durumunu izleyin. Sızıntı olup olmadığını kontrol etmek için hazneye 200 mikrolitre yıkama tamponu akışı.Kanalda kabarcıklar oluşursa, kabarcıkları çıkarmak için agresif bir şekilde 200 mikrolitrelik ek bir yıkama tamponu itin. Spesifik olmayan bağlanmayı önlemek için akış odasına 40 mikrolitre BSA ekleyin ve nem odasında 10 dakika kuluçkaya yatırın. Kuluçkadan sonra, akış odasına Tween 20'de 40 mikrolitre ekleyin ve spesifik olmayan bağlamayı daha da azaltmak için 10 dakika boyunca tekrar kuluçkaya yatırın.Ardından, tüm pasivasyon maddelerini çıkarmak için kanalı 200 mikrolitre yıkama tamponu ile yıkayın. Oda yüzeyi fonksiyonelleştirme için, akış odasına 40 mikrolitre Streptavidin ekleyin ve 20 dakika kuluçkaya yatırın, ardından odayı 200 mikrolitre yıkama tamponu ile yıkayın. Şimdi, akış odasına 40 mikrolitre melezlenmiş protein G-TGT ekleyin ve 20 dakika kuluçkaya yatırın.Yıkama tamponu ile yıkadıktan sonra, 40 mikrolitre protein G-TGT üst iplikçik ekleyin ve yüzeydeki herhangi bir yibridize edilmemiş TGT alt telini tamamlamak için 20 dakika kuluçkaya yatırın ve ardından yıkama tamponu ile yıkayın. Son olarak, akış odasına 40 mikrolitre P-selectin-Fc ekleyin ve yıkama tamponu ile yıkamadan önce 60 dakika kuluçkaya yatırın. Beş mililitrelik bir cam şırınnayı yuvarlanan tamponla doldurun ve şırınnanın kenarlarına dokunarak dışarı çıkın ve kabarcıkları ulaya doğru yüzerken dışarı itin.200 milimetrelik bir polietilen boru parçasına steril bir iğne yerleştirdikten sonra, iğneyi cam şırıngaya bağlayın. Şırınd'ı şırındıcı pompaya sabitleyin ve şırınna pompasını, hava kabarcıklarının kanala girmesini önlemek için piston tarafı yükselecek şekilde eğin. Tüpün ucını akış odası girişine yerleştirin.Polietilen borunun 200 milimetrelik başka bir parçasının bir ucunu prize yerleştirin ve diğer ucunu atık bir kabın içine batırın. Hücreleri peletmek için hücre süspansiyon örneğinden bir ila iki mililitre alın ve santrifüj alın. Ortamı çıkarın ve hücreleri yuvarlanan tamponun 500 mikrolitresinde hafifçe yeniden biriktirin.Boruyu girişlerden ve hücre süspansiyonunun 40 mikrolitresini akış odasına çıkış ve pipetten dikkatlice çıkarın. Kabarcıkların akış kanalına sokulmamasını sağlamak için boruyu daha önce açıklandığı gibi yeniden bağlayın. Şırınd pompasını istediğiniz akış hızlarında başlatarak hücre haddeleme deneyine başlayın.10X hedefi olan karanlık alan mikroskobu kullanarak hücre yuvarlanma gözlemleyin. Deneme tamamlandıktan sonra, yüzey hücre serbest kalana kadar yuvarlanan arabelleği saatte 100 mililitrede aşılayarak hücreleri kanaldan çıkarın. Yerel parçaları DNA-PAINT ile görüntülemek için kanala DNA-PAINT tamponunda hazırlanmış 40 mikrolitre DNA-PAINT görüntüleyiç teli ekleyin.Metin el yazmasında belirtilen koşulları kullanarak toplam iç yansıma floresan mikroskopisi gerçekleştirin. Süper çözünürlüklü görüntüleri yerelleştirin ve işleyin. Uzun parçaları kalıcı etiketleme ile görüntülemek için kalıcı görüntüleyicİ telini ekleyin ve T50M5 tamponunda 120 saniye kuluçkaya yatırın.Daha sonra 200 mikrolitre yıkama tamponu aşılayarak kanalı yıkayın. Arka plan kamerası gürültüsü elde etmek için heyecan lazeri kapalıyken bir görüntü kaydedin. TIRF mikroskopisi ile ızgara deseninde geniş bir alanı görüntüleyin.Mikroskobu 400'e 50 görüntü alanını taramak ve raw verileri ImageJ programını kullanarak her biri en fazla 10.000 görüntü içeren tek tek TIP dosyalarına bölmek için programlayın. Aydınlatma profilini kullanarak tüm görüntüleri düzleştirin ve görüntüleri dikmek için MIST eklentisini kullanın. Protein G ssDNA biyokonjugasyon karakterizasyonu için sonuç, G Maleimide ssDNA ve imidazol elution tampon spektrumunun biyokonjugasyon ürün spektrumuna uyum sağlamak için ortogonal temelden geldiği protein G'nin ssDNA'ya bir oranına yakın olduğunu göstermiştir.Native PAGE, başarılı konjugasyon ve iyi verim gösteren monomerik protein G bandına denk gelen parlak yeşil bantları gösteren biyokonjugasyonu doğrulamak için kullanıldı. Tek modlu fiberden sunulan TIRF aydınlatma profili genellikle görüş alanının ortasında daha parlaktır ve kenarların etrafında karartıcıdır. Düzensiz aydınlatmayı telafi etmek ve nicel analiz için görüntüleri düzleştirmek için aydınlatma profili, ortalama binlerce ayrı çerçeve ile belirlendi.Düzleştirilmiş görüntüler, kamera gürültüsünün hem ham hem de aydınlatma profillerinden çıkarılması ve daha sonra aydınlatma profili ile normalleştirilmesiyle üretildi. Ham dikiş, düzeltilmemiş görüntülere karşılık gelen net periyodik desenler gösterirken, düzleştirilmiş görüntülerden dikilen aynı görüş alanı düz bir arka plan oluşturdu. Hücre yuvarlanması ve tipik bir tek hücreli yapışıklık ayak izinin görülebileceği floresan izleri ile sonuçlanan kesme stresi aralığını belirlemek için bir rampa yukarı akış profili kullanılmıştır.Yetersiz kontrast, aşırı iz yoğunluğu, optimum iz yoğunluğu ve kontrastı ile kırınım sınırlı ve DNA-PAINT görüntüleme ile floresan izlerin yetersiz ve optimum sonuçları gösterilmiştir. 60 dakikadan uzun kuluçka süresi, yüzey fonksiyonelleştirmesini sağlar ve uygun oda yapısı fonksiyonel yüzeye zarar veren kabarcıkların geçişini önler. Bu prosedür, yuvarlanan yapışmada rol oynayan moleküler kuvvetin nicel analizi için geçerlidir ve araştırmacıların farklı hücre tiplerinin yuvarlanma davranışını anlamalarını sağlar.Bu teknik, araştırmacıların tek molekül ve mekanobiyoloji araştırmalarının daha da ilerlemesine yol açan hızlı yapışma olaylarıyla ilgili yeni soruları keşfetmelerini sağlar.

imaging-molecular-adhesion-in-cell-rolling-by-adhesion-footprint-assay

Research

JoVE Journal

Biology

Biyoloji

Biz asimetrik reseptör-desenli yüzeyler üzerinde hücre haddeleme yörüngelerini gözlemlemek ve analiz etmek için bir protokol açıklar. Ortaya çıkan veriler etiket ücretsiz cep ayırma ve analiz için reseptör-desenli yüzeylerin mühendisliği için yararlıdır.

Asimetrik Reseptör Desenler Hücre Rolling Yörüngeler incelenmesi

Hem molekülleri etkileşen hücrelerin yüzeylerinde demirlemiş olan reseptör-ligand etkileşimi kinetiği ölçmek için bir yapışma frekans tahlil açıklanmıştır. Bu mekanik tabanlı test mikropipet basınçlı bir insan adezyon sensörü olarak kırmızı kan hücresi ve integrin αLβ2 ve hücrelerarası adezyon molekülü-1 reseptörleri ve ligandlar etkileşim olarak kullanarak örneklenir.

Yapışma için Frekans Testi Yerinde</emHücre-Hücre Arayüz Çapraz Junctional Moleküler Etkileşimler> Kinetik Analizi

Canlı hücre göç çalışmaları için bir mikroskop odasında yapıştırıcı ve çözünür degradelerin montajı için bir yöntem tarif edilmiştir. Mühendislik ortamı çözümü degradelerle antifouling yüzeyleri ve yapıştırıcı parçaları birleştirir ve bu nedenle bir rehberlik ipuçları göreli önemini belirlemek için izin verir.

Floresan Mikroskobu ile Görüntüleme Hücre Göç Yapıştırıcı ve Çözünür Degradeler oluşturma

Bu çalışma, önemli fizyolojik olarak ilgili kesme akımı altında, hücre haddeleme çalışmalar artırıp, çok oyuklu bir plaka mikroakışkan sistemi kullanılır. Silsilesini ve hastalarda hücre ekzojen popülasyonlarının sistemik olarak uygulanmasını takiben hücre hedeflemesi önemini homing çok adımlı, hücre haddeleme önemi göz önüne alındığında, bu sistem, hücre bazlı tedaviyi geliştirmek için bir tarama platform olarak potansiyel sunmaktadır.

Sistematik Analizi In Vitro Hücre Rolling

Statik yapışma deneyi T lenfositler ve diğer hücre tipleri arasındaki etkileşimleri modellemek için kullanılabilecek bir güçlü bir araçtır. Etkileşimler, bir plaka okuyucu seri yıkama aşağıdaki yapışık hücre sayısını ölçmek için kullanılır ise, yapışma molekülleri ile kaplanmış oyuklarına etiketli T hücrelerinin enjekte edilerek üretilir.

T Lenfositlerindeki Integrin Aktivasyonunun Çalışması için statik Adezyon Deneyi

Tümörün mikro mekanik sertliği invadopodia aktivitesini artırarak ve kasılma actomyosin ile malign davranış sürüş önemli bir rol oynar. Kullanma poliakrilamid jelleri (PAAS) invadopodia ve çekiş kuvveti deneyleri bükülmezlik matris yanıt olarak kanser hücrelerinin invaziv ve kasılma özelliklerini incelemek için kullanılabilir.

Kanser Hücreleri üzerindeki Invadopodia ve Çekiş Gücü Tahliller için poliakrilamid jeller

Bu akış yapışma deneyi T hücresi epitel hücre etkileşimleri basit, çok etkili bir model sağlar. Bir şırınga pompası kayma gerilimi oluşturmak için kullanılır ve konfokal mikroskopi ölçümü için görüntü yakalar. Bu çalışmaların amacı, etkili akış koşulları kullanılarak T hücre yapışmasını ölçümüdür.

T Lenfosit-Yapışma Molekülü Etkileşimleri Çalışmaları Yapışma Altında Kesme Stres Testi

mekanik gerilim iletmek ve doku homeostazında ve geliştirme dahil sinyal yollarını başlatmak gibi hücre yüzey yapışıklıklar, mechanotransduction merkezi bulunmaktadır. Burada, ligand kaplı manyetik mikroboncukları ve yapışma reseptörlerine kuvvet uygulaması ile, gerilim cevap olarak aktive edilir biyokimyasal yollar kesme için bir protokol mevcut.

Manyetik Boncuk Kullanarak Mekanik Gerilim Cevabı Hücre Yüzey Yapışma Modelleme Analizi

Gemi duvara bağışıklık hücrelerinin dinamik yapışma gut posta için bir önkoşuldur. Burada, insan hücreleri kılcal isteyebileğinizi kaplı kullanarak dinamik hücre yapışma anti-integrin antikorlar, kemokinler ya da başka etmenlerin etkisi analizi için fonksiyonel vitro tahlil için bir iletişim kuralı mevcut.

Dinamik yapışma tahlil için anti-yapışma tedaviler iltihabi bağırsak hastalığı fonksiyonel analiz

Hızlı ve yüksek çözünürlüklü izin gelişmiş bir mikroskop düşsel hem, izole plazma zarı ve çevredeki hücre içi hacim sunulacak. Yüksek edinme hesaplı en fazla 3,5 canlı görüntüleme deneyler bir kurulum disk ve toplam iç yansıma floresans mikroskobu iplik entegrasyon sağlar görüntü yığını başına s.

Hücreleri tarafından seçilmiş adezyon oluşumunda görselleştirme gelişmiş Disk-toplam iç yansıma floresans mikroskobu iplik

Makalede, 1) odak yapışıklıklarının büyüklüğü ve sayısı ile 2) hücre şekil indeksi ve MCF7 hücrelerinin eşzamanlı monolayers konfokal görüntülerinden dağılımının nicelikselleştirilmesi açıklanmaktadır.

MCF7 HücreLi Monokatmanlarda Hücre-Substrat Adezyon Alanı ve Hücre Şekli Dağılımlarının Ölçülmesi

Öğrenin, hücre yuvarlanma yapışmasında moleküler kuvvetleri görüntülemek ve nicelendirmek için yapışma ayak izi tahlili yöntemini. Bu protokol, bireysel yapışma olaylarını TIRF mikroskobisi ile inceleyerek hücre davranışı ve mekanobiyoloji araştırmalarına katkı sağlar.

Yapışma Ayak İzi Tahlili ile Hücre Yuvarlanmasında Görüntüleme Moleküler Yapışması

Daha fazla video keşfet