Elektron Kristalografik Çalışmaları için Lipid Monolayer Yöntemi Kullanılarak Numune Hazırlama

Yıllar içinde lipid Monolayers, periferik membran proteinlerinin yanı sıra çözünür proteinlerin 2D kristalizasyonunu teşvik etmek için destekleyici bir katman olarak kullanılmıştır. Bu yöntem, bazı integral membran proteinleri olarak 2D kristalizasyona da uygulanabilir. Ancak lipid monolayer'a bölünmeyi teşvik etmek için deterjan ve diyaliz koşullarını belirlemek için daha kapsamlı ampirik araştırma gerektirir.

Hava suyu arayüzünde bir lipid monolayer oluşur, böylece lipit kutup kafa grupları sulu fazda nemli kalır. Ve lipid bölümünün polar olmayan akil kuyrukları, yüzey gerilimini kıran ve su yüzeyini düzleyen hava suyu arayüzüne. Yük doğası lipid kafa gruplarının ayırt edici kimyasal moieties çözelti proteinler için benzeşim sağlar.

Bağlamayı ve ilke 2B dizi oluşumunu teşvik etme. Bir lipid monolayer üzerinde oluşturulan herhangi bir 2D kristal, lipid tabakasındaki kristal diziyi kaldırmak ve desteklemek için kullanılan karbon kaplı bir EM ızgarası üzerinde elektron mikroskobuna kolayca aktarılabilir. Kriyojenik elektron mikroskopi görüntüleme için lipid monolayer metodolojisi olan bu yazıda açıklanmıştır.

Lipid monolayer hazırlığı. Lipid stok hazırlığı, hacim kloroform, metanol için 9:1 hacimde ml lipid karışımı başına 0.01 mg hazırlayın. 8.91 ml kloroform ve 0.99 ml metanol ve ml lipid çözeltisi başına 10 mg'ın 0.1 ml'si kullanılarak.

Teflon plaka hazırlığı. Beş dakika boyunca metanol banyosunda bir Teflon tabağı sonicate. Sıcak suyla 15 dakika yıkayın ve ardından damıtılmış su ile durulayın.

Teflon plakayı 30 dakika boyunca kurumuş bir şekilde kurulayın ve kullanıma kadar vakum altında tutun. Tampon rezervuarında lipid monolayer oluşumu. Tahmini çalışma süresi bir buçuk saat olacaktır.

Petri kabına bir tip bir filtre kağıdı yerleştirin ve Teflon bloğunu filtre kağıdının üzerine yerleştirin. Teflon plakanın kuyularını 60 mikrolitre tamponla doldurun. Tampon yüzeyinin üzerine damla damla sıvı karışım dikkatlice ekleyin.

Hamilton şırıngası kullanarak damla başına ideal olarak bir mikroliter. Filtre kağıdını damıtılmış suyla ıslatın ve Petri kabında nemi koruyun. Oda sıcaklığında 60 dakika kuluçkaya yatırılması, kloroformun buharlaşması ve tamponların yüzeyinde bir tek katmanlı lipit oluşması gerekir.

Lipid monolayer üzerinde em ızgara uygulaması. Tahmini çalışma süresi bir buçuk saat. Karbon tarafı buharlaştırmadan karbon kaplı bir EM ızgarasını her tampon rezervuarın yüzeyine hafifçe yerleştirin.

Proteinleri yan enjeksiyona dikkatlice enjekte edin, bir mikromolar etrafındaki kuyuda son protein konsantrasyonlarını kullanın. Oda sıcaklığında 60 dakika kuluçkaya yatır. Izgarayı Teflon bloğunun yüzeyinin üzerine çıkarmak için site enjeksiyon portuna yaklaşık 20 ila 30 mikrolitre tamponu hafifçe enjekte edin.

Bu, ızgarayı bir çift cımbızla almanızı ve damlacığı dikey olarak kaldırmanızı sağlar. Temsili sonuçlar. Em ızgarasına biriken bir lipid monolayer, kontrast boyama olmadan iletim elektron mikroskobu altında görselleştirilebilir.

Monolayer varlığı, bu kiriş yolunda herhangi bir örnek olmadan alandan kontrast farkı ile tanınabilir. Lipid monolayer kapsamına sahip alanlar, kapsama alanı olmayanlara göre daha düşük kontrasta sahiptir. Boş deliklerden geçen elektron ışınlarının saçılması olmadığından daha parlak bir aydınlatma gösterir.

Sonuç olarak, lipid monolayer yöntemi basitliği nedeniyle protein yapılarını incelemek için bir fırsat sunar. 2D kristalleşme sürecini kolaylaştırmak için alternatif bir yaklaşım sağlayabilir.