Elektron Kristalografik Çalışmaları için Lipid Monolayer Yöntemi Kullanılarak Numune Hazırlama
20 Kasım 2021
Lipid monolayerler, on yıllardır yapısal çalışmalar için iki boyutlu (2D) protein kristalleri oluşturmak için bir temel olarak kullanılmaktadır. Hava-su arayüzünde stabildirler ve elektron görüntüleme için ince bir destekleyici malzeme olarak hizmet verebilirler. Burada lipid monolayerlerinin biyolojik çalışmalara hazırlanması konusunda kanıtlanmış adımları sunuyoruz.
Yıllar içinde lipid Monolayers, periferik membran proteinlerinin yanı sıra çözünür proteinlerin 2D kristalizasyonunu teşvik etmek için destekleyici bir katman olarak kullanılmıştır. Bu yöntem, bazı integral membran proteinleri olarak 2D kristalizasyona da uygulanabilir. Ancak lipid monolayer'a bölünmeyi teşvik etmek için deterjan ve diyaliz koşullarını belirlemek için daha kapsamlı ampirik araştırma gerektirir.
Hava suyu arayüzünde bir lipid monolayer oluşur, böylece lipit kutup kafa grupları sulu fazda nemli kalır. Ve lipid bölümünün polar olmayan akil kuyrukları, yüzey gerilimini kıran ve su yüzeyini düzleyen hava suyu arayüzüne. Yük doğası lipid kafa gruplarının ayırt edici kimyasal moieties çözelti proteinler için benzeşim sağlar.
Bağlamayı ve ilke 2B dizi oluşumunu teşvik etme. Bir lipid monolayer üzerinde oluşturulan herhangi bir 2D kristal, lipid tabakasındaki kristal diziyi kaldırmak ve desteklemek için kullanılan karbon kaplı bir EM ızgarası üzerinde elektron mikroskobuna kolayca aktarılabilir. Kriyojenik elektron mikroskopi görüntüleme için lipid monolayer metodolojisi olan bu yazıda açıklanmıştır.
Lipid monolayer hazırlığı. Lipid stok hazırlığı, hacim kloroform, metanol için 9:1 hacimde ml lipid karışımı başına 0.01 mg hazırlayın. 8.91 ml kloroform ve 0.99 ml metanol ve ml lipid çözeltisi başına 10 mg'ın 0.1 ml'si kullanılarak.
Teflon plaka hazırlığı. Beş dakika boyunca metanol banyosunda bir Teflon tabağı sonicate. Sıcak suyla 15 dakika yıkayın ve ardından damıtılmış su ile durulayın.
Teflon plakayı 30 dakika boyunca kurumuş bir şekilde kurulayın ve kullanıma kadar vakum altında tutun. Tampon rezervuarında lipid monolayer oluşumu. Tahmini çalışma süresi bir buçuk saat olacaktır.
Petri kabına bir tip bir filtre kağıdı yerleştirin ve Teflon bloğunu filtre kağıdının üzerine yerleştirin. Teflon plakanın kuyularını 60 mikrolitre tamponla doldurun. Tampon yüzeyinin üzerine damla damla sıvı karışım dikkatlice ekleyin.
Hamilton şırıngası kullanarak damla başına ideal olarak bir mikroliter. Filtre kağıdını damıtılmış suyla ıslatın ve Petri kabında nemi koruyun. Oda sıcaklığında 60 dakika kuluçkaya yatırılması, kloroformun buharlaşması ve tamponların yüzeyinde bir tek katmanlı lipit oluşması gerekir.
Lipid monolayer üzerinde em ızgara uygulaması. Tahmini çalışma süresi bir buçuk saat. Karbon tarafı buharlaştırmadan karbon kaplı bir EM ızgarasını her tampon rezervuarın yüzeyine hafifçe yerleştirin.
Proteinleri yan enjeksiyona dikkatlice enjekte edin, bir mikromolar etrafındaki kuyuda son protein konsantrasyonlarını kullanın. Oda sıcaklığında 60 dakika kuluçkaya yatır. Izgarayı Teflon bloğunun yüzeyinin üzerine çıkarmak için site enjeksiyon portuna yaklaşık 20 ila 30 mikrolitre tamponu hafifçe enjekte edin.
Bu, ızgarayı bir çift cımbızla almanızı ve damlacığı dikey olarak kaldırmanızı sağlar. Temsili sonuçlar. Em ızgarasına biriken bir lipid monolayer, kontrast boyama olmadan iletim elektron mikroskobu altında görselleştirilebilir.
Monolayer varlığı, bu kiriş yolunda herhangi bir örnek olmadan alandan kontrast farkı ile tanınabilir. Lipid monolayer kapsamına sahip alanlar, kapsama alanı olmayanlara göre daha düşük kontrasta sahiptir. Boş deliklerden geçen elektron ışınlarının saçılması olmadığından daha parlak bir aydınlatma gösterir.
Sonuç olarak, lipid monolayer yöntemi basitliği nedeniyle protein yapılarını incelemek için bir fırsat sunar. 2D kristalleşme sürecini kolaylaştırmak için alternatif bir yaklaşım sağlayabilir.
Tam transkripti görüntüleyin ve binlerce bilimsel videoya erişin
Genel Bakış
Lipid tek tabakaları, proteinlerin iki boyutlu kristallenmesi için stabil bir temel oluşturarak yapısal çalışmaları kolaylaştırır. Bu yöntem, özellikle periferik membran proteinleri ve çözünür proteinler için kullanışlıdır ve dikkatli bir optimizasyonla integral membran proteinlerine de uyarlanabilir.
Temel Çalışma Bileşenleri
Bilim Alanı
- Biyofizik
- Yapısal Biyoloji
- Biyokimya
Arka Plan
- Lipid tek tabakaları hava-su arayüzünde oluşturulur.
- Polar baş grupları sulu fazda hidrate kalır.
- Polar olmayan açil kuyrukları hava-su arayüzüne dağılır.
- Lipid baş gruplarının kimyasal doğası protein afinitesini etkiler.
Çalışmanın Amacı
- Lipid tek tabakalarının hazırlanması için bir yöntem sunmak.
- Çeşitli proteinlerin kristalleşmesini desteklemek.
- Geliştirilmiş görüntüleme teknikleri aracılığıyla yapısal çalışmaları geliştirmek.
Kullanılan Yöntemler
- Hava-su ara yüzeyinde lipid tek tabakaların hazırlanması.
- Deterjan ve diyaliz koşullarının optimizasyonu.
- Protein bölünmesinin ampirik olarak incelenmesi.
- Yapısal analiz için elektron görüntüleme teknikleri.
Temel Sonuçlar
- Lipid tek tabakaları protein kristallenmesini etkili bir şekilde destekler.
- Belirli koşullar, proteinlerin tek tabakaya olan afinitesini artırır.
- İntegral membran proteinleri, daha fazla optimizasyon ile kristallendirilebilir.
- Yöntem, elektron görüntüleme için stabil bir platform sağlar.
Sonuçlar
- Lipid tek tabakaları, yapısal biyoloji için çok yönlü bir araçtır.
- Hem periferik hem de integral membran proteinlerinin incelenmesini kolaylaştırırlar.
- Optimal sonuçlar için koşulları geliştirmek amacıyla daha fazla araştırmaya ihtiyaç vardır.
Sıkça Sorulan Sorular
Yönetici Endüstriyel Uygunluğu
Lipid tek tabaka yöntemleri, membran ve çözünür hedeflerin yapısal tayinini destekleyerek kontrollü iki boyutlu protein kristalleştirmesine olanak tanır. Bu yaklaşım, biyofiziksel karakterizasyon için tekrarlanabilir platformlar sağlayarak hedef doğrulamayı geliştirir ve erken evre ilaç keşfindeki belirsizliği azaltır. Teknik, yüksek çözünürlüklü yapısal bilgiler aracılığıyla mekanistik risklerin azaltılmasını kolaylaştırarak öncü bileşik optimizasyonu ve portföy kararlarına bilgi sağlar.
Biyofarma Ar-Ge'sinde Stratejik Uygulamalar
Erken Keşif ve Hedef Doğrulama
- Bilimsel Değer: Hedef fonksiyonu ile ilgili protein-lipid etkileşimlerinin ve konformasyonel durumların sorgulanmasına olanak tanır.
- Operasyonel Değer: Hedef stabilitesinin ve bağlanma kapasitesinin değerlendirilmesi için standartlaştırılmış bir sistem sağlar.
- Bilimsel Değer: Doğaya yakın koşullar altında yapısal analize izin vererek fonksiyonel hedef doğrulamasını destekler.
Tarama & Analiz Geliştirme
- Bilimsel Değer: Yüksek çözünürlüklü tarama uygulamaları için uygun olan homojen ve düzenli protein dizileri oluşturur.
- Operasyonel Değer: Örnek hazırlamada tekrarlanabilirliği sağlar; bu durum, ekipler arası analiz tutarlılığı için kritiktir.
- Bilimsel Değer: Fonksiyonel analiz verileriyle korelasyona olanak tanıyan, nicelleştirilebilir yapısal çıktılar üretir.
Translasyonel ve Preklinik Araştırmalar
- Bilimsel Değer: Membran protein hedeflerine ilişkin yapısal bilgiler sunarak hastalık mekanizmalarının anlaşılmasına yardımcı olur.
- Operasyonel Değer: Sonraki kryo-EM iş akışlarıyla uyumlu, transfer edilebilir numuneler oluşturur.
- Bilimsel Değer: Yapısal özellikleri farmakolojik aktiviteyle ilişkilendirerek öngörü güvenilirliğini destekler.
İş Akışı ve Boru Hattı Entegrasyonu
Lipid tek tabaka yöntemi, yapısal karakterizasyon yoluyla hedef doğrulamayı ve öncü bileşik tanımlamayı destekleyerek erken keşif iş akışlarına entegre olur.
- Keşif Biyolojisi: Protein düzenlemelerinin ve etkileşimlerinin yapısal görselleştirmesi aracılığıyla hipotez test edilmesini kolaylaştırır.
- Tarama: Tutarlı biyofiziksel ölçümler için tek tip 2D kristaller üreterek analiz hazırlığını sağlar.
- Analitik: Ekiplerin farklı koşullar altındaki yapısal durumları karşılaştırmasına olanak tanıyan yüksek çözünürlüklü görüntüleme verileri sunar.
- Translasyonel Araştırma: Hedef mekanizmaları aydınlatarak yapısal bulguları preklinik sürekliliğe bağlar.
- Kurumsal Yeniden Kullanım: Birden fazla protein hedefi genelinde yapısal tarama için yeniden kullanılabilir bir platform oluşturur.
Operasyonel ve Kurumsal Etki
- Bilimsel Değer: Doğrudan yapısal gözlem yoluyla hedef doğrulamadaki öngörü güvenini artırır.
- Operasyonel Değer: Yapısal çalışmalar için numune hazırlamadaki tekrarlanabilirliği ve standardizasyonu geliştirir.
- Stratejik Değer: Hedef seçimindeki yapısal belirsizliği azaltarak devam/durdur kararlarını iyileştirir.
- Portföy Etkisi: Doğrulanmış yapısal ve fonksiyonel verilere dayalı, riske göre ayarlanmış önceliklendirme sağlar.
Uygulama Hususları
- Lipidlerle çalışma, protein saflaştırma ve ara yüzey bilimi konularında uzmanlık gerektirir.
- Hamilton şırıngaları ve Teflon alt tabakalar gibi temiz oda uyumlu ekipmanlara erişime bağlıdır.
- Laboratuvarlar arasında tampon koşullarının ve inkübasyon sürelerinin standardize edilmesini gerektirir.
- Farklı protein sınıfları, özellikle integral membran proteinleri için adaptasyon hususlarını içerir.
- Belirli hedefler için deterjan ve diyaliz koşullarının ampirik optimizasyon ihtiyacı ile sınırlıdır.
