Name: Bitki Konağındaki Bir Yaprakçık Vektörünün Virüs ve Tükürük Proteinlerinin Tespiti (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-09-14T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 23 s
Description: Öğrenin, yaprakçık tükürük proteinleri ve bitki viral proteinlerini SDS-PAGE ve Western blot ile tespit etmeyi. Bu yöntem, bitki konaklarındaki protein etkileşimlerini ve viral bulaş mekanizmalarını araştırmak için kararlı ve tekrarlanabilir bir sistem sunar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Bu çalışma, Çin Ulusal Doğa Bilimleri Vakfı (31772124 ve 31972239) ve Fujian Tarım ve Ormancılık Üniversitesi'nden (Grant KSYLX014) gelen hibelerle desteklenmiştir.

Virülifer olmayan yetişkin yaprakçıklar, Çin'deki Fujian Tarım ve Ormancılık Üniversitesi'ndeki Vektör Kaynaklı Virüs Araştırma Merkezi'nde çoğaltıldı.
1. Virülifer olmayan böcek yetiştiriciliği
<ol><li>Yetişkinleri pirinç fideleri üzerinde 40 cm x 35 cm x 20 cm (uzunluk x genişlik x yükseklik) olan bir küp kafeste arkadan yerleştirin. Havalandırma için kafesin bir tarafını böcek geçirmez bir ağ ile örtün.<ol><li>Yaprakçıklı kafesleri, 16 saat ışık ve 8 saat karanlık fotoperiyot altında% 60-75 bağıl nem ile 26 ° C'de dahili bir nem kontrolörü içeren bir inkübatörde saklayın.</li>
	</ol></li>
	<li>Tüm yetişkinleri kafeslerinden her hafta taze pirinç fideleri içeren yeni bir kafese nazikçe aktarmak için bir aspiratör kullanın.<ol><li>200'den fazla yetişkinin çiftleşmesine ve pirincin içine yumurta bırakmasına izin verin.</li>
		<li>Perileri ortaya çıkarmak için eski pirinç fidelerini saklayın. Bu yeni virülifer olmayan nimfleri 2-instar aşamasına kadar destekleyin.</li>
	</ol></li>
</ol>2. Virüs edinimi ve virülifer böceklerin toplanması
<ol><li>2-instar nonviruliferous nimfleri, aspiratör kullanarak açlık için 1-2 saat boyunca bir cam kültür tüpüne (2,5 cm çapında 15 cm yüksekliğinde) dikkatlice aktarın.<ol><li>Perileri bir tencerede yetişen RDV ile enfekte olmuş bir pirinç bitkisi içeren bir kafese bırakın.</li>
		<li>Perileri enfekte olmuş pirinç bitkisinde 2 gün boyunca beslenmelerine izin verin. NOT: Pirinç bitkisini dikkatlice sulayın ve nimfleri yıkamaktan kaçının. 2 yıldızlı nimfler yaklaşık 1.6-2 mm uzunluğundadır.</li>
	</ol></li>
	<li>Bu nimfleri, 16 saat ışık ve 8 saat karanlık fotoperiyot altında% 60-75 bağıl neme sahip taze virüssüz pirinç fideleri içeren yeni bir kafese dikkatlice aktarın. RDV'nin dolaşım iletim süresini tamamlamak için nimflerin enfekte olmuş pirinç bitkisinde 12 gün boyunca beslenmelerine izin verin.</li>
</ol>3. Bir besleme kafesi kullanarak tükürük proteinlerinin toplanması
<ol><li>Bir ucunun böcek geçirmez ağ ile kaplandığı beş küçük boru benzeri besleme kafesi (2,5 cm çapında ve 4 cm yüksekliğinde) hazırlayın.</li>
	<li>Her besleme kafesinde 15-20 yaprak haznesini sınırlayın ve ardından kafesin diğer ucunu ince bir köpük paspasla örtün.<ol><li>Bir pirinç fidesini (5-6 cm yüksekliğinde) kafesin ucu ile bantlı bir köpük paspas arasına sabitleyin. Besleme kafesindeki yaprakçıkların, kafesin içine maruz kalan pirinç fideleriyle beslenebildiğinden emin olun.</li>
	</ol></li>
	<li>Fide köklerini suya batırın, böylece pirinç bitkisi canlı kalır. Yaprakçıkların 2 gün boyunca onlarla beslenmesine izin verin.</li>
	<li>Yaprakçıkları besleme kafeslerinden çıkarın ve beslendikleri pirinç fidelerini toplayın. Fidelerin parçalarını kafesin dışına kesin ve fidelerin beslenme bölgelerini geri kazanın. NOT: Bu numune, algılama için anında kullanılmadığı takdirde -80 °C'de en fazla 3 ay saklanabilir.</li>
</ol>4. Reaktif hazırlama
<ol><li>5xTris-glisin tamponu hazırlamak için 15.1 g Tris-baz, 94 g glisin ve 5 g SDS'yi 1 L steril suda çözün. 1xTris-glisin tamponu hazırlamak için 200 mL 5xTris-glisin tamponunu 800 mL steril su ile seyreltin (tampon bileşimi için Tablo 1'e bakınız).</li>
	<li>10xTris tamponlu salin (TBS) tamponu hazırlamak için 80 g NaCl, 30 g Tris baz ve 2 g KCl'yi 1 L steril suda çözün. Çözeltiyi 121 ° C'de 15 dakika boyunca otoklavlayın.</li>
	<li>4x protein numune tamponu hazırlamak için 8 g SDS, 4 mL ß-merkaptoetanol, 0.02 g bromofenol mavisi ve 40 mL gliserol 40 mL 0.1 M Tris-HCl (pH 6.8) içinde çözün.</li>
	<li>Transfer tamponunu hazırlamak için 800 mL Tris-glisin tamponunu 200 mL metanol ile karıştırın.</li>
	<li>TBS tamponunu Tween 20 (TBST) çözeltisiyle hazırlamak için 100 mL 10xTBS çözeltisi ve 3 mL Tween 20 ila 900 mL steril su ekleyin.</li>
</ol>5. Tükürük ve viral proteinleri tespit etmek için Batı lekelenmesi
<ol><li>Pirinç numunelerinin 0,1 gramını, doku toz haline gelene kadar sıvı azotla öğütün. Numuneye 200 μL 4x protein numune tamponu ekleyin ve 10 dakika kaynatın. Numuneleri oda sıcaklığında 10 dakika boyunca 12.000 x g'de santrifüj edin.<ol><li>Süpernatantı çıkarın ve yeni bir şişeye yerleştirin. Numunenin 10 μL'sini bir SDS-PAGE jeline yükleyin ve 45-60 dakika boyunca 150 V'ta Tris-glisin tamponunda çalıştırın. NOT: Santrifüjleme sonrası kalıntı atılabilir.</li>
	</ol></li>
	<li>0,45 μm nitroselüloz membranı ve diğer sandviç malzemelerini Transfer tamponuna 30 dakika boyunca koyun. NOT: Bu adım, jel çalışmasını tamamlamadan önce yapılabilir.</li>
	<li>Jeli sandviçleyin ve Transfer tamponunda 100 V'ta 90-120 dakika boyunca aktarın.</li>
	<li>Membranı alın ve 20 dakika boyunca TBST çözeltisinde% 7 yağsız kuru süt bloke edici çözeltiye yerleştirin. RDV, P8 veya Vg'ye karşı spesifik antikoru, TBST'de% 7'lik bir yağsız kuru süt çözeltisine ekleyin. Membranı 2 saat veya gece boyunca boyamak için antikor ile inkübe edin.</li>
	<li>Membranı TBST çözeltisi ile üç kez, her seferinde 5 dakika yıkama ile yıkayın.</li>
	<li>Keçi anti-tavşan IgG'yi, TBST ile% 7 yağsız kuru süte ikincil bir antikor olarak ekleyin. Oda sıcaklığında 60-90 dakika boyunca antikor ile inkübe edin.</li>
	<li>Membranı TBST çözeltisi ile her seferinde 5 dakika boyunca üç kez yıkayın.</li>
	<li>Kemilüminesan yöntemi için ECL Western kitini kullanın. Kitteki Karışım Algılama Reaktifleri 1 ve 2, bir tüpte 1: 1 oranında. Karışık reaktifi membranın üzerine koyun ve lekeyi 5 dakika boyunca inkübe edin.</li>
	<li>Fazla reaktifi boşaltın ve kemilüminesan resmin kolorimetrik bir resmini çekin. Merdiveni protein bantlarıyla görmek için bunları birleştirin.</li>
</ol>

<ol><li>Hogenhout, S. A., Ammar el, D., Whitfield, A. E., Redinbaugh, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Insect+vector+interactions+with+persistently+transmitted+viruses%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Phytopathology%22%5BJournal%5D)">Insect vector interactions with persistently transmitted viruses.</a> Annual Review of Phytopathology. 46, 327-359 (2008).</li>
<li>Cranston, P. S., Gullan, P. J. Phylogeny of insects. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aCranston%2C+PS+%22Encyclopedia+of+Insects%22">Encyclopedia of Insects</a>. Resh, V. H., Carde, R. T. , Academic. Amsterdam. (2003).</li>
<li>Ammar el, D., Tsai, C. W., Whitfield, A. E., Redinbaugh, M. G., Hogenhout, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+and+molecular+aspects+of+rhabdovirus+interactions+with+insect+and+plant+hosts%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Entomology%22%5BJournal%5D)">Cellular and molecular aspects of rhabdovirus interactions with insect and plant hosts.</a> Annual Review of Entomology. 54, 447-468 (2009).</li>
<li>Wei, T., Li, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rice+reoviruses+in+insect+vectors%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Phytopathology%22%5BJournal%5D)">Rice reoviruses in insect vectors.</a> Annual Review of Phytopathology. 54, 99-120 (2016).</li>
<li>Hattori, M., Konishi, H., Tamura, Y., Konno, K., Sogawa, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Laccase-type+phenoloxidase+in+salivary+glands+and+watery+saliva+of+the+green+rice+leafhopper%2C+Nephotettix+cincticeps%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Insect+Physiology%22%5BJournal%5D)">Laccase-type phenoloxidase in salivary glands and watery saliva of the green rice leafhopper, Nephotettix cincticeps.</a> Journal of Insect Physiology. 51 (12), 1359-1365 (2005).</li>
<li>Ma, R., Reese, J. C., William, I. V., Bramel-Cox, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+of+pectinesterase+and+polygalacturonase+from+salivary+secretions+of+living+greenbugs%2C+schizaphis+graminum+%28Homoptera%3A+aphididae%29%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Insect+Physiology%22%5BJournal%5D)">Detection of pectinesterase and polygalacturonase from salivary secretions of living greenbugs, schizaphis graminum (Homoptera: aphididae).</a> Journal of Insect Physiology. 36 (7), 507-512 (1990).</li>
<li>Miles, P. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic+aspects+of+the+chemical+relation+between+the+rose+aphid+and+rose+buds%5BTitle%5D)+AND+%22Entomologia+Experimentalis+et+Applicata%22%5BJournal%5D)">Dynamic aspects of the chemical relation between the rose aphid and rose buds.</a> Entomologia Experimentalis et Applicata. 37 (2), 129-135 (2011).</li>
<li>Urbanska, A., Tjallingii, W. F., Dixon, A., Leszczynski, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phenol+oxidising+enzymes+in+the+grain+aphid%27s+saliva%5BTitle%5D)+AND+%22Entomologia+Experimentalis+et+Applicata%22%5BJournal%5D)">Phenol oxidising enzymes in the grain aphid's saliva.</a> Entomologia Experimentalis et Applicata. 86 (2), 197-203 (1998).</li>
<li>Miles, P. W., Peng, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Studies+on+the+salivary+physiology+of+plant+bugs%3A+detoxification+of+phytochemicals+by+the+salivary+peroxidase+of+aphids%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Insect+Physiology%22%5BJournal%5D)">Studies on the salivary physiology of plant bugs: detoxification of phytochemicals by the salivary peroxidase of aphids.</a> Journal of Insect Physiology. 35 (11), 865-872 (1989).</li>
<li>Will, T., van Bel, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Physical+and+chemical+interactions+between+aphids+and+plants%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Experimental+Botany%22%5BJournal%5D)">Physical and chemical interactions between aphids and plants.</a> Journal of Experimental Botany. 57 (4), 729-737 (2006).</li>
<li>Ma, R. Z., Reese, J. C., Black, W. C., Bramel-Cox, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chlorophyll+loss+in+a+greenbug-susceptible+sorghum+due+to+pectinases+and+pectin+fragments%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+Kansas+Entomological+Society%22%5BJournal%5D)">Chlorophyll loss in a greenbug-susceptible sorghum due to pectinases and pectin fragments.</a> Journal of the Kansas Entomological Society. 71 (1), 51-60 (1998).</li>
<li>Madhusudhan, V. V., Miles, P. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mobility+of+salivary+components+as+a+possible+reason+for+differences+in+the+responses+of+alfalfa+to+the+spotted+alfalfa+aphid+and+pea+aphid%5BTitle%5D)+AND+%22Entomologia+Experimentalis+et+Applicata%22%5BJournal%5D)">Mobility of salivary components as a possible reason for differences in the responses of alfalfa to the spotted alfalfa aphid and pea aphid.</a> Entomologia Experimentalis et Applicata. 86 (1), 25-39 (1998).</li>
<li>Funk, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alkaline+phosphatase+activity+in+whitefly+salivary+glands+and+saliva%5BTitle%5D)+AND+%22Archives+of+Insect+Biochemistry+%26+Physiology%22%5BJournal%5D)">Alkaline phosphatase activity in whitefly salivary glands and saliva.</a> Archives of Insect Biochemistry & Physiology. 46 (4), 165-174 (2010).</li>
<li>Hogenhout, S. A., Bos, J. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effector+proteins+that+modulate+plant-insect+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Plant+Biology%22%5BJournal%5D)">Effector proteins that modulate plant-insect interactions.</a> Current Opinion in Plant Biology. 14 (4), 422-428 (2011).</li>
<li>Tomkins, M., Kliot, A., Maree, A. F., Hogenhout, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+multi-layered+mechanistic+modelling+approach+to+understand+how+effector+genes+extend+beyond+phytoplasma+to+modulate+plant+hosts%2C+insect+vectors+and+the+environment%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Plant+Biology%22%5BJournal%5D)">A multi-layered mechanistic modelling approach to understand how effector genes extend beyond phytoplasma to modulate plant hosts, insect vectors and the environment.</a> Current Opinion in Plant Biology. 44, 39-48 (2018).</li>
<li>Huang, H. J., Lu, J. B., Li, Q., Bao, Y. Y., Zhang, C. X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Combined+transcriptomic%2Fproteomic+analysis+of+salivary+gland+and+secreted+saliva+in+three+planthopper+species%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Proteomics%22%5BJournal%5D)">Combined transcriptomic/proteomic analysis of salivary gland and secreted saliva in three planthopper species.</a> Journal of Proteomics. , (2018).</li>
<li>Hogenhout, S. A., Bos, J. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effector+proteins+that+modulate+plant--insect+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Plant+Biology%22%5BJournal%5D)">Effector proteins that modulate plant--insect interactions.</a> Current Opinion in Plant Biology. 14 (4), 422-428 (2011).</li>
<li>Sun, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+mosquito+salivary+protein+promotes+flavivirus+transmission+by+activation+of+autophagy%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">A mosquito salivary protein promotes flavivirus transmission by activation of autophagy.</a> Nature Communications. 11 (1), 260(2020).</li>
<li>Sri-In, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+salivary+protein+of+Aedes+aegypti+promotes+dengue-2+virus+replication+and+transmission%5BTitle%5D)+AND+%22Insect+Biochemistry+and+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">A salivary protein of Aedes aegypti promotes dengue-2 virus replication and transmission.</a> Insect Biochemistry and Molecular Biology. 111, 103181(2019).</li>
<li>Conway, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aedes+aegypti+D7+saliva+protein+inhibits+dengue+virus+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Plos+Neglected+Tropical+Diseases%22%5BJournal%5D)">Aedes aegypti D7 saliva protein inhibits dengue virus infection.</a> Plos Neglected Tropical Diseases. 10 (9), 0004941(2016).</li>
<li>Wang, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+whitefly+effector+Bsp9+targets+host+immunity+regulator+WRKY33+to+promote+performance%5BTitle%5D)+AND+%22Philosophical+Transactions+of+the+Royal+Society+of+London.+Series+B%2C+Biological+Sciences%22%5BJournal%5D)">A whitefly effector Bsp9 targets host immunity regulator WRKY33 to promote performance.</a> Philosophical Transactions of the Royal Society of London. Series B, Biological Sciences. 374 (1767), 20180313(2019).</li>
<li>Omura, T., Yan, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+outer+capsid+proteins+in+transmission+of+phytoreovirus+by+insect+vectors%5BTitle%5D)+AND+%22Advances+in+Virus+Research%22%5BJournal%5D)">Role of outer capsid proteins in transmission of phytoreovirus by insect vectors.</a> Advances in Virus Research. 54, 15-43 (1999).</li>
<li>Chen, Q., Liu, Y., Long, Z., Yang, H., Wei, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Viral+release+threshold+in+the+salivary+gland+of+leafhopper+vector+mediates+the+intermittent+transmission+of+rice+dwarf+virus%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Viral release threshold in the salivary gland of leafhopper vector mediates the intermittent transmission of rice dwarf virus.</a> Frontiers in Microbiology. 12, 639445(2021).</li>
<li>Fukushi, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Further+studies+on+the+dwarf+disease+of+rice+plant%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+Faculty+of+Agriculture%2C+Hokkaido+Imperial+University%22%5BJournal%5D)">Further studies on the dwarf disease of rice plant.</a> Journal of the Faculty of Agriculture, Hokkaido Imperial University. 45 (3), 83-154 (1940).</li>
<li>Miyazaki, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+functional+organization+of+the+internal+components+of+rice+dwarf+virus%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">The functional organization of the internal components of rice dwarf virus.</a> Journal of Biochemistry. 147, 843-850 (2010).</li>
<li>Wei, T., Shimizu, T., Hagiwara, K., Kikuchi, A., Omura, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pns12+protein+of+rice+dwarf+virus+is+essential+for+formation+of+viroplasms+and+nucleation+of+viral-assembly+complexes%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+General+Virology%22%5BJournal%5D)">Pns12 protein of rice dwarf virus is essential for formation of viroplasms and nucleation of viral-assembly complexes.</a> Journal of General Virology. 87, 429-438 (2006).</li>
<li>Chen, Q., Zhang, L., Chen, H., Xie, L., Wei, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nonstructural+protein+Pns4+of+rice+dwarf+virus+is+essential+for+viral+infection+in+its+insect+vector%5BTitle%5D)+AND+%22Virology+Journal%22%5BJournal%5D)">Nonstructural protein Pns4 of rice dwarf virus is essential for viral infection in its insect vector.</a> Virology Journal. 12, 211(2015).</li>
<li>Chen, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nonstructural+protein+Pns12+of+rice+dwarf+virus+is+a+principal+regulator+for+viral+replication+and+infection+in+its+insect+vector%5BTitle%5D)+AND+%22Virus+Research%22%5BJournal%5D)">Nonstructural protein Pns12 of rice dwarf virus is a principal regulator for viral replication and infection in its insect vector.</a> Virus Research. 210, 54-61 (2015).</li>
<li>Chen, Q., Zhang, L., Zhang, Y., Mao, Q., Wei, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tubules+of+plant+reoviruses+exploit+tropomodulin+to+regulate+actin-based+tubule+motility+in+insect+vector%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Tubules of plant reoviruses exploit tropomodulin to regulate actin-based tubule motility in insect vector.</a> Scientific Reports. 7, 38563(2017).</li>
<li>Wei, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+spread+of+Rice+dwarf+virus+among+cells+of+its+insect+vector+exploits+virus-induced+tubular+structures%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Virology%22%5BJournal%5D)">The spread of Rice dwarf virus among cells of its insect vector exploits virus-induced tubular structures.</a> Journal of Virology. 80 (17), 8593-8602 (2006).</li>
<li>Mao, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Insect+bacterial+symbiont-mediated+vitellogenin+uptake+into+oocytes+to+support+egg+development%5BTitle%5D)+AND+%22mBio%22%5BJournal%5D)">Insect bacterial symbiont-mediated vitellogenin uptake into oocytes to support egg development.</a> mBio. 11 (6), 01142(2020).</li>
<li>Tufail, M., Takeda, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+characteristics+of+insect+vitellogenins%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Insect+Physiology%22%5BJournal%5D)">Molecular characteristics of insect vitellogenins.</a> Journal of Insect Physiology. 54 (12), 1447-1458 (2008).</li>
<li>Sappington, T. W., Raikhel, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+characteristics+of+insect+vitellogenins+and+vitellogenin+receptors%5BTitle%5D)+AND+%22Insect+Biochemistry+and+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Molecular characteristics of insect vitellogenins and vitellogenin receptors.</a> Insect Biochemistry and Molecular Biology. 28 (5-6), 277-300 (1998).</li>
<li>Ji, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vitellogenin+from+planthopper+oral+secretion+acts+as+a+novel+effector+to+impair+plant+defenses%5BTitle%5D)+AND+%22New+Phytologist%22%5BJournal%5D)">Vitellogenin from planthopper oral secretion acts as a novel effector to impair plant defenses.</a> New Phytologist. , (2021).</li>
</ol>

Yazarların açıklayacak hiçbir şeyi yok.

Delici emici böceklerin tükürük bezleri tarafından doğrudan salgılanan tükürük çok önemli bir rol oynar, çünkü konakçı dokuları ve vektörlerin krallıklar arası biyolojik faktörlerini konakçılara önceden sindirir ve detoksifiye eder 1,3,4. Elicitors, efektörler ve küçük RNA dahil olmak üzere krallıklar arası biyolojik faktörler, böcek-konakçı iletişimi için kritik öneme sahiptir14,15,16<sup clas...

Temel bir problem olan arbovirüslerin vektör-konakçı iletim modu, biyoloji biliminin sınırındadır. Tarımsal öneme sahip birçok bitki virüsü, böcek vektörleri1 tarafından yatay olarak bulaşır. Bitki virüslerinin yarısından fazlası, yaprak bitleri, beyaz sinekler, yaprakçıklar, planthoppers ve thrips dahil olmak üzere hemipteran böcekler tarafından vektörleştirilir. Bu böcekler, bitki virüslerini verimli bir şekilde iletmelerini sağlayan farklı özelliklere sahiptir1. Delici emici ağız kısımlarına sahiptirler ve floem ve ksilemden gelen özsu ile beslenirler ve tükürüklerini 1,2,3,4 salgılarlar. Tekniklerin geliştirilmesi ve iyileştirilmesiyle, tükürük bileşenlerinin tanımlanması ve fonksiyonel analizleri yoğun araştırmaların yeni bir odağı haline gelmektedir. Tükürükteki bilinen tükürük proteinleri, diğerlerinin yanı sıra pektinesteraz, selülaz, peroksidaz, alkali fosfataz, polifenol oksidaz ve sukraz gibi çok sayıda enzim içerir 5,6,7,8,9,10,11,12,13 . Tükürükteki proteinler ayrıca konakçı savunma tepkisini tetikleyen, böylece böceklerin performansını değiştiren elisitörleri ve konakçı savunmasını baskılayan efektörleri içerir, bu da böcek uygunluğunu arttırır ve konakçı patolojik yanıtlarını indükleyen bileşenler14,15,16,17. Bu nedenle, tükürük proteinleri böcekler ve konakçılar arasındaki iletişim için hayati öneme sahip malzemelerdir. Virüslerin bulaşması sırasında, delici emici virülifer böceklerin tükürük bezleri tarafından salgılanan tükürük de viral proteinler içerir. Viral bileşenler, onları böcekten bitki konağına serbest bırakmak için tükürük akışını kullanır. Bu nedenle, böcek tükürüğü virüs-vektör-konakçı tritrofik etkileşimini köprüler. Virülifer böcekler tarafından salgılanan tükürük proteinlerinin biyolojik fonksiyonunun araştırılması, virüs-vektör-konakçı ilişkisinin anlaşılmasına yardımcı olur.
Hayvan virüsleri için, sivrisineklerin tükürüğünün Batı Nil virüsü (WNV) ve Dang virüsünün (DENV) bulaşmasına ve patojenitesine aracılık ettiği bildirilmektedir. Tükürük proteini AaSG34, dang humması-2 virüsü replikasyonunu ve iletimini teşvik ederken, tükürük proteini AaVA-1, otofajiyi aktive ederek DENV ve Zika virüsü (ZIKV) bulaşmasını teşvik eder18,19. Sivrisineklerin tükürük proteini D7, DENV viryonları ve rekombinant DENV zarf proteini20 ile doğrudan etkileşim yoluyla in vitro ve in vivo DENV enfeksiyonunu inhibe edebilir. Bitki virüslerinde, begomovirüs domates sarı yaprak kıvrılma virüsü (TYLCV), beyaz sineklerin tercihini ve performansını arttırmak için bitki konağının WRKY33 aracılı bağışıklığını baskılayan beyaz sinek tükürük proteini Bsp9'u indükler ve sonunda virüslerin bulaşmasını arttırır21. Böcek tükürük proteinlerinin bitki konakçılarında oynadığı rol üzerine yapılan çalışmalar, hayvan konakçılarınınkinin gerisinde kaldığından, bitki konakçılarındaki tükürük proteinlerini tespit etmek için kararlı ve güvenilir bir sisteme acilen ihtiyaç duyulmaktadır.
Pirinç cüce virüsü (RDV) olarak bilinen bitki virüsü, yaprak haznesi Nephotettix cincticeps (Hemiptera: Cicadellidae) tarafından yüksek verimlilikle ve sürekli çoğalan bir şekilde bulaşır22,23. RDV'nin ilk olarak bir böcek vektörü tarafından bulaştığı ve Asya'da ciddi bir pirinç hastalığına neden olduğu bildirilmiştir24,25. Virion ikosahedral ve çift katmanlı küreseldir ve dış tabaka P8 dış kapsid proteini22'yi içerir. N. cinctiaceps'te RDV'nin dolaşım süresi 14 gün 26,27,28,29,30'dur. RDV tükürük bezlerine ulaştığında, virionlar ekzositoz benzeri bir mekanizma 23 aracılığıyla tükürük bezlerindeki tükürük depolanan boşluklara salınır. Vitellogenin (Vg), dişi böceklerde oosit gelişimi için gerekli olan yumurta sarısı proteini öncüsüdür31,32,33. Çoğu böcek türü, yaklaşık 220 kDa'lık bir öncü proteini kodlayan 6-7 kb'lik en az bir Vg transkriptine sahiptir. Vg'nin protein öncülleri genellikle yumurtalık 18,19'a girmeden önce büyük (140 ila 190 kDa) ve küçük (<50 kDa) parçalara ayrılabilir. Önceki proteomik analiz, Vg'den türetilen peptitlerin, işlevleri bilinmemekle birlikte, yaprakçık Recilia dorsalis'in salgılanan tükürüğünde varlığını ortaya koymuştur (yayınlanmamış veriler). Bitkilerden ağızdan salgılanan Vg'nin, bitkilerin savunmalarına zarar vermek için bir efektör olarak işlev gördüğü yeni bildirilmiştir34. N. cinctiaces'in Vg'sinin tükürük akışıyla bitki konakçısına da salınıp bırakılamayacağı ve daha sonra bitki savunmasına müdahale etmek için bitkide rol oynayıp oynayamayacağı bilinmemektedir. N. cinctiaceps'in bitki savunmasını inhibe etmek veya aktive etmek için Vg gibi tükürük proteinlerini kullanıp kullanmadığını ele almak için ilk adım, beslenme sırasında bitkiye salınan proteinleri tanımlamaktır. Bitkide bulunan tükürük proteinlerini tanımlama yöntemini anlamak, tükürük proteinlerinin işlevini ve Hemiptera ile bitkiler arasındaki etkileşimleri açıklamak için potansiyel olarak gereklidir.
Burada sunulan protokolde, N. cinctiacps , böcek besleme yoluyla tanıtılan bitki konakçısında tükürük proteinlerinin varlığını incelemek için bir yöntem sağlamak için bir örnek olarak kullanılmıştır. Protokol öncelikle tükürük proteinlerinin toplanmasını ve tespitini detaylandırır ve çoğu hemipteran üzerinde daha fazla araştırma için yararlıdır.

<table><tbody><tr><td>< güçlü > Reaktifler< / güçlü ></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tris baz</td><td>Roche</td><td>D609K69032</td><td>5 kez; Tris-glisin tamponu ve 10 kez; TBS tampon hazırlama</td></tr><tr><td>glisin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>WXBD0677V</td><td>5 kez; Tris-glisin tampon hazırlama</td></tr><tr><td>SDS</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>SLCB4394</td><td>5 kez; Tris-glisin tampon hazırlama</td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd</td><td>10019318</td><td>10 kez; TBS tampon hazırlama</td></tr><tr><td>KCl</td><td>Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd</td><td>10016318</td><td>10 kez; TBS tampon hazırlama</td></tr> <tr><td>ve szlig; - merkaptoetanol</td><td>Xiya Reaktif</td><td>B14492</td><td>4 kez; protein numunesi tampon hazırlama</td></tr><tr><td>bromofenol mavisi</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>SHBL3668</td><td>4 kez; protein numunesi tampon hazırlama</td></tr><tr><td>gliserol</td><td>Sinopharm Kimyasal Reaktif Co, Ltd</td><td>10010618</td><td>4 kez; protein örnek tampon hazırlama</td></tr><tr><td>metanol</td><td>Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd</td><td>10014118</td><td>Transfer tamponu hazırlığı için</td></tr><tr><td>Tween 20</td><td>Coolaber BİLİM & TeCHNoLoGY</td><td>CT30111220</td><td>TBST hazırlığı için</td></tr><tr><td>yağsız kuru süt</td><td>Becton.Dickinso ve şirket</td><td>252038</td><td>Membran blokajı, antikorlar için seyreltme</td></tr><tr><td>keçi tavşan önleyici IgG</td><td>Sangon Biotech</td><td>D110058-0001</td><td>Birincil andibody</td></tr><tr><td>ECL Western kitinin</td> tanınması <td>ThermoFisher Scientific</td><td>32209</td><td>Kemilüminesan substrat</td></tr><tr><td>nitroselüloz membran</td><td>Pall Corporation</td><td>25312915</td><td>Protein transferi için</td></tr><tr><td><güçlü>Tamponlar ve Çözeltiler</güçlü></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td><güçlü>Tampon</güçlü></td><td><güçlü>Kompozisyon</güçlü></td><td></td><td><güçlü>Yorumlar/Açıklama</güçlü></td></tr><tr><td>&nbsp; 5&kez; Tris-glisin tamponu</td><td>15.1 g Tris baz 94 g glisin &nbsp; 1 L steril suda</td><td></td> 5 g SDS<td>&nbsp; Stok çözeltisi</td></tr><tr><td>1 ve kez; Tris-glisin tamponu</td><td>200 mL 5 & kez; Tris-glisin tamponu 800 mL steril su</td><td></td><td>Çalışma solüsyonu, SDS-PAGE</td></tr><tr><td>10&times için; Tris tamponlu tuzlu su (TBS) tamponu</td><td>80 g NaCl 30 g Tris baz 2 g KCl 1 L steril suda</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tween 20 (TBST) çözeltisi ile</td> stok çözeltisi <td>TBS 100 mL 10&/kez; TBS çözeltisi 3 mL Tween 20 900 mL steril su</td><td></td><td>Çalışma çözeltisi</td></tr><tr><td>4 kez; protein numune tamponu</td><td>8 g SDS 4 mL &szlig;-merkaptoetanol 0.02 g bromofenol mavi 40 mL gliserol 40 mL'de 0.1 M Tris-HCl (pH 6.8)</td><td></td> <td>Protein ekstraksiyonu için</td></tr><tr><td>Transfer tamponu</td><td>800 mL Tris-glisin tamponu 200 mL metanol</td><td></td><td>İçin protein</td></tr> <tr><td>transferi<güçlü > Aletler< / güçlü ></td><td></td><td></td><td></td></tr> <tr><td>Bromofenol mavisi</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>SHBL3668</td><td>4x protein numunesi için Tampon hazırlama</td></tr><tr><td>Sabit sıcaklık inkübatörü</td><td>Ningbo Saifu Experimental Instrument Co., Ltd.</td><td>PRX-1200B</td><td>Yaprak zararlısı yetiştirmek için</td></tr><tr><td>Elektroforez</td><td>Tanon Science & Teknoloji Co., Ltd.</td><td>SDS-PAGE için</td> <td>Tanon EP300</td> SDS-PAGE</tr> gliserol için <tr><td></td><td>BIO-RAD</td><td>1703935</td><td>SDS-PAGE</td></tr><tr><td>gliserol</td><td>için Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd.</td><td>10010618</td><td>4x protein numunesi tampon hazırlama</td></tr><tr><td>glisin</td> için <td>Sigma-Aldrich</td><td>WXBD0677V</td><td>5x Tris-glisin tampon hazırlama</td></tr><tr><td>keçi anti-tavşan IgG</td><td>Sangon Biotech</td> <td>içinD110058-0001</td><td>Birincil andtikor</td></tr><tr><td>Yüksek geçişli doku öğütme aletinin</td> tanınması <td>Shanghai Jingxin Industrial Development Co., Ltd.</td><td>JXFSIPRP-24</td><td>Bitki dokularını öğütmek için</td></tr><tr><td>KCl</td><td>Sinopharm Chemical Reactive Co., Ltd</td><td>10016318</td><td>10x TBS tampon hazırlama için</td></tr><tr><td>metanol</td><td>Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd</td><td>10014118</td><td>Transfer tamponu hazırlama için</td></tr><tr><td>Mini ıslak ısı transfer teknesi</td><td>SDS-PAGE</td><td></td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sinopharm Kimyasal Reaktif Co., Ltd</td> <td>için BIO-RAD 1703930</td><td>10019318 10x TBS tampon hazırlama nitroselüloz</td></tr><tr><td>membran</td><td>için Pall Corporation</td><td>25312915</td><td>Proteinler için</td></tr><tr><td>yağsız kuru süt</td> transferi <td>Becton.Dickinso ve şirket</td><td>252038</td><td>Membran blokajı, antikor seyreltmesi için</td></tr><tr><td>Pierce ECL Western kiti</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>32209</td><td>Kemilüminesan substrat</td></tr><tr><td>Protein renk aleti</td><td>GE Sağlık biyo-bilimleri AB</td><td>Amersham lmager 600</td><td>Proteinleri tespit etmek için</td></tr><tr><td>SDS</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>SLCB4394</td><td>5x Tris-glisin tampon hazırlığı için</td></tr><tr><td>Tris baz</td><td>Roche</td><td>D609K69032</td><td>5x Tris-glisin tamponu ve 10 kez; TBS tampon hazırlama</td></tr><tr><td>Tween 20</td><td>Coolaber BİLİM & TBST hazırlığı için TeCHNoLoGY</td><td>CT30111220</td><td>SDS-PAGE</td></tr> için <tr><td>dikey plaka elektroforez tankı</td><td>BIO-RAD</td><td></td><td></td></tr><tr><td>1658001 Su banyosu</td><td>Shanghai Jinghong Experimental equipment Co., Ltd.</td><td>XMTD-8222</td><td>Protein örneklerini kaynatmak için</td></tr> <tr><td>beta;-merkaptoetanol</td><td>Xiya Reaktifi</td><td>B14492</td><td>4x protein örneği tampon hazırlığı için</td></tr></tbody></table>

bitki konağındaki bir yaprakçık vektörünün virüs ve tükürük proteinlerinin tespiti

Detecting Virus and Salivary Proteins of a Leafhopper Vector in the Plant Host

Böcek vektörleri yatay olarak tarımsal öneme sahip birçok bitki virüsünü iletir. Bitki virüslerinin yarısından fazlası, delici emici ağız kısımlarına sahip hemipteran böcekler tarafından bulaşır. Viral bulaşma sırasında, böcek tükürüğü virüs-vektör-konakçıyı köprüler, çünkü tükürük vektörleri virüsleri ve böcek proteinleri, bitkilerin böceklerden bitki konakçılarına bağışıklık tepkisini tetikler veya bastırır. Tükürük proteinlerinin tanımlanması ve fonksiyonel analizleri, arbovirüs-konakçı etkileşimlerinin araştırma alanında yeni bir odak alanı haline gelmektedir. Bu protokol, bitki konağını kullanarak yaprakçıkların tükürüğündeki proteinleri tespit etmek için bir sistem sağlar. Pirinç cüce virüsü (RDV) ile enfekte olmuş yaprak vektörü Nephotettix cincticeps buna bir örnek teşkil eder. N. cinctiacps'ın tükürüğü tarafından vektörleştirilen RDV'nin vitellogenin ve majör dış kapsid proteini P8, N. cinctiacps'ın beslendiği pirinç bitkisinde aynı anda tespit edilebilir. Bu yöntem, böcek beslemesinden sonra bitki konakçısında geçici olarak tutulan tükürük proteinlerini test etmek için geçerlidir. Bu tespit sisteminin hemipteran-virüs-bitki veya hemipteran-bitki etkileşimlerinin incelenmesine fayda sağlayacağına inanılmaktadır.

Şekil 1, bu protokoldeki tüm adımları göstermektedir: böcek yetiştiriciliği, virüs edinimi, pirinç besleme yoluyla tükürük proteinlerinin toplanması ve batı lekesi. Batı lekeleri sonuçları, Vg'ye karşı antikorlarla inkübe edilen zardaki böceklerin pirinç ve tükürük bezlerinin beslenme örneklerinde yaklaşık 220 kDa'lık spesifik ve beklenen bantların gözlendiğini göstermiştir. Buna karşılık, beslenmeyen pirinç örneğinde bant gözlenmemiştir. Şekil 2'deki s...

Bu protokol, yaprak haznesinin tükürük proteinlerini ve yaprak haznesi vektörleri tarafından salınan bitki viral proteinlerini tespit etmek için bitki konağının nasıl kullanılacağını göstermektedir.

Bitki Konağındaki Bir Yaprakçık Vektörünün Virüs ve Tükürük Proteinlerinin Tespiti

Insect vectors horizontally transmit many plant viruses of agricultural importance. More than one-half of plant viruses are transmitted by hemipteran ...

Bu protokol, bu proteinlerin bitki konakçılarındaki işlevini daha fazla araştırmak için yaprakçıkların ve bitki konakçılarının tükürük proteinlerini tespit etmek için bir teknik sağlar. Bu tekniğin uygulanması kolaydır ve sistem kararlı ve tekrarlanabilirdir. Bu yöntem aynı zamanda diğer hemiptera ve bitki konakçılarının tükürük proteinlerinin tespitinde de yardımcı olabilir.Başlamak için, yetişkin yaprakçıkları pirinç fideleri üzerinde 40 x 35 x 20 santimetrelik bir küp kafesinde arkanıza koyun. Havalandırma için kafesin bir tarafını böcek geçirmez bir ağ ile örtün. Kafesleri, yaprakçıklarla birlikte, 16 saat aydınlık ve sekiz saatlik karanlık bir fotoğraf periyodu altında% 60 ila% 75 bağıl nem ile 26 santigrat derecede dahili bir nem kontrolörü içeren bir inkübatöre yerleştirin.Haftada bir kez, tüm yetişkinleri kafeslerinden taze pirinç fideleri içeren yeni bir kafese nazikçe aktarmak için bir aspiratör kullanın. 200'den fazla yetişkinin çiftleşmesine ve pirinçte yumurta bırakmasına izin verin. Perileri ortaya çıkarması için eski pirinç fidelerini saklayın ve bu yeni virülifer olmayan nimfleri ikinci instar aşamasına getirin.Aspiratörü kullanarak, ikinci instar virülifer olmayan nimfleri açlık için bir ila iki saat boyunca bir cam kültür tüpüne dikkatlice aktarın. Daha sonra nimfleri bir tencerede yetişen pirinç cücesi virüsü enfekte pirinç bitkisi içeren bir kafese bırakın ve nimflerin enfekte olmuş pirinç bitkisi üzerinde iki gün boyunca beslenmelerine izin verin. İki gün sonra, bu nimfleri taze virüssüz pirinç fideleri içeren yeni bir kafese dikkatlice aktarın ve pirinç cüce virüsünün dolaşım bulaşma süresini tamamlamak için nimflerin 12 gün boyunca virüssüz pirinç fideleri üzerinde beslenmelerine izin verin.Tükürük proteinlerini toplamak için, bir ucunda böcek geçirmez ağ ile kaplı beş küçük boru benzeri besleme kafesi hazırlayın. Her besleme kafesine 15 ila 20 yaprak tutucu koyduktan sonra, kafesin diğer ucunu ince bir köpük paspas ile örtün. Bir pirinç fidesini kafesin ucu ile bantlı bir köpük paspas arasına sabitleyin ve besleme kafesindeki yaprakçıkların kafesin içine maruz kalan pirinç fideleriyle beslenebilmesini sağlayın.Fide köklerini suya batırın, böylece pirinç bitkisi canlı kalır ve yaprakçıkların iki gün boyunca beslenmelerine izin verin. İki gün sonra, yaprakçıkları besleme kafeslerinden çıkarın ve yaprakçıkların beslendiği pirinç fidelerini toplayın. Fideleri kafesin dışında kesin ve fidelerin beslenme bölgelerini geri kazanın.Hazırlanan 5x tamponun 200 mililitresini 800 mililitre steril su ile seyrelterek 1x Tris-Glisin tamponu hazırlayın. Daha sonra 10x TBS tamponu hazırlayın ve çözeltiyi 15 dakika boyunca 121 santigrat derecede otoklavlayın. Ardından, 4x protein numune arabelleğini hazırlayın.Daha sonra 800 mililitre Tris-Glisin tamponunu 200 mililitre metanol ile karıştırarak transfer tamponunu hazırlayın. Son olarak, 100 mililitre 10x TBS ve üç mililitre Tween 20 ila 900 mililitre steril su ekleyerek TBST çözeltisini hazırlayın. Tükürük ve viral proteinleri tespit etmek için, doku toz haline gelene kadar pirinç örneklerinin 0.1 gramını sıvı azotla öğütün.Daha sonra numuneye 4x protein numune tamponunun 200 mikrolitresini ekleyin ve 10 dakika kaynatın. Numuneleri santrifüj edin ve süpernatantı yeni bir şişeye aktarın. Numunenin 10 mikrolitresini bir SDS-PAGE jeline yükleyin ve 45 ila 60 dakika boyunca 150 voltta Tris-Glisin tamponunda çalıştırın.Jel çalışırken, 0.45 mikron nitroselüloz membranı ve diğer sandviç malzemelerini 30 dakika boyunca transfer tamponuna yerleştirin. Çalıştırmadan sonra, jeli sandviçleyin ve transfer tamponunda 100 voltta 90 ila 120 dakika boyunca aktarın. Lekeleme tamamlandıktan sonra, zarı TBST'de% 7'lik yağsız kuru süt bloke edici bir çözeltiye yerleştirin ve 20 dakika boyunca inkübe edin.Bundan sonra, pirinç cüce virüsü P8 veya vitellogenine karşı bir antikor ekleyin ve zarı iki saat veya gece boyunca inkübe edin. İnkübasyondan sonra, membranı TBST ile üç kez yıkayın ve her yıkama arasında beş dakikalık bir inkübasyon yapın. Daha sonra ikincil bir antikor olarak Goat anti-Rabbit IgG ekleyin ve zarı 60 ila 90 dakika boyunca inkübe edin.Kitteki bir ve iki karışık algılama reaktiflerinde bire bir oranında kemilüminesan algılama için ECL Western kitini kullanın. Membranı karışık reaktife koyun ve lekeyi beş dakika boyunca inkübe edin. Fazla reaktifi boşaltın ve membranın kemilüminesan ve kolorimetrik bir resmini çekin.İkincisini protein bantlarıyla görmek için resimleri birleştirin. Vitellogeninin tespiti için Batı leke analizi, pirinç bitkilerinin beslenmesinde ve böceklerin tükürük bezlerinde yaklaşık 220 kilodaltonluk spesifik ve beklenen bantlar göstermiştir. Buna karşılık, beslenmeyen bitkilerde hiçbir bant gözlenmemiştir, bu da vitellogeninin bitki konakçısında tükürük proteini olarak salındığını göstermektedir.Pirinç cüce virüsü P8 proteininin tespiti için yapılan Western leke analizi, besleme bitkilerinde ve virülifer böcek gövdelerinde yaklaşık 46 kilodaltonluk spesifik ve beklenen bir bant göstermiştir. Buna karşılık, beslenmeyen bitkilerde ve virülifer olmayan yaprak haznesi gövdelerinde hiçbir bant gözlenmemiştir, bu da viral proteinlerin besleme bitkilerinde de tespit edilebileceğini kanıtlamıştır. Bu protokol uygulanırken yaprakçıklardaki viral yükleme, tespit zamanlaması ve replikalar dikkate alınmalıdır.Bu yöntem, arbovirüsleri ileten sivrisinekleri incelemek için de uygulanabilir.

detecting-virus-salivary-proteins-leafhopper-vector-plant

Research

JoVE Journal

Biology

Biyoloji

Yaprak bitleri bitki virüsleri etkili vericileri. Virüs biti mikroenjeksiyon, bugün size gösterecektir prosedür, araştırmacılar, gut atlayarak, doğrudan yaprak biti hemocoel, bir circulative şekilde virüs iletimi için 2 önemli engellerin bir virüs enjekte etmek için izin veren bir tekniktir. Aynı teknik ayrıca dsRNA RNAi için enjekte etmek için kullanılır.

Mikroenjeksiyon kullanarak Yaprak bitleri Viral İletim Fizyolojik Engelleri Test

Source: Zhang, L., et al. Immunofluorescent Labeling of Plant Virus and Insect Vector Proteins in Hemipteran Guts. J. Vis. Exp. (2021)The video demonstrates the preparation of gut tissue from a plant virus–infected insect vector for fluorescence imaging. Fixed guts were washed, permeabilized, and incubated with two fluorescent antibodies in a blocking solution—one targeting a viral antigen in vesicles, the other a vesicle-associated membrane protein. The tissue was counterstained for actin...

Immunostaining to Visualize Viral Antigen and Host Protein Colocalization in the Insect Gut

Biz, böcek ve bitki dokularında virüs ve bakterilerin lokalizasyonu için burada in situ hibridizasyon, basit bir floresan (FISH) yöntemi tarif eder. Bu protokol bütün montaj mRNA görselleştirme ve mikroskopik bölümleri için uzatılabilir.

Floresan<em&gt; In situ</emVirüsler ve Bitki ve Böcek Dokularda Endosimbiyotik Bakterilerin lokalizasyonu&gt; Hibritlemeler (FISH)

Bitki hücreler arası bağlantıları, plasmodesmata (Pd), Fizyoloji ve bitki-virüs etkileşimleri bitki merkezi rol oynarlar. Kritik Pd taşıma olarak proteinler Pd için doğrudan sinyalleri sıralama. Ancak, bu DNA dizileri hakkında bilgimizi henüz emekleme aşamasında olduğunu. Pd yerelleştirme sinyalleri Pd hedeflenmiş proteinler tanımlamak için bir strateji tanımlarlar.

Proteinlerin içinde Planta serilerinde Plasmodesmal yerelleştirme tanımlaması

Burada, bir lepidopteran tür içindeki bir densovirüs konakçı fitness konak doku dağılımı, iletim modunu ve etkisi, pamuk kurtları araştırmak için bir protokol mevcut. Bu protokol aynı zamanda diğer oral bulaşan virüsler ve bunların haşere arasındaki etkileşimi incelemek için kullanılabilir.

Pamuk Yeşilkurt bir densovirüs Host Fitness Host doku Dağılımı, İletim-modunu ve Etkisi incelenmesi için Protokoller

Burada iki iplikçikli DNA genleri ile bitki virüsleri tanımlamak için yeni bir yaklaşım mevcut. DNA ve RNA virüslü yaprakları ayıklamak ve yeni nesil sıralama dışarı taşımak için standart yöntemleri kullanın. Bioinformatic araçları dizileri contigs monte, virüs genleri temsil eden contigs tanımlamak ve genleri taksonomik gruplara atamak.

Ham Virion ayıklama DNA analizi yeni virüs genleri keşfetmek için virüslü yaprakları gelen RNA analizi ile birleştirerek

Burada, Abdovirüs çoğaltma ve Abdovirüs çoğaltma kısıtlamak 2) ökaryotik ana faktörler teşvik 1) virüs kodlanmış immunomodulators tanımlamak için protokolleri mevcut. Floresan ve ışıldama dayalı yöntemlerin araştırmacılar hızla düşük sinyal noise oranları ile basit deneyleri Abdovirüs çoğaltma nicel veriler elde etmek için izin verir.

Araçlar Viral Immunomodulators ve ana bilgisayar Antiviral faktörler tanımlanması için eleme olarak Abdovirüs enfeksiyonlar

Burada, bitki patojenlerinde RNA susturucularını hızlı bir şekilde taramak için yaygın olarak kullanılabilecek değiştirilmiş bir tarama yöntemi salıyoruz.

Bitki Patojenlerinin Gizli Efektörlerinden RNA Susturucu Baskılayıcıların Taranması ve Tanımlanması

Eksize edilmiş böcek bağırsaklarında hem bitki virüsü proteinlerinin hem de vektör böcek proteinlerinin immünofloresan etiketlenmesi için bu protokol, virüs ve vektör böcekleri, böcek protein fonksiyonları ve virüs bulaşmasının altında yatan moleküler mekanizmalar arasındaki etkileşimleri incelemek için kullanılabilir.

Hemipteran Bağırsaklarda Bitki Virüsü ve Böcek Vektör Proteinlerinin İmmünofloresan Etiketlenmesi

Mevcut protokol, yapay bir ortam kullanarak delici emen böceklerden yeterli tükürük toplama yöntemini açıklar. Bu, böcek tükürüğü toplamak ve böcek besleme davranışı ve vektör kaynaklı virüs iletimi üzerinde tükürük fonksiyonunu incelemek için uygun bir yöntemdir.

Laodelphax striatellus Tükürük Koleksiyonu için İki Katmanlı Membran Sandviç Yöntemi

Daha sonraki analizler için ölçülebilir hemolenfleri küçük eklembacaklılardan verimli bir şekilde toplamak için bir yöntem tarif ediyoruz.

Küçük Eklembacaklılardan Hemolenf Toplamak için Kesin ve Ölçülebilir Bir Yöntem

Öğrenin, yaprakçık tükürük proteinleri ve bitki viral proteinlerini SDS-PAGE ve Western blot ile tespit etmeyi. Bu yöntem, bitki konaklarındaki protein etkileşimlerini ve viral bulaş mekanizmalarını araştırmak için kararlı ve tekrarlanabilir bir sistem sunar.

Bitki Konağındaki Bir Yaprakçık Vektörünün Virüs ve Tükürük Proteinlerinin Tespiti

Daha fazla video keşfet