Oda Sıcaklığında Çip Üzerinde Kristalizasyon ve Büyük Ölçekli Seri Kırınım
11 Mart 2022
Bu katkı, kristal üzerinde kristal cihazlarda protein kristalizasyonunun nasıl kurulacağını ve çip üzerinde kristalizasyon platformunu kullanarak oda sıcaklığında otomatik seri veri toplamanın nasıl gerçekleştirileceğini açıklamaktadır.
Bu protokol, x-ışını kırınım verilerinin hatırlanmasında çip benzeri bir cihazda protein kristalleşmesini gösterir. Bu cihaza kristal üzerine kristal denir, çünkü protein kristalleri tek bir kuvars kristali üzerinde büyür. Bu tür cihazlarda protein kristallerinin başarılı bir şekilde büyümesi üzerine, protein kristallerine dokunmadan oda sıcaklığında her cihazdan binlerce kırınım görüntüsü toplanır.
Oda sıcaklığında X-ışını kırınımı, birçok konformasyonel durumu içeren protein fonksiyonunu incelemek için çok önemlidir. Bu bilgilendirici protein değişiklikleri veya protein eylemleri dondurulabilir, böylece kriyo-kristalografide tespit edilemez. Bu cihazlar, ışık kaynaklı sinyalizasyon süreçlerini ve redoks değişikliklerini incelemek için kullanılabilir.
Yalnızca birkaç cihaz tam ve yedekli veri kümeleri verir. Cihaz ön montajına başlamak için, numune tanımlama için dış halkayı etiketleyin. Proje adını, cihaz numarasını, kristalleşme koşulunu ve tarihi istediğiniz gibi ekleyin.
Ardından etiketli halkayı temiz bir yüzeye baş aşağı yerleştirin ve dış halkanın içine bir kuvars gofret yerleştirin. Daha sonra, bir Petri kabına az miktarda mikroskop daldırma yağı dökün ve şimin her iki tarafının da iyi kaplandığından emin olmak için bir şimin yağa batırın. Şimleri temiz bir yüzeye sürterek fazla yağı temizleyin.
Ardından yağlı şimleri ilk kuvars gofretin üzerine yerleştirin. Protein çözeltisini ve kristalizasyon tamponunu bir pipet kullanarak ilk kuvars gofret üzerinde karıştırın. Karıştırırken hava kabarcıklarından kaçınmaya çalışın.
Kristalizasyon çözeltisinin toplam hacmi, dolgu boyutu ve kalınlığı tarafından belirlenen kristalizasyon odasının maksimum kapasitesini aşmamalıdır. İkinci kuvars gofreti karışık çözeltinin üzerine yerleştirin. Çözüm kendiliğinden yayılacaktır.
Ardından, havayı dışarı iterken yağın yayılmasına yardımcı olmak için ikinci kuvars gofrete hafifçe kenardan dokunun. Bir tutma halkasını dış bileziğe vidalayarak cihazı sabitleyin. Gerekirse, bir sıkma aleti kullanın.
Hassas kuvars gofretlerin deforme olmasına veya çatlamasına neden olabileceğinden aşırı sıkmadan kaçının. Monte edilen cihazları oda sıcaklığında bir kutuda veya sıcaklık kontrollü bir inkübatörün içinde saklayın. Birkaç saat veya gün sonra, kristalleşme cihazını mikroskop altına yerleştirin ve kristal büyümesini izleyin.
Gerekirse, kristalleşme koşullarını makalede açıklandığı gibi optimize edin. Kalibrasyon için, talaş tutucuya ince bir YAG kristali takın, ardından kiriş durdurucuyu takın. Ardından, Insitux yazılımını açın ve cihazın kristalizasyon cihazı ve cihazı için kullanıcı tarafından seçilen bir isim olduğu doğrudan ışının x-ışını floresan görüntülerini almak için belirtilen programı çalıştırın.
param, aygıta özgü denetim parametrelerini içeren dosya adıdır. Ardından, yanık görüntüsünün x-ışını floresan görüntüsünün dosya adı olduğu ışın profili uygulama programını çalıştırarak doğrudan x-ışını ışınının kesin konumunu bulun. Optik tarama için, talaş tutucuya bir kristalizasyon cihazı yerleştirin ve bir parmak vidası kullanarak sabitleyin.
Daha sonra talaş tutucuyu kinematik bir mekanizma aracılığıyla difraktometrenin çeviri aşamasına monte edin. Protein örneğinin ışık hassasiyetine ve deneyin amacına bağlı olarak, cihazın optik penceresinden mikrograf çekmek için beyaz veya kızılötesi bir ışık kaynağı takın. Kurulum hazır olduğunda, ışın hattında hareket halinde tarama için belirtilen komutu girerek tarama programını çalıştırın.
Ardından, döşeme programını, x'in sütunun başlangıç değeri olduğu ve y'nin mikrografların sahte yer değiştirmeleri için başlangıç değeri olduğu bir kullanıcı bilgisayarında çalıştırın. Program, tüm mikrografları bir ila üç mikrometre piksel çözünürlüğünde bir montaja diker. Mikrografları diktikten sonra, kristal bulma programını çalıştırmak için belirtilen komutu girin.
Bu program kristal tanıma ve atış planlaması gerçekleştirir ve bu programdaki temel parametreler belirli kristal seçimi ve hedef planlaması sağlar. Işık kaynağını çıkarın ve ışın durağını konumlandırın. Ardından seri kırınım için veri toplama programını çalıştırın.
Önerilen komut, planlanan çekimleri önceden programlanmış bir sırayla ziyaret ederek veri toplamayı tetikler. Hedeflenen her kristal ışın konumuna taşınır. Her durakta, x-ışını maruziyeti, planlanan bir zaman gecikmesinde lazer aydınlatmalı veya lazer aydınlatmasız olarak alınır.
Çalışmada, buhar difüzyonu ile çip üstü parti arasındaki kristalleşme koşulları karşılaştırılmıştır. Burada çip üzerinde kristalleşme ve doğrudan kuvars cihazlarından toplanan temsili veri kümeleri ile ilgili dört vaka çalışması gösterilmektedir. Dinamik kristalografi deneyleri, karanlıkta 4.352 kristalden ve ışık aydınlatmasından sonra 8.287 kristalden elde edilen verileri karşılaştırarak uzak kırmızı fotoreseptör proteininde ışığın neden olduğu değişiklikleri ortaya çıkardı.
In situ seri Laue kırınımından gelen karanlık veri kümesi, daha iyi çözülmüş elektron yoğunlukları ile sonuçlandı ve tüm Z işareti konformasyonunda iki kromozomun güvenli bir şekilde modellenmesini sağladı. Işık kaynaklı fark haritaları, merkezi beta tabakasında, kromoforun pirrol halkaları ile birkaç aromatik kalıntı arasındaki pi-pi istiflemesinin önemini gösteren uyumlu hareketleri ortaya çıkarmıştır. Bu platforma Insiteux denir.
Bu platformun benzersiz avantajı, kristalleşme yapıldıktan sonra herhangi bir kristal manipülasyonu yapmak zorunda kalmamasıdır. Protein hareketlerini yakalamak için değişen koşullar altında birçok veri kümesi toplamak gerekir. Ve bu Insitux ile mümkün hale geliyor çünkü oda sıcaklığında binlerce protein kristalinden büyük ölçekli veri toplamayı mümkün kılıyor.
Kristalografiyi de içeren bu yeni özellik sayesinde, ışığa duyarlı sistemler cihazın içinde tetiklenebilir ve kristal üzerine kristal cihaz çıkışlara dönüştürülürse ışık inert sistemi incelenebilir.
Tam transkripti görüntüleyin ve binlerce bilimsel videoya erişin
Genel Bakış
Bu protokol, X-ışını kırınım verisi toplama için çip benzeri bir cihaz üzerinde protein kristalizasyonunu gösterir. Kristal üzerinde kristal cihaz, tek bir kuvars kristalinde protein kristallerinin büyümesine izin vererek, oda sıcaklığında otomatik veri toplamayı mümkün kılar.
Çalışmanın Temel Bileşenleri
Bilim Alanı
- Protein kristalizasyonu
- X-ışını kırınımı
- Otomatik veri toplama
Arka Plan
- Protein kristalleri kristal üzerinde kristal cihazlarda yetiştirilebilir.
- Oda sıcaklığında X-ışını kırınımı, protein fonksiyonlarının incelenmesi için kritik öneme sahiptir.
- Proteinlerin konformasyonel halleri kriyo-kristalografya olmadan yakalanabilir.
- Bu yöntem, ışık kaynaklı sinyal iletim süreçlerinin incelenmesi için uygulanabilir.
Çalışmanın Amacı
- Çip benzeri cihazlar üzerinde protein kristalizasyonunu kurmak.
- Oda sıcaklığında otomatik seri veri toplama yapmak.
- Protein dinamikleri ve fonksiyonlarının incelenmesini kolaylaştırmak.
Kullanılan Yöntemler
- Kristalizasyon için kristal üzerinde kristal cihazların kullanılması.
- Binlerce kırınım görüntüsünün otomatik olarak toplanması.
- Oda sıcaklığında X-ışını kırınım teknikleri.
- Protein konformasyonel hallerinin analizi.
Ana Sonuçlar
- Cihazlar üzerinde protein kristallerini başarıyla yetiştirmek.
- Fiziksel temas olmadan geniş kırınım verisi toplamak.
- Oda sıcaklığı çalışmalarının etkinliğini göstermek.
- Sinyal iletim süreçleri sırasında protein eylemleri ve değişimleri hakkında bilgiler elde etmek.
Sonuçlar
- Kristal üzerinde kristal cihaz, protein kristalizasyonu için etkilidir.
- Oda sıcaklığında X-ışını kırınımı değerli bilgiler sağlar.
- Bu yöntem, protein dinamiklerinin anlaşılmasına katkıda bulunabilir.
Sıkça Sorulan Sorular
Executive Industry Relevance
Studying protein dynamics at physiological temperatures is critical for understanding functional mechanisms in drug discovery. This platform enables room-temperature X-ray diffraction without crystal manipulation, supporting the capture of conformational states relevant to target validation. It provides a scalable approach to generate high-quality structural data for mechanistic de-risking in early discovery.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of protein functional states under near-physiological conditions to support target hypothesis testing.
- Operational Value: Reduces need for cryogenic workflows, simplifying structural analysis of dynamic targets.
- Predictive Value: Facilitates observation of light-induced or redox-driven conformational changes relevant to signaling pathways.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Produces diffraction-quality crystals directly on chip, eliminating transfer steps that can compromise sample integrity.
- Operational Value: Allows hundreds to thousands of crystals to be screened in an automated, label-free manner.
- Assay Readiness: Generates standardized, diffraction-ready samples for high-throughput structural interrogation.
Translational & Preclinical Research
- Translational Continuity: Supports structural follow-up of hits from phenotypic screens by providing atomic-level insights into mechanism of action.
- Mechanistic De-risking: Enables correlation of structural states with functional outputs in disease-relevant systems.
- Predictive Confidence: Improves target validation by revealing conformational ensembles that inform drug binding modes.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the discovery continuum from target validation through lead optimization by providing structural data that informs mechanistic understanding without perturbing native-state dynamics.
- Discovery Biology: Supports hypothesis-driven structural biology by enabling time-resolved or condition-specific data collection.
- Screening: Delivers diffraction data from native-state crystals grown in situ, enhancing reliability of structural readouts.
- Analytics: Provides electron density maps and difference maps that quantify structural changes upon perturbation.
- Translational Research: Connects structural observations to functional assays through correlated light- or redox-induced changes.
- Enterprise Reuse: Devices can be replicated across projects and conditions, serving as a structural screening platform.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Captures protein dynamics at room temperature, reducing risk of cryo-induced artifacts in structural interpretation.
- Operational Value: Eliminates crystal harvesting and mounting, increasing throughput and reducing sample loss.
- Strategic Value: Enables rapid iteration between functional and structural assays for iterative design cycles.
- Portfolio Impact: Improves confidence in target mechanism, supporting go/no-go decisions in lead optimization.
Implementation Considerations
- Requires expertise in protein crystallization, X-ray diffraction, and optical microscopy.
- Depends on access to synchrotron beamlines capable of serial Laue diffraction and fast detectors.
- Necessitates standardized crystallization conditions and device handling protocols across teams.
- Adaptation to different protein systems may require optimization of chamber dimensions and surface properties.
- Practical limitation: Data quality depends on crystal size and diffraction limit, which varies by target.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:04
Introduction
0:59
Device Pre‐Assembly, Sample Loading, and Device Assembly
2:36
Device Storage, Crystallization Optimization, and Calibration
3:42
Optical Scanning
4:59
X‐Ray Diffraction
5:34
Results: On‐Chip Protein Crystallization Platform for Automated Serial Diffraction Collection
6:45
Conclusion
