Name: Oda Sıcaklığında Çip Üzerinde Kristalizasyon ve Büyük Ölçekli Seri Kırınım (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-03-11T12:30:00.000+00:00
Duration: 7 min 42 s
Description: Öğrenin, çip üzerinde protein kristalleştirme ve oda sıcaklığında büyük ölçekli seri X-ışını kırınımı yöntemini. Kristal-üzerinde-kristal cihazı, binlerce kristalden otomatik veri toplama imkanı sunar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Argonne Ulusal Laboratuvarı tarafından ABD Enerji Bakanlığı için işletilen bir Bilim Ofisi Kullanıcı Tesisi olan Gelişmiş Foton Kaynağı'nın kullanımı, DE-AC02-06CH11357 sözleşmesi ile desteklenmiştir. BioCARS'ın kullanımı, Ulusal Sağlık Enstitüleri Ulusal Genel Tıp Bilimleri Enstitüsü tarafından R24GM111072 hibe numarası ile desteklenmiştir. İçerik yalnızca yazarların sorumluluğundadır ve Ulusal Sağlık Enstitüleri'nin resmi görüşlerini temsil etmek zorunda değildir. LS-CAT Sektör 21'in kullanımı, Michigan Ekonomik Kalkınma Şirketi ve Michigan Teknoloji Tri-Koridor hibesi 085P1000817 tarafından desteklenmiştir. Bu çalışma, Chicago'daki Illinois Üniversitesi, Ulusal Sağlık Enstitüleri (R01EY024363) ve Ulusal Bilim Vakfı'ndan (MCB 2017274) XY'ye verilen hibelerle desteklenmektedir.

1. Cihaz ön montajı
<ol><li>Numune tanımlama için dış halkayı (30 mm çap) etiketleyin. Gerekirse, proje adını, cihaz numarasını, kristalleşme durumunu ve tarihini ekleyin (Şekil 1A). Dış halkayı temiz bir yüzeye baş aşağı yerleştirin (Şekil 1B) ve halkanın içine dikkatlice bir kuvars gofret yerleştirin (Şekil 1C). Bu ilk kuvars gofret, olay X-ışınları için bir giriş penceresi görevi görür.</li>
	<li>Petri kabına az miktarda mikroskop daldırma yağı (150 cSt'lik viskozite) dökün. Bir şimin yağa batırın ve şimin her iki tarafının da uygun şekilde yağlandığından emin olun (Şekil 1D). Şimleri temiz bir yüzeye sürterek fazla yağı çıkarın.</li>
	<li>Yağlanmış şimleri ilk kuvars gofretin üzerine yerleştirin (Şekil 1E). NOT: Daldırma yağı, kristalizasyon odasını potansiyel buhar kaybından koruyan mükemmel bir sızdırmazlık maddesidir. Düzgün bir şekilde monte edilmiş talaşlar genellikle görünür kuruma olmadan haftalarca dayanır. Bu ön montaj adımı oda ışığı altında gerçekleştirilir. Işığa duyarlı numuneler için, numune yükleme, cihaz depolama ve gözlem dahil olmak üzere sonraki tüm adımlar güvenlik ışığı altında gerçekleştirilmelidir.</li>
</ol>2. Numune yükleme ve cihaz montajı
<ol><li>İlk kuvars gofret üzerindeki protein çözeltisini ve kristalizasyon tamponunu iyice karıştırmak için bir pipet kullanın. Protein numunesi ve tampon arasındaki hacim oranı tipik olarak 2: 1 ila 1: 2 arasında değişmektedir (Şekil 1F). Kristalizasyon çözeltisinin toplam hacminin, şim boyutu ve kalınlığı tarafından belirlenen kristalizasyon odasının maksimum kapasitesini aşmadığından emin olun. Karıştırma sırasında hava kabarcıklarından kaçının. NOT: Bir kristalleşme tamponunun bileşimi bir deneyden diğerine değişir. Kristalleşme koşulları için Tablo 1'e bakınız.</li>
	<li>İkinci kuvars gofreti, çözelti yayılmaya başladığında karışık çözeltinin üzerine yerleştirin (Şekil 1G). Bu ikinci kuvars gofret, kırınımlı X-ışınlarının çıkış penceresi olarak işlev görür.</li>
	<li>Havayı dışarı iterken yağın yayılmasına yardımcı olmak için ikinci kuvars gofrete hafifçe kenardan dokunun. Bir tutma halkasını dış bileziğe vidalayarak cihazı sabitleyin (Şekil 1H). Gerekirse bir sıkma aleti kullanın (Şekil 1I). Aşırı sıkmanın hassas kuvars gofretlerin deforme olmasına ve hatta çatlamasına neden olabileceğini unutmayın.</li>
</ol>3. Cihaz depolama ve kristalizasyon optimizasyonu
<ol><li>Monte edilen cihazları (Şekil 1J) oda sıcaklığında bir kutuda veya sıcaklık kontrollü bir inkübatörün içinde saklayın. NOT: Protein kristalleri, bir kristalizasyon cihazı monte edildikten birkaç saat ila birkaç gün sonra ortaya çıkabilir. Birkaç temsili protein örneği için çip üzerinde kristalleşmeden elde edilen tipik sonuçlar gösterilmiştir (Şekil 2).</li>
	<li>Kristalleşme cihazını mikroskop altında gözlemleyerek kristal büyümesini izleyin. Gerekirse, kristalleşme koşullarını bölüm 1-3'ün yinelemeleriyle optimize edin.</li>
</ol>4. Kalibrasyon
NOT: Aşağıdaki bölümlerde belirtilen programlar ve komutlar inSituX yazılımında çalıştırılmaktadır.
<ol><li>Talaş tutucuya ince bir katkılı itriyum alüminyum garnet kristali takın (Şekil 3). Kiriş durağını takın. Programı çalıştırarak doğrudan ışının X-ışını floresan görüntülerini alın: burnmark.py <cihaz>.param Burada <cihaz> , kristalizasyon aygıtı için kullanıcı tarafından seçilen bir addır. <device>.param , cihaza özgü kontrol parametrelerini içeren bir dosya adıdır. Varsayılan değerler kademeli olarak protokol boyunca belirli değerlerle değiştirilecektir. Örnek bir <device>.param dosyası Ek Dosya 1'de gösterilmiştir.</li>
	<li>Kiriş profili uygulama programını çalıştırarak doğrudan X-ışını ışınının kesin konumunu bulun: beam.py <görüntüyü yak> -d <aygıt> Burada <yanık görüntüsü> , X-ışını floresan görüntüsünün dosya adıdır (Şekil 4). NOT: Bu program, hassas doğrudan ışın konumlarını ve ışın boyutunu hesaplar. Işın konumu, aynı cihazdan gelen tüm kristaller için translokasyon hedefini işaretler. Kiriş boyutu ayrıca hedef planlaması için de kullanılır.</li>
</ol>5. Optik tarama
<ol><li>Talaş tutucuya bir kristalizasyon cihazı yerleştirin ve cihazı bir parmak vida kullanarak sabitleyin (Şekil 3A).</li>
	<li>Talaş tutucuyu kinematik bir mekanizma ile difraktometrenin çeviri aşamasına monte edin (Şekil 3B).</li>
	<li>Mikrografları cihazın optik penceresinden almak için uygun bir ışık kaynağı takın. Beyaz ışık, IR ışığı veya tercih edilen diğer ışıklar, protein numunesinin ışık hassasiyetine ve deneyin amacına bağlı olarak kullanılabilir.</li>
	<li>Tarama programını çalıştırın: scan.py <cihaz>.param Bu program, belirtilen kullanıcı bilgisayarlarına otomatik olarak aktarılan bir dizi mikrografı yakalar.</li>
	<li>Döşeme programını bir kullanıcı bilgisayarında çalıştırın: tile.py <cihaz> -x <x> -y <y> burada < x > ve <y> , sırasıyla mikrografların sütun ve satır yer değiştirmeleri için başlangıç değerleridir. Bu program tüm mikrografları 1-3 μm/piksel çözünürlüklü bir montaja diker (Şekil 5). NOT: Adım 5.4 ve 5.5 genellikle birkaç dakika sürer. Toplam mikrograf sayısı, tarama alanına ve büyütmeye bağlı olarak birkaç on ila yüzlerce arasında değişmektedir.</li>
	<li>Kristal bulma programını çalıştırın: findX.py <montaj> -c <uzunluk> <genişlik> -w < kama> -x < boy> burada <montaj> döşenmiş görüntüdür. Bu program kristal tanıma ve atış planlaması yapar. <uzunluk> ve <genişlik> bulunacak kristal boyutunu gösterir. Kullanıcı daha küçük kristallerden kaçınmak isterse, <genişlik> , istenmeyen küçük kristallerin boyutlarından daha büyük bir sayı ayarlayarak kesme olarak kullanılabilir. <kama> , düzensiz şekilli kristallerin toleransını ayarlayan açısal bir değerdir. <kiriş boyutu> , yukarıdaki profil bağlantısından elde edilen doğrudan kiriş boyutunu ifade eder (adım 4.2; Şekil 4). Ayrıca, hedeflenen çekimleri daha fazla boşluk bırakmak için kullanıcılar tarafından nominal bir değer ayarlanabilir. Bu anahtar parametreler spesifik kristal seçimi ve hedef planlaması sağlar (Şekil 6).</li>
</ol>6. X-ışını kırınımı
<ol><li>Işık kaynağını çıkarın ve ışın durdurucuyu takın. Uygun bir dedektör mesafesi ayarlayın. X-ışını kulübesini aramak için ışın hattı güvenlik protokolünü izleyin. Varsa X-ışını deklanşörünü ve lazer deklanşörü açın.</li>
	<li>Seri kırınım için veri toplama programını çalıştırın: collect.py <cihaz>.param -l <ışık süresi> Bu komut, planlanan tüm çekimlerin önceden programlanmış bir diziye göre birbiri ardına ziyaret edildiği veri toplamayı tetikler. Hedeflenen her kristal ışın konumuna taşınır (adım 4.2). Her durakta, X-ışını maruziyeti, planlanan bir zaman gecikmesinde lazer aydınlatmalı veya lazer aydınlatmasız olarak alınır. Film 1, 1 Hz frekansında çalıştırılan otomatik bir veri toplama dizisini gösterir. rutin olarak onlarca ila yüzlerce kırınım görüntüsü tek bir kristalizasyon cihazından toplanır (Film 2). NOT: Bölüm 4 kalibrasyonu ve bölüm 5 optik tarama, inSituX platformunda bağımsız olarak bulunur, bu nedenle tamamen başka bir ışın hattına aktarılabilir. Bölüm 6 X-ışını kırınımı, ışın hattı çalışmasında bazı detaylar içermelidir.</li>
</ol>

<ol><li>Brändén, G., Neutze, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Advances+and+challenges+in+time-resolved+macromolecular+crystallography%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Advances and challenges in time-resolved macromolecular crystallography.</a> Science. 373, (2021).</li>
<li>Fischer, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Macromolecular+room+temperature+crystallography%5BTitle%5D)+AND+%22Quarterly+Reviews+of+Biophysics%22%5BJournal%5D)">Macromolecular room temperature crystallography.</a> Quarterly Reviews of Biophysics. 54, (2021).</li>
<li>Schaffer, J. E., Kukshal, V., Miller, J. J., Kitainda, V., Jez, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Beyond+X-rays%3A+an+overview+of+emerging+structural+biology+methods%5BTitle%5D)+AND+%22Emerging+Topics+in+Life+Sciences%22%5BJournal%5D)">Beyond X-rays: an overview of emerging structural biology methods.</a> Emerging Topics in Life Sciences. 5 (2), 221-230 (2021).</li>
<li>Nogales, E., Scheres, S. H. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cryo-EM%3A+A+unique+tool+for+the+visualization+of+macromolecular+complexity%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Cell%22%5BJournal%5D)">Cryo-EM: A unique tool for the visualization of macromolecular complexity.</a> Molecular Cell. 58, 677-689 (2015).</li>
<li>Chapman, H. N., Caleman, C., Timneanu, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diffraction+before+destruction%5BTitle%5D)+AND+%22Philosophical+Transactions+of+the+Royal+Society+B+Biological+Sciences%22%5BJournal%5D)">Diffraction before destruction.</a> Philosophical Transactions of the Royal Society B Biological Sciences. 369, 20130313(2014).</li>
<li>Kisselman, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((X-CHIP%3A+an+integrated+platform+for+high-throughput+protein+crystallization+and+on-the-chip+X-ray+diffraction+data+collection%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Crystallographica+Section+D+Biological+Crystallography%22%5BJournal%5D)">X-CHIP: an integrated platform for high-throughput protein crystallization and on-the-chip X-ray diffraction data collection.</a> Acta Crystallographica Section D Biological Crystallography. 67 (6), 533-539 (2011).</li>
<li>Liang, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+combined+crystallization+plate+for+high-throughput+crystal+screening+and+in+situ+data+collection+at+a+crystallography+beamline%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Crystallographica+Section+F+Structural+Biology+Communications%22%5BJournal%5D)">Novel combined crystallization plate for high-throughput crystal screening and in situ data collection at a crystallography beamline.</a> Acta Crystallographica Section F Structural Biology Communications. 77, 319-327 (2021).</li>
<li>le Maire, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In-plate+protein+crystallization%2C+in+situ+ligand+soaking+and+X-ray+diffraction%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Crystallographica+Section+D+Biological+Crystallography%22%5BJournal%5D)">In-plate protein crystallization, in situ ligand soaking and X-ray diffraction.</a> Acta Crystallographica Section D Biological Crystallography. 67, 747-755 (2011).</li>
<li>Perry, S. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+situ+serial+Laue+diffraction+on+a+microfluidic+crystallization+device%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Applied+Crystallography%22%5BJournal%5D)">In situ serial Laue diffraction on a microfluidic crystallization device.</a> Journal of Applied Crystallography. 47, 1975-1982 (2014).</li>
<li>Ren, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Crystal-on-crystal+chips+for+in+situ+serial+diffraction+at+room+temperature%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+on+a+Chip%22%5BJournal%5D)">Crystal-on-crystal chips for in situ serial diffraction at room temperature.</a> Lab on a Chip. 18, 2246-2256 (2018).</li>
<li>Ren, Z. Single crystal quartz chips for protein crystallization and X-ray diffraction data collection and related methods. US patent. , 9632042 (2017).</li>
<li>Ren, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+automated+platform+for+in+situ+serial+crystallography+at+room+temperature%5BTitle%5D)+AND+%22IUCrJ%22%5BJournal%5D)">An automated platform for in situ serial crystallography at room temperature.</a> IUCrJ. 7, 1009-1018 (2020).</li>
<li>Croes, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+method+for+solving+traveling+salesman+problems%5BTitle%5D)+AND+%22Operations+Research%22%5BJournal%5D)">A method for solving traveling salesman problems.</a> Operations Research. 6, 791-812 (1958).</li>
<li>Bandara, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Crystal+structure+of+a+far-red-sensing+cyanobacteriochrome+reveals+an+atypical+bilin+conformation+and+spectral+tuning+mechanism%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Crystal structure of a far-red-sensing cyanobacteriochrome reveals an atypical bilin conformation and spectral tuning mechanism.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 118, 2025094118(2021).</li>
<li>Shin, H., Ren, Z., Zeng, X., Bandara, S., Yang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+basis+of+molecular+logic+OR+in+a+dual-sensor+histidine+kinase%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Structural basis of molecular logic OR in a dual-sensor histidine kinase.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 116, 19973-19982 (2019).</li>
<li>Yang, X., Ren, Z., Kuk, J., Moffat, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Temperature-scan+cryocrystallography+reveals+reaction+intermediates+in+bacteriophytochrome%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Temperature-scan cryocrystallography reveals reaction intermediates in bacteriophytochrome.</a> Nature. 479, 428-432 (2011).</li>
<li>Zhang, F., Scheerer, P., Oberpichler, I., Lamparter, T., Krauss, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Crystal+structure+of+a+prokaryotic+%286-4%29+photolyase+with+an+Fe-S+cluster+and+a+6%2C7-dimethyl-8-ribityllumazine+antenna+chromophore%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Crystal structure of a prokaryotic (6-4) photolyase with an Fe-S cluster and a 6,7-dimethyl-8-ribityllumazine antenna chromophore.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110, 7217-7222 (2013).</li>
<li>Zeng, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic+crystallography+reveals+early+signaling+events+in+ultraviolet+photoreceptor+UVR8%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Plants%22%5BJournal%5D)">Dynamic crystallography reveals early signaling events in ultraviolet photoreceptor UVR8.</a> Nature Plants. 1, 14006(2015).</li>
<li>Wang, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Insights+into+base+selectivity+from+the+1.8+%C3%85+resolution+structure+of+an+RB69+DNA+polymerase+ternary+complex%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Insights into base selectivity from the 1.8 Å resolution structure of an RB69 DNA polymerase ternary complex.</a> Biochemistry. 50, 581-590 (2011).</li>
<li>Rodgrs, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cryocrystallography%5BTitle%5D)+AND+%22Structure%22%5BJournal%5D)">Cryocrystallography.</a> Structure. 2, 1135-1140 (1994).</li>
<li>Zhao, F. -Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+guide+to+sample+delivery+systems+for+serial+crystallography%5BTitle%5D)+AND+%22TheFEBS+Journal%22%5BJournal%5D)">A guide to sample delivery systems for serial crystallography.</a> TheFEBS Journal. 286, 4402-4417 (2019).</li>
</ol>

ZR, Renz Research, Inc.'e verilen ABD patent 9632042 kristal üzerine kristal çiplerin mucididir.

İlk yıllarda oda sıcaklığında yapılan protein kristalografisi, X-ışını radyasyon hasarıyla mücadelede muazzam zorluklar yaşadı. Böylece, senkrotron X-ışını kaynakları kolayca kullanılabilir hale geldiğinden daha sağlam kriyokristalografi yöntemi ile değiştirildi20. X-ışını serbest elektron lazerlerinin ortaya çıkmasıyla, oda sıcaklığındaki protein kristalografisi, son yıllarda fizyolojik olarak ilgili bir sıcaklıktaprotein yapısal dinamiklerini gözlemleme arzusuyla yönlendi...

X-ışını radyasyonunun iyonlaştırıcı etkileri nedeniyle, protein kristalografisi, büyük ölçüde, son otuz yılda kriyojenik koşullarla sınırlı kalmıştır. Bu nedenle, fonksiyonu sırasında protein hareketlerinin mevcut bilgisi, büyük ölçüde, kriyojenik koşullar altında farklı durumlarda gözlenen statik yapılar arasındaki karşılaştırmalardan kaynaklanmaktadır. Bununla birlikte, kriyojenik sıcaklıklar kaçınılmaz olarak biyokimyasal reaksiyonun ilerlemesini veya protein molekülleri çalışırken farklı konformasyonel durumlar arasındaki karşılıklı dönüşümü engeller. Kristalografi ile atomik çözünürlükte protein yapısal dinamiklerini doğrudan gözlemlemek için, oda sıcaklığında kırınım deneyleri yapmak için sağlam ve rutin yöntemlere ihtiyaç vardır, bu da numune sunumu, veri toplama ve posterior veri analizinde teknik yenilikler gerektirir. Bu amaçla, seri kristalografideki son gelişmeler,ara ürünlerin ve kısa ömürlü yapısal türlerin moleküler görüntülerini oda sıcaklığında 1,2,3 olarak yakalamak için yeni yollar sunmuştur. Geleneksel kriyokristalografide yaygın olarak kullanılan "bir-kristal-bir-veri kümesi" stratejisinin aksine, seri kristalografi, tek parçacıklı kriyo-elektron mikroskobuna benzer bir veri toplama stratejisi benimser. Spesifik olarak, seri kristalografideki deneysel veriler, çok sayıda bireysel örneklemden küçük fraksiyonlar halinde toplanır, bunu veri fraksiyonlarının değerlendirildiği ve 3D yapı belirleme için eksiksiz bir veri kümesinde birleştirildiği yoğun veri işlemeizler 4. Bu "tek kristalli tek atış" stratejisi, yıkım stratejisi5'ten önce bir kırınım yoluyla oda sıcaklığında protein kristallerine X-ışını radyasyon hasarını etkili bir şekilde hafifletir.
Seri kristalografi, bir veri kümesini tamamlamak için çok sayıda protein kristali gerektirdiğinden, protein örneklerinin sınırlı olduğu ve / veya hassas kristal kullanımının söz konusu olduğu birçok biyolojik sistem için büyük teknik zorluklar ortaya çıkarmaktadır. Bir diğer önemli husus, seri kırınım deneylerinde kristal bütünlüğünün en iyi şekilde nasıl korunacağıdır. In situ kırınım yöntemleri, protein kristallerinin kristalleşme odası 6,7,8,9'un mührünü kırmadan doğrudan büyüdükleri yerden difüzyon yapmalarına izin vererek bu endişeleri ele almaktadır. Bu elleçlemesiz yöntemler, büyük ölçekli seri kırınımla doğal olarak uyumludur. Son zamanlarda, kristal üzerine kristal konseptine dayanan in situ kırınım için bir kristalizasyon cihazının tasarımını ve uygulanmasını bildirdik - doğrudan monokristalin kuvars11 üzerinde yetiştirilen protein kristalleri. Bu "kristal üzerine kristal" cihaz çeşitli avantajlar sunar. İlk olarak, çok az arka plan saçılması üreten monokristalin kuvars substrattan yapılmış bir X-ışını ve ışık şeffaf pencereye sahiptir, bu nedenle protein kristallerinden kırınım görüntülerinde mükemmel sinyal-gürültü oranları ile sonuçlanır. İkincisi, tek kristalli kuvars, cama eşdeğer mükemmel bir buhar bariyeridir, böylece protein kristalizasyonu için kararlı bir ortam sağlar. Buna karşılık, polimer bazlı substratlar kullanan diğer kristalizasyon cihazları, polimer malzeme önemli bir kalınlığa sahip olmadığı sürece buhar geçirgenliği nedeniyle kurumaya eğilimlidir, bu da sonuç olarak yüksek arka plan saçılmasına katkıda bulunur10. Üçüncüsü, bu cihaz, kristal bütünlüğünü korumak için kritik olan herhangi bir kristal manipülasyonu veya hasadı olmadan X-ışını ışınına çok sayıda protein kristalinin verilmesini sağlar11.
Kristal üzerine kristal cihazları kullanarak seri X-ışını kırınım deneylerini kolaylaştırmak için, optik tarama ve X-ışını kırınım modları12 arasında kolay geçişi kolaylaştırmak için bir difraktometre prototipi geliştirdik. Bu difraktometre küçük bir ayak izine sahiptir ve Argonne Ulusal Laboratuvarı'ndaki Gelişmiş Foton Kaynağı'nın (APS) iki ışın çizgisinde seri veri toplama için kullanılmıştır. Özellikle, Laue kırınımı için BioCARS 14-ID-B ve tek renkli salınım için LS-CAT 21-ID-D kullandık. Bu difraktometre donanımı, bir senkrotron veya X-ışını serbest elektron lazer ışın hattı iki temel yetenekle donatılmışsa gerekli değildir: (1) X-ışını ışını etrafında her yöne ±12 mm'lik bir hareket aralığına sahip motorlu numune konumlandırma; ve (2) incelenen protein kristalleri için güvenli olan ışık aydınlatması altında kristal görüntüleme için eksen üstü bir dijital kamera. Monokristal kuvars cihazı, taşınabilir bir difraktometre ve optik tarama, kristal tanıma ve otomatik yerinde veri toplama kontrol yazılımı ile birlikte seri kristalografi için inSituX platformunu oluşturur. Bu gelişme öncelikle polikromatik bir X-ışını kaynağı kullanan dinamik kristalografi uygulamalarından kaynaklansa da, bu teknolojinin monokromatik salınım yöntemlerini destekleme potansiyelini gösterdik10,12. Otomasyon ile bu platform, uygun fiyatlı protein tüketimi ile oda sıcaklığında yüksek verimli bir seri veri toplama yöntemi sunar.
Bu katkıda, ıslak bir laboratuvarda çip üzerinde kristalizasyonun nasıl kurulacağını ve inSituX platformunu kullanarak bir senkrotron ışın hattında seri X-ışını veri toplamanın nasıl gerçekleştirileceğini ayrıntılı olarak açıklıyoruz.
Toplu iş yöntemi, aynı protein numunesi için elde edilen buhar difüzyon yöntemine benzer bir koşul altında çip üzerinde kristalizasyonu ayarlamak için kullanılır (Tablo 1). Başlangıç noktası olarak, buhar difüzyon yöntemi için bunun 1.2-1.5x konsantrasyonunda çökeltici kullanmanızı öneririz. Gerekirse, parti kristalizasyon koşulu ince ızgara taraması ile daha da optimize edilebilir. Kuvars gofretler optimizasyon denemeleri için gerekli değildir; bunun yerine cam kapaklar kullanılabilir (aşağıya bakınız). Optimizasyon denemelerini daha küçük ölçekte tutmak için kısmen yüklü kristalizasyon cihazları önerilir. Bir dizi protein örneği, parti yöntemi10 kullanılarak bu tür cihazlarda başarıyla kristalize edilmiştir (Tablo 1).
Cihazın kendisi aşağıdaki parçalardan oluşur: 1) bir dış halka; 2) iki kuvars gofret; 3) plastik veya paslanmaz çelikten bir yıkayıcı benzeri şim; 4) bir tutma halkası; 5) sızdırmazlık maddesi olarak mikroskop daldırma yağı (Şekil 1). Bir çipe yüklenen kristalizasyon çözeltisinin toplam hacmi, deneyin amacına bağlıdır. Kristalizasyon odasının kapasitesi, farklı kalınlıklarda ve / veya iç çaplarda bir şim seçilerek ayarlanabilir. 50-100 μm kalınlığında şimler kullanarak rutin olarak 10-20 μL kapasiteli kristalizasyon cihazları kuruyoruz. Tipik bir cihaz, seri veri toplama için yeterli on binlerce protein kristali üretebilir (Şekil 2).
Başarılı olduğunda, çip üzerinde kristalizasyon, X-ışını kırınımı için hazır her kuvars cihazında onlarca ila yüzlerce hatta binlerce protein kristali üretecektir. Bir senkrotron ışın hattında, böyle bir cihaz, kinematik bir mekanizma kullanılarak difraktometrenin üç eksenli bir çeviri aşamasına monte edilir. Monte edilmiş bir cihazın kristalleşme penceresi optik olarak taranır ve onlarca ila yüzlerce mikrografta görüntülenir. Bu mikrograflar daha sonra yüksek çözünürlüklü bir montaja dikilir. Işığa duyarlı kristaller için, istenmeyen fotoaktivasyonu önlemek için kızılötesi (IR) ışık altında optik tarama yapılabilir. Cihaz üzerinde rastgele dağıtılan protein kristallerini tanımlamak ve bulmak için bir bilgisayarlı görme yazılımı geliştirilmiştir. Bu kristaller daha sonra seri kristalografide veri toplama stratejisini bilgilendirmek veya yönlendirmek için boyutlarına, şekillerine ve konumlarına göre sıralanır. Örneğin, hedeflenen her kristal üzerinde tek veya birden fazla atış bulunabilir. Kullanıcılar hedeflenen kristaller aracılığıyla tek bir geçiş veya birden fazla rota planlayabilirler. Çeşitli seyahat rotalarını hesaplamak için yazılım uyguladık. Örneğin, en kısa yol, seyahat eden satıcı problemini ele alan algoritmalar kullanılarak hesaplanır13. Pompa-prob dinamik kristalografik uygulamalar için, lazer (pompa) ve X-ışını (prob) çekimlerinin zamanlaması ve süresi seçilebilir. Otomatik bir seri veri toplama, hedeflenen her kristali birbiri ardına X-ışını ışınına dönüştürmek için programlanmıştır.
InsituX difraktometrenin temel bileşenleri şunlardır: 1) bir cihaz tutucu; 2) üç eksenli çeviri aşaması; 3) optik tarama için bir ışık kaynağı; 4) bir X-ışını ışını durdurma; 5) ışığa duyarlı proteinler incelenirse lazerleri pompalayın; 6) IR'ye duyarlı bir kamera ile donatılmış Raspberry Pi mikrobilgisayarı; 7) motorları, kamerayı, ışık kaynaklarını, pompa lazerini senkronize etmek ve ışın hattı kontrolleri ile arayüz oluşturmak için kontrol yazılımı.

<table><tbody><tr><td>Analiz yazılımı</td><td>Şirket içi geliştirilen</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Seryum katkılı itriyum alüminyum granat</td><td>MSE Malzemeleri</td><td></td><td>Ce: Y3Al5O12, YAG tek kristal yüzeyler</td></tr><tr><td>Çip tutucu</td><td>Şirket içi geliştirilen</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Kontrol yazılımı</td><td>Şirket içi geliştirilen</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Daldırma yağı</td><td>Cargille Laboratories</td><td>16482</td><td>Tip A düşük viskozite 150 cSt</td></tr><tr><td>inSituX platformu</td><td>Şirket içi geliştirilen</td><td></td><td></td></tr><tr><td>IR ışık kaynağı</td><td>Thorlabs Incorporated</td><td>LED1085L</td><td>Cam Lensli LED, 1085 nm, 5 mW, TO-18</td></tr><tr><td>Mikroskop</td><td>Zeiss</td><td></td><td>SteREO Discovery V8</td></tr><tr><td>Dış halka</td><td>Şirket içi geliştirilen</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Petri kabı</td><td>Fisher Scietific</td><td>FB0875713</td><td></td></tr><tr><td>Pipet</td><td>Pipetman</td><td>F167380</td><td>P10</td></tr><tr><td>Pompa lazerleri</td><td>Thorlabs Incorporated</td><td>LD785-SE400</td><td>785 nm, 400 mW, & Oslash; 9 mm, E Pin Kodu, Lazer Diyot</td></tr><tr><td>Raspberry Pi</td><td>Raspberry Pi Fonlama</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tutma halkası</td><td>Thorlabs Incorporated</td><td>SM1RR</td><td>SM1 tutma halkası & Oslash için; 1" lens tüpleri ve yuvaları</td></tr><tr><td>Çekirdeksiz kuvars kristali</td><td>University Wafers, Inc.</td><td>U01-W2-L-190514</td><td>25,4 mm çap Z-kesim 0,05 mm kalınlık çift taraflı cila 8 mm on -X</td></tr><tr><td>Şim</td><td>Şirket içi geliştirilen</td><td></td><td></td></tr><tr><td>X-ışını huzme durdurucu</td><td>Şirket içi geliştirildi</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

oda sıcaklığında Çip Üzerinde kristalizasyon ve büyük Ölçekli seri kırınım

On-Chip Crystallization and Large-Scale Serial Diffraction at Room Temperature

Biyokimyasal reaksiyonlar ve biyolojik süreçler, proteinlerin fonksiyonel durumları arasında nasıl geçiş yaptığını göstererek en iyi şekilde anlaşılabilir. Kriyojenik sıcaklıklar fizyolojik olmadığından ve protein yapısal dinamiklerini önleyebileceğinden, caydırabileceğinden ve hatta değiştirebileceğinden, oda sıcaklığında rutin X-ışını kırınım deneyleri için sağlam bir yöntem oldukça arzu edilir. Bu protokolde kullanılan kristal üzerine kristal cihazı ve beraberindeki donanım ve yazılım, herhangi bir numune manipülasyonu olmadan farklı boyutlardaki protein kristalleri için oda sıcaklığında in situ X-ışını kırınımını sağlamak üzere tasarlanmıştır. Burada cihaz montajı, çip üzerinde kristalizasyon, optik tarama, kristal tanımadan X-ışını çekim planlamasına ve otomatik veri toplamaya kadar önemli adımlar için protokolleri sunuyoruz. Bu platform kristal hasadı veya başka bir numune manipülasyonu gerektirmediğinden, çip üzerinde yetiştirilen yüz ila binlerce protein kristali, programlanabilir ve yüksek verimli bir şekilde bir X-ışını ışınına sokulabilir.

Birkaç temsili veri kümesi yayınlanmıştır Son birkaç yılda 10,12, fotoreseptör proteinleri ve enzimleri de dahil olmak üzere çeşitli protein örneklerinden elde edilen kristalografik sonuçlar ve bilimsel bulgularla birlikte, örneğin, bir bitki UV-B fotoreseptörü UVR8, ışıkla çalışan bir DNA onarım fotoliyaz PhrB10, çok alanlı bir duyusal histidin kinazından yeni bir uzak kırmızı ışık algılama proteini 14 , ligand/ışı...

Bu katkı, kristal üzerinde kristal cihazlarda protein kristalizasyonunun nasıl kurulacağını ve çip üzerinde kristalizasyon platformunu kullanarak oda sıcaklığında otomatik seri veri toplamanın nasıl gerçekleştirileceğini açıklamaktadır.

Oda Sıcaklığında Çip Üzerinde Kristalizasyon ve Büyük Ölçekli Seri Kırınım

Biochemical reactions and biological processes can be best understood by demonstrating how proteins transition among their functional states. Since ...

Bu protokol, x-ışını kırınım verilerinin hatırlanmasında çip benzeri bir cihazda protein kristalleşmesini gösterir. Bu cihaza kristal üzerine kristal denir, çünkü protein kristalleri tek bir kuvars kristali üzerinde büyür. Bu tür cihazlarda protein kristallerinin başarılı bir şekilde büyümesi üzerine, protein kristallerine dokunmadan oda sıcaklığında her cihazdan binlerce kırınım görüntüsü toplanır.Oda sıcaklığında X-ışını kırınımı, birçok konformasyonel durumu içeren protein fonksiyonunu incelemek için çok önemlidir. Bu bilgilendirici protein değişiklikleri veya protein eylemleri dondurulabilir, böylece kriyo-kristalografide tespit edilemez. Bu cihazlar, ışık kaynaklı sinyalizasyon süreçlerini ve redoks değişikliklerini incelemek için kullanılabilir.Yalnızca birkaç cihaz tam ve yedekli veri kümeleri verir. Cihaz ön montajına başlamak için, numune tanımlama için dış halkayı etiketleyin. Proje adını, cihaz numarasını, kristalleşme koşulunu ve tarihi istediğiniz gibi ekleyin.Ardından etiketli halkayı temiz bir yüzeye baş aşağı yerleştirin ve dış halkanın içine bir kuvars gofret yerleştirin. Daha sonra, bir Petri kabına az miktarda mikroskop daldırma yağı dökün ve şimin her iki tarafının da iyi kaplandığından emin olmak için bir şimin yağa batırın. Şimleri temiz bir yüzeye sürterek fazla yağı temizleyin.Ardından yağlı şimleri ilk kuvars gofretin üzerine yerleştirin. Protein çözeltisini ve kristalizasyon tamponunu bir pipet kullanarak ilk kuvars gofret üzerinde karıştırın. Karıştırırken hava kabarcıklarından kaçınmaya çalışın.Kristalizasyon çözeltisinin toplam hacmi, dolgu boyutu ve kalınlığı tarafından belirlenen kristalizasyon odasının maksimum kapasitesini aşmamalıdır. İkinci kuvars gofreti karışık çözeltinin üzerine yerleştirin. Çözüm kendiliğinden yayılacaktır.Ardından, havayı dışarı iterken yağın yayılmasına yardımcı olmak için ikinci kuvars gofrete hafifçe kenardan dokunun. Bir tutma halkasını dış bileziğe vidalayarak cihazı sabitleyin. Gerekirse, bir sıkma aleti kullanın.Hassas kuvars gofretlerin deforme olmasına veya çatlamasına neden olabileceğinden aşırı sıkmadan kaçının. Monte edilen cihazları oda sıcaklığında bir kutuda veya sıcaklık kontrollü bir inkübatörün içinde saklayın. Birkaç saat veya gün sonra, kristalleşme cihazını mikroskop altına yerleştirin ve kristal büyümesini izleyin.Gerekirse, kristalleşme koşullarını makalede açıklandığı gibi optimize edin. Kalibrasyon için, talaş tutucuya ince bir YAG kristali takın, ardından kiriş durdurucuyu takın. Ardından, Insitux yazılımını açın ve cihazın kristalizasyon cihazı ve cihazı için kullanıcı tarafından seçilen bir isim olduğu doğrudan ışının x-ışını floresan görüntülerini almak için belirtilen programı çalıştırın.param, aygıta özgü denetim parametrelerini içeren dosya adıdır. Ardından, yanık görüntüsünün x-ışını floresan görüntüsünün dosya adı olduğu ışın profili uygulama programını çalıştırarak doğrudan x-ışını ışınının kesin konumunu bulun. Optik tarama için, talaş tutucuya bir kristalizasyon cihazı yerleştirin ve bir parmak vidası kullanarak sabitleyin.Daha sonra talaş tutucuyu kinematik bir mekanizma aracılığıyla difraktometrenin çeviri aşamasına monte edin. Protein örneğinin ışık hassasiyetine ve deneyin amacına bağlı olarak, cihazın optik penceresinden mikrograf çekmek için beyaz veya kızılötesi bir ışık kaynağı takın. Kurulum hazır olduğunda, ışın hattında hareket halinde tarama için belirtilen komutu girerek tarama programını çalıştırın.Ardından, döşeme programını, x'in sütunun başlangıç değeri olduğu ve y'nin mikrografların sahte yer değiştirmeleri için başlangıç değeri olduğu bir kullanıcı bilgisayarında çalıştırın. Program, tüm mikrografları bir ila üç mikrometre piksel çözünürlüğünde bir montaja diker. Mikrografları diktikten sonra, kristal bulma programını çalıştırmak için belirtilen komutu girin.Bu program kristal tanıma ve atış planlaması gerçekleştirir ve bu programdaki temel parametreler belirli kristal seçimi ve hedef planlaması sağlar. Işık kaynağını çıkarın ve ışın durağını konumlandırın. Ardından seri kırınım için veri toplama programını çalıştırın.Önerilen komut, planlanan çekimleri önceden programlanmış bir sırayla ziyaret ederek veri toplamayı tetikler. Hedeflenen her kristal ışın konumuna taşınır. Her durakta, x-ışını maruziyeti, planlanan bir zaman gecikmesinde lazer aydınlatmalı veya lazer aydınlatmasız olarak alınır.Çalışmada, buhar difüzyonu ile çip üstü parti arasındaki kristalleşme koşulları karşılaştırılmıştır. Burada çip üzerinde kristalleşme ve doğrudan kuvars cihazlarından toplanan temsili veri kümeleri ile ilgili dört vaka çalışması gösterilmektedir. Dinamik kristalografi deneyleri, karanlıkta 4.352 kristalden ve ışık aydınlatmasından sonra 8.287 kristalden elde edilen verileri karşılaştırarak uzak kırmızı fotoreseptör proteininde ışığın neden olduğu değişiklikleri ortaya çıkardı.In situ seri Laue kırınımından gelen karanlık veri kümesi, daha iyi çözülmüş elektron yoğunlukları ile sonuçlandı ve tüm Z işareti konformasyonunda iki kromozomun güvenli bir şekilde modellenmesini sağladı. Işık kaynaklı fark haritaları, merkezi beta tabakasında, kromoforun pirrol halkaları ile birkaç aromatik kalıntı arasındaki pi-pi istiflemesinin önemini gösteren uyumlu hareketleri ortaya çıkarmıştır. Bu platforma Insiteux denir.Bu platformun benzersiz avantajı, kristalleşme yapıldıktan sonra herhangi bir kristal manipülasyonu yapmak zorunda kalmamasıdır. Protein hareketlerini yakalamak için değişen koşullar altında birçok veri kümesi toplamak gerekir. Ve bu Insitux ile mümkün hale geliyor çünkü oda sıcaklığında binlerce protein kristalinden büyük ölçekli veri toplamayı mümkün kılıyor.Kristalografiyi de içeren bu yeni özellik sayesinde, ışığa duyarlı sistemler cihazın içinde tetiklenebilir ve kristal üzerine kristal cihaz çıkışlara dönüştürülürse ışık inert sistemi incelenebilir.

on-chip-crystallization-large-scale-serial-diffraction-at-room

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Biyokimya

Bu protokolü nasıl imal ve mikrosıvısal cihazlar x-ışını kırınım veri toplama oda sıcaklığında için ayrıntılı olarak anlatılmaktadır. Ayrıca, protein kristalizasyon tarafından dinamik ışık saçılma izlemek açıklar ve nasıl işlemek ve analiz kırınım veri elde.

Mikrosıvısal çip Situ Crystal x-ışını kırınım ve in Situ dinamik ışık saçılma seri kristalografisi için için

Bu makalede, diyaliz yöntemi ve yerinde X-ışını kırınım deneyleri ile çip üzerinde protein kristalizasyonu için geliştirilen mikroakışkan çiplerin imalat protokolü ayrıntılı olarak açıklenmektedir. Mikrofabrikasyon işlemi, yarı geçirilebilir yenilenmiş selüloz diyaliz membranın, çipin iki katmanı arasında herhangi bir moleküler ağırlık kesme ile entegre olmasını mümkün kılar.

In Situ X-ışını Kırınım Çalışmaları için Mikrodiyaliz ile Çip Üzerindeki Proteinlerin Kristalizasyonu

Karşı difüzyon yöntemini kullanarak bir enzimin kristalleşmesini, ıslatarak kristallere bir substratın girmesini ve oda sıcaklığında çipin içindeki kristallerin seri analizi ile enzim:substrat kompleksinin 3D yapısının belirlenmesini sağlayan çok yönlü bir mikroakışkan cihaz tarif edilir.

Çok Yönlü Bir Mikroakışkan Çipte Seri Kristalografi ile Bir Enzim:Substrat Kompleksinin Kristalizasyonu ve Yapısal Belirlenmesi

Harwell'deki Araştırma Kompleksi'ndeki kristalizasyon tesisini kullanarak proteinlerin kristalleştirilmesi için bir protokol sunuyoruz ve ardından Diamond'ın Çok Yönlü Makromoleküler Kristalografi in situ (VMXi) ışın hattındaki plakalar içindeki kristallerden yerinde X-ışını kristalografik veri topluyoruz. Numune gereksinimlerini, kristalizasyon protokollerini ve veri toplama yönergelerini açıklıyoruz.

Harwell ve Beamline VMXi'deki Kristalizasyon Tesisi Kullanılarak Kristalizasyon ve Yerinde Oda Sıcaklığı Veri Toplama, Elmas Işık Kaynağı

X-ışını serbest elektron lazerlerinde ve senkrotron kaynaklarında seri kristalografi için lipidik kübik fazda membran protein mikro kristallerinin hazırlanması ve verilmesi için prosedürleri açıklıyoruz. Bu protokoller aynı zamanda çözünür protein mikro kristallerinin dahil edilmesi ve verilmesi için de uygulanabilir, bu da sıvı enjeksiyona kıyasla numune tüketiminin önemli ölçüde azalmasına yol açar.

Hazırlık ve Seri Femtosecond Kristalografi için lipidik Cubic Faz Protein mikro kristallerinin teslimi

Otomatik sistemler ve ekranlar çok sayıda rutin hazırlanması için protokoller ve nanoliter kristalizasyon damlacıkları buharı difüzyon deneyler için açıklanan ve tartışıldı.

MRC Laboratuvarı moleküler biyolojinin makromoleküllerin kristalizasyon için protokolleri otomatik

Protein mikro kristalleri kullanılarak X-ışını kristalografisi için bir protokol sunulmuştur. Saflaştırmadan sonra ya da selüloda in vivo büyümüş mikrokristalleri analiz eden iki örnek karşılaştırılmıştır.

Protein Kristallerinin Mikrokristalografisi ve<em&gt; Selülozda</emKırınım

Bu iletişim kuralı bir yöntem Caenorhabditis elegans büyük ölçekli ekimi için katı medyada açıklar. Sıvı kültür alternatif, bu protokol parametreleri farklı ölçeklerde plaka tabanlı ekilen almak sağlanır. Bu sonuçlar karşılaştırılabilir sıvı ve katı Medya kültürü arasındaki morfolojik ve metabolik farklar ihmal olarak artırır.

Large-scale tarımı plaka tabanlı Caenorhabditis elegans: diyabet metabolik değişiklikler çalışma için numune hazırlama

Elektron paramagnetic rezonans (EPR) spektroskopisi serbest radikallerin ölçmek için kesin bir yöntemdir. Farklı hücresel kompartmanlarda serbest radikallerin algılanması için seçici spin sonda kullanımı sağlar. Biz tedavi, depolama ve örnekleri EPR ölçümler için aktarma kolaylaştırmak biyolojik örnekler toplamak için pratik ve verimli bir yöntem mevcut.

Elektron Paramagnetic rezonans ortam sıcaklığı ve 77 K biyolojik örneklerde kullanımı

Burada, ortak ilgi bir viroid iskele ve bir bitki RNA içeren bir chimeric RNA ifade ederek Escherichia coli rekombinant RNA büyük miktarlarda üretmek için bir protokol mevcut tRNA ligaz. Ana ürün arıtma homojenliği için kolaylaştırır dairesel bir moleküldür.

Escherichia coli içinde Viroid kaynaklı bir sistemi kullanarak dairesel bir iskele üzerinde rekombinant RNA'ların büyük ölçekli üretim

Öğrenin, çip üzerinde protein kristalleştirme ve oda sıcaklığında büyük ölçekli seri X-ışını kırınımı yöntemini. Kristal-üzerinde-kristal cihazı, binlerce kristalden otomatik veri toplama imkanı sunar.

Oda Sıcaklığında Çip Üzerinde Kristalizasyon ve Büyük Ölçekli Seri Kırınım

Daha fazla video keşfet