Strongyloides Türlerinde Mikroenjeksiyon ile Transgenik ve Nakavt Üretimi

DNA yapılarını Strongyloides'e iletmek için mikroenjeksiyon kullanmak, bu solucanların nasıl geliştiğini, çevrelerinde gezinmeyi ve konakçıları parazite etmeyi incelemek için kullanılabilecek nakavtlar ve transjenikler üretmemizi sağlar. Şimdiye kadar, bu parazitlerde nakavt ve transgenik üretmek için tek başarılı teknik budur. Mikroenjeksiyondan bir gün önce, bir cam Pasteur pipeti kullanarak bir kapak kayması üzerine 180 mikrolitre agaroz çözeltisi ekleyin, ardından agarozu ince bir ped halinde düzleştirmek için hemen üstüne ikinci bir kapak kayması bırakın.

5 ila 10 saniye sonra, ikisini birbirinden kaydırarak üst kapak kaymasını çıkarın ve agar pedinin hangi slaytta olduğunu belirleyin ve yüzü yukarı bakacak şekilde yerleştirin. Ardından, kırık bir kapak kaymasından küçük bir cam parçası seçin ve forseps kullanarak, pedin üst kenarına yakın bir yerde yavaşça agar'a bastırın. Mikroenjeksiyon gününde, iki plastik halkadan yapılmış bir elek olan Baermann tutucuyu, iki kat naylon tuil ağ ile üst üste binen üç laboratuvar dokusu parçasıyla aralarında sabitlenmiş bir elek olarak hizalayın.

Daha sonra fekal-kömür karışımını Baermann tutucuya ekleyin. Daha sonra Baermann tutucuyu fekal-kömür karışımı ile huniye yerleştirin, doku parçalarını fekal-kömür karışımının etrafına katlayın ve dışkı kömürünün çoğunu suya batırmak için yeterli su ekleyin. Ardından, kokuyu içermek ve huniyi gerektiği gibi etiketlemek için huniyi 15 santimetrelik plastik bir Petri kabı kapağıyla doldurun.

Bir ila iki saat sonra, huninin altındaki kauçuk borunun altında 50 mililitrelik bir santrifüj tüpü tutun ve 50 mililitrelik tüpe solucanlar içeren 30 ila 40 mililitre su dağıtmak için alttaki kelepçeleri dikkatlice açın. Sonra. solucanları içeren Baermann suyunun 15 mililitresini 15 mililitrelik bir santrifüj tüpüne aktarın. Tüpü döndürün, süpernatanın 13 mililitresine kadar çıkarın ve solucanları öldürmek için iyotlu bir sıvı atık kabına atın.

Tüm solucanları topladıktan sonra, tüpün altındaki solucan peletini inceleyin. Hiçbir solucan görünmüyorsa, bir ila iki saat bekleyin, ardından Baermann cihazından daha fazla solucan toplayın. Solucanları mümkün olduğunca az su içinde, E.coli HB101 çim ile altı santimetrelik% 2 nematod büyüme orta plakasına aktarın ve bu plakayı mikroenjeksiyon için kaynak plaka olarak kullanın.

Diseksiyon mikroskobu altında, mikroenjeksiyon pedi kapağı üzerindeki cam parçasını, standart bir platin solucanı toplama kullanarak halokarbon yağı ile örtün. Ardından, mikroenjeksiyon pedi kapak kapağını mikroenjeksiyon kapsamına yerleştirin ve yağla kaplı cam parçasını bulun. Cam parçasını, iğneyi kırmak için kullanılan yüzey olarak hizmet etmek için bir kenar iğnenin yönüne dik olacak şekilde hizalayın.

Daha sonra, diseksiyon mikroskobu kullanarak, iğnenin konik şaftta kabarcık veya döküntü olmadığından emin olun, ardından iğneyi basınçlı tutucuya 1 ila 1,5 santimetre sabitleyin. İğnenin ucunu mikroskop görüş alanının merkezine gözle ve düşük büyütme altında yerleştirin, iğnenin ucunu cam parçasının yanına dik olarak görüş alanına yerleştirin. Ardından, daha yüksek büyütmeye geçin ve iğnenin ucunu camın kenarıyla, yakın, ancak dokunmadan hizalayın.

Daha sonra, iğnenin ucunu kırmak ve sıvı akışına izin vermek için, gazdan sürekli basınç uygularken cam parçasının yan tarafındaki iğneye hafifçe dokunun. Sıvı akmaya başladığında, ucun şeklini kontrol edin ve kolayca akan sıvı ile keskin olduğundan emin olun. Sıvı iğneden iyi akarken, mikroenjeksiyon kaydırağını diseksiyon kapsamına taşıyın ve solucanların yerleştirilmesi için agar pedine bir ila iki mikrolitre halokarbon yağı ekleyin.

Fazla yüzey bakterilerini gidermek ve mikroenjeksiyon için tek solucanları seçmek için 20 ila 30 genç yetişkin Strongyloides'i en az beş dakika boyunca bakterisiz% 2 nematod büyüme orta plakasına aktarın. Enjekte ederken plakaya gerektiği kadar solucan ekleyin. Bir solucan kazısında az miktarda halokarbon yağı kullanarak, gonadında bir ila dört yumurta bulunan bir Strongyloides genç yetişkin dişisini bakterisiz plakadan seçin ve solucanı agar pedi üzerinde küçük bir yağ damlasına aktarın.

Solucan seçimini kullanarak, solucanı yavaşça sarılacak ve gonad görünür ve erişimi kolay olacak şekilde konumlandırın. Daha sonra, solucanı mikroenjeksiyon mikroskobu görüş alanına yerleştirin, gonadın iğne ile aynı tarafta olmasını ve iğnenin gonadla hafif bir açıyla temas edecek şekilde konumlandırılmasını sağlayın. Ardından, iğnenin ucunu aynı odak düzleminde solucanın yanına getirin.

Daha sonra, solucanın ortasına yakın gonad kolunu hedefleyerek, bir mikroenjektör kullanarak iğneyi yavaşça gonadın içine yerleştirin. Tüm gonad kolunu DNA çözeltisi ile nazikçe doldurmak için derhal iğneye basınç uygulayın. Yeterli sıvı enjekte edildikten sonra, iğneyi çıkarın ve yaranın kapandığını gözlemleyin.

Prosedürü eğer görülebiliyorsa, gonadın diğer koluyla tekrarlayın. Enjeksiyon tamamlandıktan sonra, iğnenin ucu agar pedi üzerine basınç uygulayarak iğnenin tıkanmadığını hızlı bir şekilde doğrulayın, ardından enjekte edilen solucanla slaytı diseksiyon mikroskobuna aktarın. Enjekte edilen solucanı kurtarmak için, önce solucanın üzerine birkaç damla solucan tamponlu salin yerleştirin ve agar pedinden yüzdürün.

Daha sonra bir solucan üzerinde az miktarda bakteri toplayın ve sıvıdan çıkarmak için solucana yapışkan bakterilerle dokunun. Solucanı yavaşça kurtarma plakasına aktarın. Davranışsal deneyler için, 20 ila 30 larvayı, kalın bir HB101 bakteri çimi ile% 2'lik bir nematod büyüme ortamı plakasına aktarın ve bir floresan disseksiyon mikroskobu altında, ilgilenilen transgeni ifade eden larvaları tanımlayın.

Daha sonra, bir solucan toplama kullanarak, transgenik larvaları seçin ve bunları solucan tamponlu salin içeren küçük bir saat camına yerleştirin. Mikroskopi için, bir tıraş bıçağı kullanarak, solucanların plakadaki yerini kolayca izlemek için 10 santimetrelik bir kemotaksis plakasının plastik tabanına bir ızgara çizin. Daha sonra, solucan tamponlu salin içinde üç mikrolitre larvayı ızgaradaki bir kareye ekleyin ve gerektiği kadar kareyi doldurun.

Daha sonra solucan damlalarına suya 15 ila 20 mikrolitrelik damla% 1 nikotin damlası ekleyin. Dört dakika sonra, solucanlar felç olduğunda, floresan diseksiyon mikroskobu kullanarak onları tarayın. Transgenik Strongyloides stercolaris larvaları ile eksik ve eksiksiz bir act-2 mRFPmars ekspresyon paterni burada gösterilmiştir.

Vücut duvarı kasındaki yamalı ekspresyon, transgen genoma entegre edilmediğinde daha yaygındır. Buna karşılık, vücut duvarı kası boyunca tutarlı ekspresyon genellikle transgenin genoma entegre olduğunu gösterir. Anahtar adım, DNA'nın gonadın içine enjekte edilmesini ve gelişmekte olan yumurtalara dahil edilmesini sağlamak için iğneyi gonadla aynı odak düzleminde konumlandırmaktır.

Bu tekniğin geliştirilmesi, parazitizm mekanizmaları ve konakçı-parazit etkileşimleri hakkında yeni bilgiler sağlayan parazitik nematodlarda gen fonksiyonunu incelemeyi mümkün kılmıştır.