Odaklanmış İyon Işını Taramalı Elektron Mikroskobu Verilerini Kullanarak İnce Hücre Altı Nöronal Yapıların 3D Rekonstrüksiyonu ve Analizi

Özet

Kullanıcı dostu açık kaynaklı yazılım paketlerini kullanarak odaklanmış iyon ışını taramalı elektron mikroskobu görüntü hacimlerinde ince hücre altı nöronal süreçleri tanımlamak, görselleştirmek ve ölçmek için esnek bir metodolojik boru hattı.

Özet

Taramalı elektron mikroskobu teknolojilerindeki son gelişmeler artık ultra ince hücre altı süreçlerin hızlı üç boyutlu (3D) analizine izin vermektedir. Burada, diğer nöronların presinaptik butonlara ('spinüller' olarak adlandırılır) çıkıntı yapanlar gibi ince nöronal süreçleri tanımlamak, görselleştirmek ve analiz etmek için metodolojik bir boru hattı sunulmaktadır. Ücretsiz olarak kullanılabilen yazılım paketlerini kullanan bu protokol, odaklanmış iyon ışını taramalı elektron mikroskobu (FIB-SEM) görüntü hacimleri içinde morfolojik kriterleri kullanarak ortak nöronal hücre altı yapıların tanımlanması için bir karar ağacının nasıl kullanılacağını gösterir ve presinaptik butonlara çıkıntı yapan çeşitli spinüllerin tanımlanmasına özellikle dikkat edilir. Özellikle, bu protokol, bu ince hücre altı projeksiyonların, ana nöritlerinin ve postsinaptik ortaklarının 3D rekonstrüksiyonlarını üretmek için nöronal sinapslar içindeki spinüllerin nasıl izleneceğini açıklar. Ek olarak, protokol, FIB-SEM verilerini analiz etmek için ücretsiz olarak kullanılabilen açık kaynaklı yazılım programlarının bir listesini içerir ve görselleştirme ve yayınlama için 3D rekonstrüksiyonları iyileştirmeye yönelik ipuçları (örneğin, yumuşatma, aydınlatma) sunar. Bu uyarlanabilir protokol, FIB-SEM görüntü hacimleri içindeki hücre altı yapıların hızlı nano ölçekli analizine bir giriş noktası sunar.

Giriş

Nanometre inceliğinde hücre altı bileşenlerin yapı-fonksiyon ilişkilerine ilişkin araştırmalar genellikle 3D görselleştirme ve analizden yararlanır¹. Bununla birlikte, seri kesit iletim elektron mikroskobu çalışmaları, yüzlerce ila binlerce ≥40 nm seri ultra ince kesiti kesmek ve hizalamak için bir elmas bıçak kullanma gerekliliği ile zamansal ve mekansal olarak kısıtlanmıştır. Bu kısıtlamalar, ince (<40 nm çapında) hücre altı yapıları örnekleme ve etkili bir şekilde analiz etme yeteneğini sınırlamıştır ve ultra ince seri kesit almada yetkin olma gerekliliği, 3D yapısal analizlerin^{uygulanmasın....}

Protokol

1. Görüntü hacmi verileri ve hücre altı nesne boyutu: dikkat edilmesi gerekenler ve kayıt

1. İlgilenilen hücre altı nesneleri içeren ilgi alanının kaliteli bir FIB-SEM görüntü hacmini elde edin.
   NOT: Bu protokol, geç ergen gelincik birincil görsel korteksinden (24.2 x 16.2 x 2.4 μm, 4 nm izotropik vokseller) bir FIB-SEM görüntü hacminin segmentlerini ve yetişkin sıçan CA1 hipokampusundan (10.2 x 7.7 x 5.3 μm; 5 nm izotropik vokseller) serbestçe erişilebilir bir FIB-SEM hacmini kullanır Knott laboratuvarı (https://www.epfl.ch/labs/cvlab/data/data-em/) tarafından kullanıma sunulmuştur. FIB-SEM görüntüleme koşulları altında u....

Sonuçlar

Gelincik primer görsel korteksindeki uyarıcı presinaptik bouton popülasyonu içindeki sinaptik spinüllerin yüzdesinin ölçülmesi
Nöritlerden uyarıcı presinaptik butonlara spinul benzeri çıkıntılar onlarca yıldır gözlenmesine rağmen^19,26, sinaptik fonksiyon için potansiyel önemleri belirsizliğini korumuştur. Bu deneyler, gelişimsel kilometre taşlarıyla ilişkili olarak spinüllerin sinaptik fonksiyon için potansiyel önemini belirlemek için gelincik.......

Tartışma

Bu FIB-SEM görüntü hacmi analiz hattı, güvenilir 3D rekonstrüksiyonlar ve ince hücre altı yapıların kantitatif ölçümlerini üretebilir. Derin sinir ağı ve segmentasyon algoritmalarını kullanan mevcut yarı otomatik teknikler, büyük görüntü hacimlerinde^nispeten yüksek zar kontrastına sahip hücresel yapıların yeniden yapılandırılmasında hızı ve verimliliği artırabilirken3, birçok alt hücre yapısının (örneğin, spinüller, düz endoplazmik retiküller, endozomlar) alt zar .......

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
Fiji (ImageJ)			https://imagej.net/software/fiji/downloads
Blender Blender	Vakfı'nı

https://synapseweb.clm.utexas.edu/software-0 Yeniden Yapılandırın https:/www.blender.org