Name: Uzun Süreli Kriyoprezervasyonda Yağ Dokusundan Mezenkimal Kök Hücre Elde Etme Tekniği ve Stromal Vasküler Fraksiyon Karakterizasyonu (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-12-30T16:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 57 s
Description: Öğrenin, yağ dokusundan mezenkimal kök hücre izolasyonunu ve uzun süreli kriyoprezervasyon sonrası yüksek canlı hücre verimliliğini artıran geliştirilmiş protokolü. Bu yöntem rejeneratif tıp ve hücre tedavisi uygulamaları için güvenilir bir kaynak sağlar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Katılmak için gönüllü olan hastalara ve São Paulo Hastanesi'nin tıbbi ve hemşirelik personeline teşekkür ederiz. Bu çalışma Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) ve Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq), Brezilya tarafından desteklenmiştir.

Bu çalışma, Helsinki Deklarasyonu'na (2004) göre hastalardan yazılı bilgilendirilmiş onam alındıktan sonra gerçekleştirilen UNIFESP Etik Kurulu (protokol numarası: 0029/2015 CAAE: 40846215.0.0000.5505) tarafından onaylanmıştır. Bu çalışmanın örneklemi, Universidade Federal de São Paulo (UNIFESP) Plastik Cerrahi Bölümü'nde, gebelik sonrası deri fazlalığı nedeniyle estetik abdominoplasti uygulanan 33-50 yaş (ortalama yaş 41.5) ve ortalama başlangıç vücut kitle indeksi (VKİ) 24.54 (22.32-26.77 arasında değişen) dokuz kadın hastadan oluşmaktadır. Brezilya. Önyargıyı azaltmak için, hastalar cinsiyet, yaş ve VKİ dikkate alınarak homojen bir grup olarak seçildi. Bu çalışma sırasında kullanılan ve/veya analiz edilen veri kümeleri, makul talep üzerine sorumlu yazardan temin edilebilir.
1. Lipoaspirat toplanması
NOT: Bu adımın ameliyat merkezinde yapılması gerekmektedir.
<ol><li>Cilt hazırlığı ve asepsis için% 4 klorheksidin glukonat kullanın ( Malzeme Tablosuna bakınız).<ol><li>2 mm'lik bir deri altı cilt insizyonu yapın (sub-dermis ve aponevroz arasında). 26 mm 3 G üç delikli ve 3 mm kalibreli bir Klein kanülü ve toplam 500 mL hacimli bir adrenalin çözeltisini (1 mg / mL) enjekte etmek için bir şırınga yerleştirin (bkz.</li>
	</ol></li>
	<li>60 mL'lik bir şırıngayı 26 mm 3 G üç delikli ve 3 mm kalibreli liposuction kanülüne bağlayın ve vakum oluşturmak için pistonu kilitleyerek cilt kesisinden geçirin.<ol><li>İtme ve çekme hareketleri yapın, böylece oluşturulan vakum ile lipoaspirat 60 mL şırıngada kalır.</li>
	</ol></li>
	<li>Valfli steril bir konektör kullanarak, toplanan lipoaspiratın 100 mL'sini 150 mL'lik bir polivinil klorür transfer torbasına aktarın (bkz.<ol><li>Transfer torbasını oda sıcaklığında (~25 °C) bir polistiren kutuya koyun ve hemen laboratuvara götürün. Doku işlemeye başlamak için 30 dakikadan fazla sürmeyin.</li>
	</ol></li>
</ol>2. Lipoaspiratın işlenmesi
NOT: Bu adım laboratuvarda gerçekleştirilmelidir.
<ol><li>İlk olarak, torbayı tartın, sıcaklığı dijital temassız kızılötesi klinik termometre ile ölçün ve yağlı tabakaların (kabarcıkların) çökelmesi ve ilgili hücreleri içeren doku ayrımı için torbayı laminer akış odasının içinde 5 dakika dinlendirin.<ol><li>Bir dizi doku yıkama işlemi gerçekleştirin. İlk yıkama: Transfer torbasına kalsiyum (1x) içeren 100 mL DPBS enjekte edin ve ellerinizle karıştırın.</li>
		<li>5 dakika bekletin ve çökelen bazal sıvının çoğunu çıkarın.</li>
		<li>Bazal sıvıyı, torba adaptörüne bağlı 60 mL'lik bir şırınga ile atın. Bu işlem iki kez tekrarlanmalıdır.</li>
	</ol></li>
	<li>Torbaya 100 mL sindirim çözeltisi ekleyin (93 mL kalsiyum içermeyen DPBS + 60 μL kalsiyum klorür (1 g / L) + 7 mL% 0.075 steril kollajenaz, Malzeme Tablosuna bakınız) ve yavaş karıştırma altında 30 dakika boyunca 37 ° C'de bırakın.</li>
	<li>Torbanın tüm içeriğini 50 mL'lik dört konik tüpe aktarın ve 10 dakika boyunca 22 ° C'de 400 x g'de santrifüj yapın.<ol><li>Süpernatantı çıkarın ve atın ve hücre peletine% 20 FBS (Fetal sığır serumu) ile desteklenmiş 5 mL Dulbecco'nun modifiye Eagle's medium (DMEM) düşük glikozunu ekleyin (Şekil 1).</li>
	</ol></li>
</ol>3. SVF hücrelerinin sayımı
<ol><li>Damıtılmış suda% 0.05'te 10 μL tripan mavisi taze bir çözeltiyi, 5 dakika boyunca 10 μL hücresel süspansiyonla karıştırın.</li>
	<li>Neubauer hücre sayma odası32'deki canlı hücreleri, ters çevrilmiş bir ışık mikroskobu kullanarak ( bkz.</li>
	<li>Hücre peletini kriyoprotektif bir ortamda (5 mL FBS + Dimetil Sülfoksit - DMSO'nun% 10'u) 1 x 106 hücre / mL konsantrasyonda yeniden askıya alın.</li>
	<li>Bu karışımın 1 mL'sini kriyovyallere yerleştirin. Soğutma hızı (1 °C/dk ila -80 °C) olan bir dondurma kabı kullanın ( Malzeme Tablosuna bakınız).<ol><li>1 yıl boyunca -80 ° C'de saklayın.</li>
		<li>Bu süreden sonra, sıvı azot buharı fazına (-165 ° C) batırılmış standart kaset kutularında saklayın.</li>
	</ol></li>
</ol>4. Hücrelerin çözülme süreci
<ol><li>Şişeleri sıvı azottan çıkarın ve hemen 37 °C su banyosuna 1 dakika boyunca yerleştirin.</li>
	<li>SVF hücrelerini, 37 ° C'de önceden ısıtılmış 4 mL DMEM (% 20 FBS ile desteklenmiş düşük glikoz) içeren konik bir tüpe yerleştirin.</li>
	<li>5 dakika boyunca 22 ° C'de 400 x g'de santrifüj.</li>
	<li>Süpernatantı çıkarın ve 1 mL DMEM (düşük glikoz) +% 10 FBS ekleyin. Aşağıdaki adımları izleyerek immünofenotipleme yapın.</li>
</ol>5. Akım sitometri tekniği (immünofenotipli çoklu etiketleme)
<ol><li>Beş sitometri tüpüne (her biri 200 μL) 1 mL hücre peleti (1.000 hücre / μL konsantrasyonu) yerleştirin.</li>
	<li>5 dakika boyunca 22 °C'de 400 x g'da santrifüj yapın ve süpernatantı bir pipetle atın.</li>
	<li>300 μL Fosfat Tamponlu Tuzlu Sin (PBS) (10x) ekleyin, 22 ° C'de 400 x g'de santrifüj yapın ve süpernatantı bir pipetle atın.</li>
	<li>Farklı işaretleyici kombinasyonları için aşağıdaki gibi beş tüp hazırlayın: CD11B/5 μL CD19/20 μL CD45; CD73/20 μL CD90/5 μL CD105/CD45 μL; 20 μL CD34/5 μL HLA-DR/CD45 20 μL; Hücre canlılığı testi-5 μL floresan reaktif boya. (bakınız Malzeme Tablosu) ve negatif kontrol olarak lekesiz hücrelere ve PBS'ye sahip bir tüp. Bir girdapta homojenize edin ve 30 dakika boyunca 4 ° C'de inkübe edin.<ol><li>5 dakika boyunca 22 °C'de 400 x g'de santrifüj yapın, süpernatantı bir pipetle atın, 500 μL PBS (10x) ekleyin ve hücre sıralamaya devam edin. NOT: Dört renk ve beş parametreden oluşan Flow Cytometer'de ayarlanan antikor başına beş bin olay elde edilir ve CellQuest yazılımı ile analiz edilir.</li>
	</ol></li>
</ol>6. Pasajın tohumlanması 1 (P1)
<ol><li>75 cm2 kültür şişesindetohum 2 x 10 5 hücre.</li>
	<li>12 mL DMEM düşük glikoz + FBS'nin% 20'si +% 10 antibiyotik / antimikotik (10.000 ünite penisilin, 10 mg streptomisin ve mL başına 25 μg amfoterisin B ile, 0.1 μm) ekleyin.</li>
	<li>Hücreler% 80-90 arasında birleştiğinde, 3 dakika boyunca 2 mL% 0.25 EDTA-tripsin ile yapışkan hücrelerin tripsinizasyonunu gerçekleştirin.</li>
	<li>Hücreleri tekrar sayın (adım 3'te belirtildiği gibi).</li>
	<li>İmmünofenotiplemeyi tekrar yapın (adım 5'te belirtildiği gibi).</li>
</ol>7. İstatistiksel analiz
<ol><li>Aşağıda belirtildiği gibi, aşağıdaki değişkenler ile P < 0.05 arasındaki ilişkinin gücünü ölçmek için Spearman'ın Rho Hesap Makinesi 33'ünü kullanın.<ol><li>SVF hücresel verimini ve SVF'nin ilk pasajda (P1) kültürde kaldığı gün sayısını %80-%90 birleşime kadar (P1'e kadar olan günler) seçin.</li>
		<li>P1'e gitmeden önce ve sonra SVF hücresel verimini seçin.</li>
		<li>P1'e gitmeden önce P1'e kadar olan günleri ve hücresel verimi göz önünde bulundurun.</li>
		<li>Doğrulanmış ADSC'nin ortalama yüzdesi ile SVF hücresel verimini seçin.</li>
		<li>P1'e gitmeden önce doğrulanmış ADSC yüzdesini ve hücresel verimi hesaplayın.</li>
		<li>BMI ve SVF hücresel verimini belirleyin.</li>
	</ol></li>
</ol>8. Farklılaşma testi
<ol><li>Bir farklılaştırma kiti protokolünü izleyerek farklılaştırma testini gerçekleştirin (bkz. Şekil 4 , Durum 1'in sonuçlarını göstermektedir.</li>
</ol>

Yazarlar rakip finansal çıkarlar olmadığını beyan ederler.

İzolasyon verimi Hücresel tedavide sıklıkla gerekli olan kriyoprezervasyon işleminin, bazen %50'den fazla olan önemli hücre kaybına neden olduğu iyi bilinmektedir29,30,35. Bu nedenle, izolasyonda yüksek başlangıç hücresel verimi elde etmek için teknik bir gelişme esastır. Lipoaspiratın toplama yöntemi ve hücrelerin izolasyon yöntemi, hücrelerin uzun vadeli kültürünü ve manipülasyonunu hesaba katarken, daha fa...

İnsan mezenkimal kök hücreleri hem temel hem de uygulamalı araştırmalarda avantajlıdır. Bu yetişkin hücre tipinin kullanımı, embriyonik veya diğer hücrelerin kullanımına kıyasla etik sorunları aşmaktadır - otolog doku rejenerasyon mühendisliği vehücre terapisinde en umut verici çalışma alanlarından biri olan 1, neoplastik alan, dejeneratif hastalıkların tedavisi ve rekonstrüktif cerrahi alanındaki terapötik uygulamalar 2,3,4, 5. Daha önce yağ dokusunun stromal vasküler hücre fraksiyonunda mezenkimal multipotent ve pluripotent kök hücrelerin bol miktarda bulunduğu bildirilmiştir 6,7. Bu ADSC, hücre tedavisi ve transplantasyon / infüzyonda kullanım için mükemmel adaylar olarak kabul edilir, çünkü ex vivo genişleme için güçlü bir kapasiteye sahip önemli sayıda hücre, minimal invaziv bir prosedürden yüksek verimle kolayca elde edilebilir 5,8.
Ayrıca, yağ dokusunun mezenkimal kök hücre sağlama kapasitesinin diğer iki kaynaktan (kemik iliği ve göbek kordonu dokusu) daha fazla olduğu gösterilmiştir9. Kötü immünojenik olmasının yanı sıra, konakçı dokuya entegre olma ve çevre dokularla etkileşime girme yeteneğinin yüksek olmasının yanı sıra 4,10, ADSC, uygunkültür koşulları altında kondrojenik, osteojenik ve miyojenik farklılaşma raporları ile hücre hatlarına ve pankreas, hepatositler gibi hücrelere çok güçlü bir farklılaşma kapasitesine sahiptir. ve nörojenik hücreler14,15,16.
Bilimsel topluluk, mezenkimal kök hücrelerin immünomodülatör etkisinin, hücre tedavisi içinfarklılaşma özelliklerinden 17,18,19 daha uygun bir etki mekanizması olduğu konusunda hemfikirdir. ADSC kullanımının en önemli yararlarından biri, çeşitli hastalıklar için alternatif bir tedavi haline gelen otolog infüzyon veya aşılama olasılığıdır. Rejeneratif tıp için, ADSC karaciğer hasarı, kalp kasının rekonstrüksiyonu, sinir dokusunun yenilenmesi, iskelet kası fonksiyonunun iyileştirilmesi, kemik rejenerasyonu, kanser tedavisi ve diyabet tedavisi20,21 vakalarında zaten kullanılmıştır.
Bu tarihe kadar, Amerika Birleşik Devletleri Ulusal Sağlık Enstitüleri 22'nin web sitesinde listelenen ADSC'nin potansiyelinin değerlendirilmesi için263 kayıtlı klinik çalışma bulunmaktadır. Yağ dokusunun toplanması için farklı protokoller oluşturulmuştur, ancak literatürde ADSK'yi klinik kullanım için izole etmek için standartlaştırılmış bir yöntem hakkında fikir birliği yoktur23,24. Ameliyat sırasında ve sonrasında lipoaspirat işleme yöntemleri, hücre canlılığını, nihai hücresel verimi25 ve ADSC popülasyonunun kalitesini20'yi doğrudan etkileyebilir. Cerrahi ön tedavi ile ilgili olarak, hangi cerrahi ön tedavi tekniğinin izolasyondan sonra daha anlamlı sayıda canlı hücre verdiği veya yağ dokusuna enjekte edilen anestezik solüsyonun hücre verimini ve fonksiyonlarını etkileyip etkilemediği iyi belirlenmemiştir26. Benzer şekilde, yağ hücreleri elde etme teknikleri arasındaki fark, canlı ADSC 20 sayısında%70'lik bir azalmaya neden olabilir. Literatüre göre, ultrason da dahil olmak üzere yüksek canlılığa sahip hücre popülasyonlarını elde etmek için mekanik tedavilerden kaçınılmalıdır, çünkü bunlar yağ dokusunu parçalayabilir20. Bununla birlikte, şırıngalarla manuel yağ aspirasyon yöntemi daha az zararlıdır, daha az hücre yıkımına neden olur, tümesan liposuction en iyi kalitede26 ile önemli sayıda hücre verir.
Bu teknik, liposuction bölgesine enjekte edilen lidokain ve epinefrin içeren bir salin çözeltisi kullanır. Enjekte edilen her 3 mL çözelti hacmi için 1 mL aspire edilir. Bu çalışmada, enjekte edilen her 1 mL adrenalin ve salin çözeltisi için 0.2 mL yağ dokusunun aspire edildiği ıslak liposuction tekniği uygulanmıştır. Sindirim enzimlerinin, özellikle kollajenazın kullanımı, ADSC'yi izole etme işlemi için yaygındır.
Laboratuvardaki ilk izolasyon adımından sonra, son pelet stromal vasküler fraksiyon (SVF) olarak adlandırılır. Endotel öncü hücreleri, endotel hücreleri, makrofajlar, düz kas hücreleri, lenfositler, perisitler, pre-adipositler ve adezyon yeteneğine sahip ADSC'ler dahil olmak üzere farklı hücre tipleri27 içerir. Son izolasyon in vitro kültürlerden tamamlandıktan sonra, plastiğe yapışmayan hücreler orta değişimlerde elimine edilir. Sekiz haftalık genişleme, orta değişiklikler ve pasajlardan sonra, ADSC'ler şişe20'deki hücre popülasyonunun çoğunu temsil eder. Gelecekteki olası bir tedavi için izole adipoz türevi kök hücrelerin kullanılmasının en önemli avantajlarından biri kriyoprezervasyon olasılığıdır. Kriyokorunmuş lipoaspiratın, 6 haftalık donma28'den sonra bile SVF hücrelerinin potansiyel bir kaynağı olduğu, 2 yıllık kriyoprezervasyon29'dan sonra bile biyolojik aktiviteye sahip olduğu ve kültür30'da büyüme ve farklılaşma kabiliyetinin tam olduğu gösterilmiştir. Bununla birlikte, çözülme işlemi sırasında, hücrelerin önemli bir yüzdesi genellikle31 oranında kaybolur. Bu nedenle, lipoaspirat çıkarma işlemi ve aşağıdaki hücre izolasyon yöntemleri en yüksek hücre verimini sağlamalıdır.
Bu çalışma, ADSC'yi toplamak ve izole etmek için daha hızlı bir metodolojiyi açıklamakta, hücresel terapötiklerin daha iyi verimliliği için yüksek hücresel verim ve canlılık göstermektedir. Ayrıca, bu gelişmiş tekniğin uzun süreli SVF kriyoprezervasyonundan sonraki etkisi değerlendirildi.

<table><tbody><tr><td>1.8 mL kriyovial</td><td>Nunc Thermo Fisher Scientific</td><td>340711</td><td></td></tr><tr><td>150 mL polivinil klorür transfer torbası</td><td>JP FARMA</td><td>80146150059</td><td></td></tr><tr><td>%2 Alizarin Red S Solüsyonu, pH 4.2</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A5533</td><td></td></tr><tr><td>Adrenalin (1 mg/mL)</td><td>Hipolabor</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>Alcian Blue solüsyonu</td><td>Sigma Aldrich</td><td>1,01,647</td><td></td></tr><tr><td>Antibiyotik-Antimikotik 100x</td><td>Gibco</td><td>15240062</td><td></td></tr><tr><td>BD FACSCalibur Akış Sitometresi BD CellQues Pro Analizi BD</td><td>BioSciences</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>Kalsiyum klorür% 10</td> <td>Merck</td><td>102379</td><td></td></tr><tr><td>Klorheksidin glukonat% 4</td> <td>VIC PHARMA</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>Kollajenaz, Tip I, toz</td><td>Gibco</td><td>17018029</td><td></td></tr><tr><td>DMEM (Dulbecco'nun modifiye edilmiş Eagle's medium)</td><td>Gibco</td><td>11966025</td><td></td></tr><tr><td>DPBS kalsiyum içermez, magnezyum içermez (Dulbecco'nun Fosfat Tamponlu Salin Gibco Hücre Terapi Sistemleri)</td><td>Gibco</td><td>A1285801</td><td></td></tr><tr><td>Kalsiyumlu DPBS (Dulbecco'nun Fosfat Tamponlu Salin Gibco Hücre Tedavi Sistemleri)</td><td>Gibco</td><td>A1285601</td><td></td></tr><tr><td>Fetal sığır serumu</td><td>Gibco</td><td>10500056</td><td></td></tr><tr><td>Formaldehit %4</td> <td>Sigma Aldrich</td><td>1,00,496</td><td></td></tr><tr><td>Ters ışık mikroskobu</td><td>Nikon Eclipse TS100</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>Canlı ve Ölü Hücre</td> Testi <td>Thermofisher</td><td>01-3333-41 | 01-3333-42</td><td></td></tr><tr><td>Monoklonal antikor: CD105</td><td>BD BioSciences</td><td>745927</td><td></td></tr><tr><td>Monoklonal antikor: CD11B</td><td>BD BioSciences</td><td>746004</td><td></td></tr><tr><td>Monoklonal antikor: CD19</td><td>BD BioSciences</td><td>745907</td><td></td></tr><tr><td>Monoklonal antikor: CD34</td><td>BD BioSciences</td><td>747822</td><td></td></tr><tr><td>Monoklonal antikor: CD45</td><td>DAKO</td><td>M0701</td><td></td></tr><tr><td>Monoklonal antikor: CD73</td><td>BD BioSciences</td><td>746000</td><td></td></tr><tr><td>Monoklonal antikor: CD90</td><td>BD BioSciences</td><td>553011</td><td></td></tr><tr><td>Monoklonal antikor: HLA-DR</td><td>BD BioSciences</td><td>340827</td><td></td></tr><tr><td>Mr. Frosty Dondurma Kabı</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>5100-0001</td><td></td></tr><tr><td>PBS (fosfat tamponlu tuzlu su) 1x pH 7.4</td><td>Gibco</td><td>&nbsp; </td><td></td>10010023</tr><tr><td>StemPro Adipogenez Farklılaşma Kiti</td><td>Gibco</td><td>A1007001</td><td></td></tr><tr><td>StemPro Kondrogenez Farklılaşma Kiti</td><td>Gibco</td><td>A1007101</td><td></td></tr><tr><td>StemPro Osteogenez Farklılaşma Kiti</td><td>Gibco</td><td>A1007201</td><td></td></tr><tr><td>İğne enjeksiyon bölgesi ile tek sivri uçlu steril konektör</td><td>Origen Biyomedikal Bağlayıcı, ABD</td><td>NA</td><td>Kod işareti: IBS</td></tr><tr><td>Tripan mavisi çözeltisi% 0.4</td> <td>Sigma Aldrich</td><td>93595</td><td></td></tr><tr><td>Tripsin-EDTA% 0.25 1x, fenol kırmızısı</td><td>Gibco</td><td>25200056</td><td></td></tr></tbody></table>

uzun süreli kriyoprezervasyonda yağ dokusundan mezenkimal kök hücre elde etme tekniği ve stromal vasküler fraksiyon karakterizasyonu

Technique for Obtaining Mesenchymal Stem Cell from Adipose Tissue and Stromal Vascular Fraction Characterization in Long-Term Cryopreservation

Yağ dokusundan elde edilen insan mezenkimal kök hücreleri, uygun özellikler gösterdikleri ve rejeneratif klinik uygulamalar için erişilebilir bir kaynak oldukları için giderek daha çekici hale gelmiştir. Adipoz türevi kök hücreleri elde etmek için farklı protokoller kullanılmıştır. Bu makalede, daha önemli miktarda ADSC elde etmek için geliştirilmiş bir zaman kazandıran protokolün farklı adımları anlatılmakta ve kültür genişlemesi için canlı hücreler elde etmek üzere ADSC'nin nasıl kriyoproteksiyon ve çözüleceği gösterilmektedir. Daha sonra elektif abdominoplasti uygulanan dokuz hastanın karın bölgesinden 26 cm üç delikli ve 3 mm kalibreli şırınga liposuction kullanılarak yüz mililitre lipoaspirat toplandı. Kök hücre izolasyonu, Dulbecco'nun kalsiyum ve kollajenaz kullanımı ile desteklenen Fosfat Tamponlu Salin (DPBS) çözeltisi ile bir dizi yıkama ile gerçekleştirildi. Stromal Vasküler Fraksiyon (SVF) hücreleri kriyoprezerve edildi ve canlılıkları immünofenotipleme ile kontrol edildi. SVF hücresel verimi 15.7 x 105 hücre/mL idi ve 6.1-26.2 hücre/mL arasında değişiyordu. Yapışkan SVF hücreleri, ortalama 7.5 (±4.5) gün sonra birleşime ulaştı ve ortalama hücresel verim 12.3 (± 5.7) x 105 hücre / mL'dir. Çözülmüş SVF'nin 8 ay, 1 yıl ve 2 yıl sonra yaşayabilirliği %23,06-%72,34 arasında değişmekte olup, ortalama %47,7 (±24,64) arasında değişmekte olup, en düşük canlılık iki yıllık donma vakaları ile ilişkilidir. Daha kısa bir kollajenaz sindirimi süresi ile yağ çökeltmesi için kalsiyum ve torba dinlenme süreleri ile desteklenen DPBS çözeltisinin kullanılması, kök hücre nihai hücresel veriminin artmasına neden olmuştur. Yüksek canlı kök hücre verimi elde etmek için ayrıntılı prosedür, zaman ve hücresel verim açısından önceki çalışmalardan elde edilen tekniklerden daha etkiliydi. Uzun bir kriyoprezervasyon döneminden sonra bile, SVF'de canlı ADSC hücreleri bulundu.

İncelenen dokuz bireyin yaşları, kiloları, boyları ve VKİ'leri dahil olmak üzere karakterizasyonu Tablo 1'de gösterilmiştir.
Başlangıçta sunulan hücresel verime göre, kültürde aşılanan hücre hacminin 75cm2 kültür şişesinin kapasitesine mümkün olduğunca yakın olduğu hesaplanmıştır. Her durumda tohumlanan numune hacmi Tablo 2'de<st...

Mevcut protokol, literatüre kıyasla zaman kazanımı ile muazzam bir hücresel verim ile sonuçlanan ADSC izolasyonu için geliştirilmiş bir metodolojiyi açıklamaktadır. Bu çalışma aynı zamanda uzun süreli kriyoprezervasyondan sonra nispeten çok sayıda canlı hücre elde etmek için basit bir yöntem sunmaktadır.

Uzun Süreli Kriyoprezervasyonda Yağ Dokusundan Mezenkimal Kök Hücre Elde Etme Tekniği ve Stromal Vasküler Fraksiyon Karakterizasyonu

Human mesenchymal stem cells derived from adipose tissue have become increasingly attractive as they show appropriate features and are an accessible ...

Burada, pluripotent mezenkimal hücrelerin infüzyonu gibi terapötik adımların kullanımı için iyi ve uygulanabilir hücrelerin elde edilmesi ve korunması için protokolü gösterdik. Bunun temel avantajı, bu tekniği kullanarak, toplanan dokudan hücrelerin izolasyon adımında kazanılan zamana karşı canlı hücre hacmini elde edebilmemizdir. Bu teknik, heterojenik ilaç ve hücre tedavisinin uygulandığı tüm hastalıklara veya koşullara genişletilebilir.Bu yöntem, uzun süreli hücre kültürlerinin teşvik edilebileceği ilaç testi gibi alanlarda sitogenomik stabilite testine de uygulanabilir. Canlı hücreleri manipüle ederken, sakin ve kendinden emin olun. Sepsis ile aşırı dikkatli olun ve herhangi bir sıkıntıyı gözlemlemek ve iyi kararlar vermek için bir bilim adamının gözleriyle sürekli uyanık olun.Torbayı tartarak ve sıcaklığı dijital temassız kızılötesi klinik termometre ile ölçerek başlayın. Yağlı tabakaları çökeltmek ve hücreleri içeren dokuyu ayırmak için torbayı laminer akış odasının içinde beş dakika bekletin. Transfer torbasına kalsiyum içeren 100 mililitre DPBS enjekte edin ve ellerinizle karıştırın.Beş dakika bekletin. Ardından, çökelen bazal sıvının çoğunu atmak için torba adaptörüne bağlı 60 mililitrelik bir şırınga kullanın. Bu işlemi iki kez tekrarlayın.Torbaya 100 mililitre sindirim çözeltisi ekleyin ve yavaş karıştırma altında 30 dakika boyunca 37 santigrat derecede bırakın. Daha sonra torbanın tüm içeriğini dört adet 50 mililitrelik konik tüpe aktarın ve 22 santigrat derecede 10 dakika boyunca 400G'de santrifüj yapın. Süpernatantı atın ve hücre peletine% 20 fetal sığır serumu ile desteklenmiş 5 mililitre DMEM düşük glikoz ekleyin.Damıtılmış suda% 0.05'te 10 mikrolitre tripan mavisinden oluşan taze bir çözeltiyi, beş dakika boyunca 10 mikrolitre hücresel süspansiyonla karıştırın. 20X büyütmede ters çevrilmiş bir ışık mikroskobu kullanın ve Neubauer hücre sayma odasındaki canlı hücreleri sayın. Hücre peletini kriyo-koruyucu bir ortamda, mililitre başına 1 milyon hücre konsantrasyonunda askıya alın.Daha sonra bu karışımın 1 mililitresini kriyo şişelere yerleştirin. Dakikada 1 santigrat derece soğutma hızına sahip bir dondurma kabı kullanın ve bir yıl boyunca 80 santigrat derecede saklayın. Bir yıl sonra, sıvı azot buharı fazına batırılmış standart kaset kutularında saklayın.Dokuz hastadan alınan prosedürün farklı basamaklarından elde edilen veriler bu tabloda sunulmuştur. İlk hücresel verime göre, her örnek için değişken bir hücre hacmi belirlendi. Daha yüksek hücresel verime sahip 1 mililitre numune, orta hücresel verime sahip numuneler için 1,1 mililitre ve daha düşük hücresel verime sahip numuneler için 2 mililitre.Birinci geçişten önceki hücresel verim, tripsinizasyondan önceki aynı birleşme gözlendiğinde bile geniş ölçüde değişmiştir. Bu nedenle, burada hücreler katmanlar halinde büyümüş olabilir. Temsili görüntü, ışık mikroskobunda izolasyondan sonraki ilk pasajda plastiğe yapışan mezenkimal ADSC'leri göstermektedir.Hücreler plastik ve fibroblast benzeri morfolojiye yapışma gösterir. Neubauer odasında tripan mavisi tahlilinde sayılan canlı hücreler burada gösterilmiştir. Bu tabloda altı hastanın akım sitometrisi verileri sunulmuştur.Bu CD45 negatif hücrelerden, kök hücre belirteçlerinin farklı kombinasyonlarına sahip ADSC'lerin yüzdesi belirlendi. Temsili görüntüler, sekiz aylık kriyo-korumadan sonra dokuzuncu vakanın SVF'sinde kök hücre ile ilişkili belirteçler için pozitif olan hücrelerin alt popülasyonunu göstermektedir. Burada, R1, ileri dağılıma karşı yan dağılım grafiğinde analiz edilen toplam hücresel bölgedir.Ve R2, CD45 negatif bölgesidir. CD73, CD90 ve CD105 popülasyonları bu bölgede pozitiftir. Kondrositler, osteositler ve adipositlerde ADSC farklılaşması burada gösterilmiştir.Bu prosedürü denerken, yapışmaları ve kabarmaları gözlemlemek için 30 dakika boyunca 37 santigrat derecede bırakırken, tercihen ellerinizle yavaşça karıştırmayı unutmayın. Çalışma odası sıcaklığını 25 santigrat derece civarında tutun ve çok daha büyük sıcaklıklarda herhangi bir termal şoktan kaçının. Burada gösterdiğimiz teknik, pluripotent mezenkimal hücreleri diğer dokulardan başarılı bir şekilde izole etmek için kullanılabilir.

technique-for-obtaining-mesenchymal-stem-cell-from-adipose-tissue

Research

JoVE Journal

Medicine

Tıp

Bu protokol izolasyonu açıklar adipoz-türetilmiş lipoaspirate ve iskelet rejenerasyon değerlendirmek için 4 mm kritik ölçüdeki kalvaryal defekt oluşturmadan stromal hücreler.

Lipoaspirate itibaren hasat Yağ kaynaklı stromal hücreler kullanarak Kritik ölçekli Kalvaryum Defekt Model tamiri

Bu videoda, murin periaortik ark yağ dokusundan floresan etiketli nöral krestten türetilmiş adipoz türevli kök hücrelerin (ADSC'ler) izole edilmesi ve kültürlenmesi için bir teknik gösterilmektedir. İzolasyonu takiben, NCADSC'ler tespit edilir, floresanla aktive edilen hücre sıralaması kullanılarak sıralanır ve daha sonra hücre proliferasyonunu teşvik ederek bir plaka üzerinde kültürlenir.

Murin Periaortik Yağ Dokusundan Yağ Kaynaklı Kök Hücrelerin İzole Edilmesi

2001 yılında, UCLA araştırmacılar erişkin kök hücrelerin bir nüfus izolasyon, adipoz dokudan, Yağ elde edilen kök hücreler veya TSK adlandırılan nitelendirdi. Bu makale kolajenazı kullanarak manuel, enzimatik sindirim protokolü kullanılarak lipoaspirates gelen TSK izolasyonunu özetliyor.

İnsan Lipoaspirates den Yağ-türetilen Kök Hücre Manuel İzolasyon

Bu protokol, ekstrektif bir yöntem kullanılarak abdominoplasti ve lipoaspirate örneklerinden mezenkimal kök hücrelerin izole imal etmek için enzimsiz bir yöntem sağlar. Sert enzimlerin veya santrifüj adımlarının olmaması, in vitro çalışmalarda kullanılabilecek veya kliniğe geri transfer edilebilen klinik olarak ilgili kök hücreleri sağlar.

İnsan Yağtüretilmiş Mezenkimal Kök HücrelerinIn İzolasyon ve Genişlemesi için Enzimsiz Bir Yöntem

Burada, kapalı bir sistem cihazı kullanarak insan yağ dokusu enzimsiz mikro-parçalanma sıyoruz. Bu yeni yöntem, in vivo transplantasyon, in vitro kültür ve daha fazla hücre izolasyonu ve karakterizasyonu için uygun yağ dokusunun milimetre altı kümelerinin elde edilmesine olanak sağlar.

Hücre Fenotimi ve Sekretom Karakterizasyonu için İnsan Yağ Dokusu Mikro-parçalanma

Bu protokol, adipositlerden yüksek kaliteli RNA elde etme metodolojisi ve akış sitometrisi ile analiz için çoklu membrana bağlı belirteçlerin boyanması yoluyla SVF-makrofajların fenotipleştirilmesi dahil olmak üzere, canlı adipositlerin ve stromal vasküler fraksiyon-SVF hücrelerinin insan viseral yağından tek bir işlemde izolasyonu için etkili bir kollajenaz sindirim yöntemi sağlar.

İnsan Viseral Yağ Dokusundan Canlı Adiposit ve Stromal Vasküler Fraksiyonun RNA Analizi ve Makrofaj Fenotiplemesine Uygun İzolasyonu

Hücre tedavisi hazırlığı/manipülasyon aşamalarında kullanılmaya başlanan ksenojenik (kimyasal veya hayvansal türevli) ürünler, konakçı hastalarda immün reaktivite ve patojenik bulaşma riskinin artmasıyla ilişkilidir. Burada, insan adipoz türevi kök hücrelerin izolasyonu ve in vitro genişlemesi için tam bir ksenojenik içermeyen yöntem açıklanmaktadır.

İnsan Tedavisi için Yenilikçi Bir Ksenojenik İçermeyen Yöntemle İnsan Adipoz Türevi Kök Hücrelerin İzolasyonu ve Kültürü

Bu protokol, Sprague Dawley sıçanlarından yağ dokusu kaynaklı mezenkimal kök hücrelerin (MSC'ler) izole edilmesi ve tanımlanması için bir metodoloji açıklamaktadır.

Sprague Dawley Sıçanlarının Yağ Dokusundan Elde Edilen Mezenkimal Kök Hücrelerin İzolasyonu ve Tanımlanması

Yağ dokusu mükemmel bir mezenkimal kök hücre kaynağıdır. Burada, İsviçre fareleri epididimal yağ dokusundan yağ dokusu türevli kök hücrelerin (ADSC'ler) adım adım ekstraksiyonunu, yetiştirilmesini ve karakterizasyonunu getiriyoruz.

Fare Epididimal Yağ Dokusundan Mezenkimal Kök Hücrelerin İzolasyonu, İn Vitro Genişletme ve Karakterizasyonu

Bu protokol, insan yağ kaynaklı mezenkimal kök hücrelerin (ADSC'ler) kültürlenmesinden ve süpernatantın toplanmasından ultrasantrifüjleme kullanılarak hücre dışı veziküllerin (EV'ler) çıkarılmasına kadar tüm prosedürleri açıklar.

İnsan Adipoz Kaynaklı Mezenkimal Kök Hücrelerden Hücre Dışı Veziküllerin Saflaştırılması ve Karakterizasyonu

Burada, &gt;90% işlem süresi azalması, yüksek hücre canlılığı ve geniş uyumlulukla karakterize edilen yağ kaynaklı kök hücreleri ve adipositleri verimli şekilde izole etmek için standart bir yöntem sunuyoruz.

Domuz yağ dokusundan yağ kök hücrelerinin ve adipositlerin etkili izolasyonu

Öğrenin, yağ dokusundan mezenkimal kök hücre izolasyonunu ve uzun süreli kriyoprezervasyon sonrası yüksek canlı hücre verimliliğini artıran geliştirilmiş protokolü. Bu yöntem rejeneratif tıp ve hücre tedavisi uygulamaları için güvenilir bir kaynak sağlar.

Uzun Süreli Kriyoprezervasyonda Yağ Dokusundan Mezenkimal Kök Hücre Elde Etme Tekniği ve Stromal Vasküler Fraksiyon Karakterizasyonu (Video) | JoVE Journal

Uzun Süreli Kriyoprezervasyonda Yağ Dokusundan Mezenkimal Kök Hücre Elde Etme Tekniği ve Stromal Vasküler Fraksiyon Karakterizasyonu

Daha fazla video keşfet