Ökaryotik Glikojen Metabolizmasının İncelenmesi için Spektrofotometrik Yöntemler

Protokoller önemlidir, çünkü radyoaktif izotopların kullanımından kaçınırlar ve birçok işçinin glikojen metabolizmasının enzimlerini incelemesini engelleyebilecek bir engeli ortadan kaldırırlar. Açıklanan prosedürler ucuzdur ve sadece basit bir spektrofotometreye erişim gerektirir. Glikojen sentaz aktivitesinin belirlenmesiyle başlamak için, önceden hazırlanmış UDP glikoz, ATP, fosfoenolpiruvat ve NDP kinaz stok çözeltilerini buz üzerinde çözün.

Bir su banyosunu önceden 30 santigrat dereceye ısıtın. Stok çözeltileri hazır olduğunda, metin protokolünde açıklandığı gibi, reaktifleri 15 mililitrelik bir tüpe ekleyerek glikojen sentaz tahlillerinin sayısına göre yeterli tahlil karışımı hazırlayın. NADH'yi reaksiyon karışımından su ile değiştirerek boş bir reaksiyon hazırlayın ve reaksiyonu tek kullanımlık bir metakrilat küvete aktarın.

Spektrofotometrede 340 nanometre dalga boyunda sıfır ayarlamak için boş reaksiyonu kullanın. 1.5 mililitrelik bir tüpte reaksiyon karışımının 770 mikrolitrelik bir alikotunu alın ve sırayla tüpe NDP kinaz ve piruvat kinaz laktat dehidrogenaz karışımının her birine iki mikrolitre ekleyin. Karıştırdıktan sonra, reaksiyon karışımını önceden ısıtmak için tüpü su banyosunda 30 santigrat derecede yavaşça inkübe edin.

Daha sonra, pH 7.8'de 20 milimolar Tris tamponuna glikojen sentaz içeren numunenin 30 mikrolitresini ekleyin ve reaksiyon karışımını bir bertaraf metakrilat küvete aktarmadan önce hafifçe karıştırın. Küveti spektrofotometreye yerleştirin ve absorbansı 10 ila 20 dakika boyunca zamanlanmış aralıklarla 340 nanometrede kaydedin. Ardından, zamana karşı elde edilen absorbansları çizin.

Salınan glikozu ölçmek için, süpernatantın 40 mikrolitresini ısıtılmış glikojen numunelerinden tek kullanımlık metakrilat küvetlere aktarın. Ve makalede açıklandığı gibi ölçülen trietanolamin, hidroklorür magnezyum sülfat tamponu, NADP ATP karışımı ve su hacimlerini ekleyin. Hava kabarcıkları oluşturmadan karışımı hafifçe yukarı ve aşağı pipetleyerek karıştırın.

Her küvete 0.5 mikrolitre glikoz-6-fosfat dehidrogenaz ekleyin. Pipetleme ile karıştırdıktan sonra, karışımı oda sıcaklığında 10 dakika inkübe edin ve ardından emilimi 340 nanometrede kaydedin. Daha sonra, daha önce açıklandığı gibi her küvete 0.5 mikrolitre hekzokinaz karıştırın ve emici seti 340 nanometreye kaydetmeden önce 15 dakika inkübe edin.

Daha sonra inkübasyona oda sıcaklığında beş dakika devam edin, ardından absorbansı kaydedin. Emilim 15 dakikada kaydedilenden artmışsa, son absorpsiyonu 340 nanometrede kaydetmeden önce beş dakika boyunca inkübasyona devam edin. Glikojen dallanmasını belirlemek için, 650 mikrolitre iyot kalsiyum klorür renk reaktifi stoğunu 1,5 mililitrelik bir tüpte 100 mikrolitre su ile birleştirin ve tek kullanımlık bir metakrilat küvete aktarmadan önce çözeltiyi iyice karıştırın.

Arka plan spektrumunu 330 ila 800 nanometre arasında toplamak için dalga boyu tarama modunda bir çalışma yapmak için küveti spektrofotometreye yerleştirin. Ayrı bir 1.5 mililitrelik tüpte, 650 mikrolitre çalışan iyot kalsiyum klorür renk reaktifini 50 mikrogram istiridye glikojeni ile birleştirin ve su ile 750 mikrolitreye kadar son hacmi oluşturun. Karışımı iyice karıştırdıktan sonra, 330 ila 800 nanometre arasında bir absorpsiyon spektrumu toplamak için çözeltiyi tek kullanımlık bir metakrilat küvete aktarın.

Benzer şekilde, daha önce tarif edildiği gibi 50 mikrogram amilopektin ve 30 mikrogram amiloz içeren bir absorpsiyon spektrumu elde edin. Karakterize edilmemiş bir glikojen numunesinin dallanmış yapısının bir göstergesini elde etmek için, glikojen 25 ila 50 mikrogramını, çalışan iyot kalsiyum klorür renk reaktifinin 650 mikrolitresi ile birleştirin ve absorpsiyon spektrumunu elde etmek için daha önce açıklandığı gibi devam edin. Glikojen sentaz tahlillerinde, zamanla 340 nanometrede emilimde doğrusal bir azalma gözlenmiştir.

Tahlil işlemine çok fazla glikojen sentaz eklenmesi, reaksiyonun ilk iki dakika içinde tamamlanmasına neden oldu. Glikojen sentaz içermeyen kontrol reaksiyonu, absorbansta ölçülebilir bir azalma göstermez. Saflaştırılmış bir enzim kullanan bir glikojen fosforilaz testinden elde edilen veriler, üç dakika süren doğrusal bir faza sahipti.

Dakikada yaklaşık 0,01 ila 0,04 birim absorbans artışı en uygunudur. Glikojen dallanma enzim testinde, reaksiyon en az 10 dakika boyunca devam eden doğrusal bir faz gösterdi. Glikojen dallanma enzimi tahlillerinden elde edilen temsili veriler, dallanma enzimi olmayan kontrol örnekleri ile dallanma enzimi içeren reaksiyonlar arasındaki absorbanstaki farkı göstermiştir.

Tahlilin dar dinamik aralığı gösterilmiştir. Üretilebilecek absorbanstaki maksimum değişim 0.4 absorbans birimidir ve absorpsiyondaki değişim yaklaşık 0.2 absorbans birimi olduğunda doğrusallık kaybolur. Glikojen dallanma değerlendirmesinde kullanılan glikojen, amilopektin ve amiloz kütleleri, her biri farklı absorbans maksimumunda yaklaşık 0.7 ila 0.8 arasında maksimum absorbans okuması göstermiştir.

Glikojen örneği, yaklaşık 400 nanometre ve 460 nanometrede iki tepe noktası üretti. İyot kalsiyum klorür renk reaktifi çok yoğundur. Bir absorpsiyon spektrumu toplamadan önce glikojen numunelerinin reaktif ile tamamen karıştırıldığından emin olmak önemlidir.