Bakteri Taraması, Seçimi ve İzolasyonu için Fotobozunur Hidrojel Arayüzleri
November 4th, 2021
Yüksek çözünürlüklü bir ışık sıvazlama aracı kullanarak bakteri hücrelerini izole etmek için fotobozunur hidrojellerin kullanıldığı bildirilmektedir. Sürecin temel deneysel prosedürleri, sonuçları ve avantajları gözden geçirilmiştir. Yöntem, heterojen topluluklardan veya popülasyonlardan nadir veya benzersiz işlevler gösteren hedeflenen bakterilerin hızlı ve ucuz izolasyon edilmesini sağlar.
Bu protokol, hücreleri genomik karakterizasyon için tarama arayüzlerinden hızla izole etmek için tasarlanmıştır ve bu yetenek, makroskopik olarak gözlemlenebilir hücre özelliklerini genomik bilgilerle birleştirebildiği için önemlidir. Tarama arayüzlerinden hedeflenen bakteri hücreleri, bu teknik kullanılarak operasyonel olarak basit bir şekilde yüksek uzamsal konumla izole edilebilir. Hidrojeller diğer tarama arayüzlerinde uygulanabilir.
Hidrojel malzeme, hücrelerin mikroakışkan cihazlardan isteğe bağlı olarak alınması için mikroakışkan kanallara kolayca dahil edilebilir. Çapraz bağlama tamponu istenen hücre yoğunluğu ile aşılayarak başlayın. Çapraz bağlama tamponunun 12,5 mikrolitresini ve PEG ONB diakrilit çözeltisinin 5,6 mikrolitresini ekleyerek hidrojel öncül çözeltisini 0,5 mililitrelik bir mikrosantrifüj tüpünde hazırlayın.
Ve son olarak, karışıma 6.9 mikrolitrelik forearm PEG tiyol çözeltisi ekleyin. Hidrojel öncül çözeltisinde hücre kapsülleme için, tiyolated baz kapakları temiz bir Petri kabına yerleştirin ve kapakçık iki karşı tarafına iki aralayıcı yerleştirin. Aralayıcıları Petri kabına bantlayarak taban kapak kapağındaki araları sabitlayın.
Reaktif olmayan perfloroalkylated cam kaydırağına öncü çözeltinin istenen hacmini ekledikten sonra, slaydı taban kapak kapağına yerleştirin ve hidrojel oluşumunun oda sıcaklığında 25 dakika boyunca tamamlanmasını bekleyin. Jelleşme tamamlandıktan sonra, perfloroalkylated cam slaydı yavaşça çıkarın. Substratı antibiyotikle desteklenmiş ATGN ortamı içeren 60 ila 15 milimetre Petri kabına yerleştirin.
Mikrowell dizisi substratı üzerinde 0.1 OD 600 ile bakteri hücresi süspansiyonlarının tohum 700 mikrolitresi ve daha önce gösterildiği gibi hidrojel öncül çözeltisini pH sekiz fosfat tamponlu salin ATGN 12.5 mikrolitre kullanarak yapmak. Pipet 12.5 reaktif olmayan perfloroalkylated cam slayt üzerinde öncü çözeltinin mikrolitreleri ve hücreler ile aşılanmış mikrowell dizisi substratının iki karşı tarafına iki adet 38 mikrometre çelik ara parça yerleştirin. Daha sonra perfloroalkylated cam kaydırağı öncü çözelti damlacığı ile ters çevirin ve mikrowell substratının ortasına bir damlacık yerleştirin.
Hidrojel oda sıcaklığında 25 dakikalık bir inkübasyondan sonra oluştuğunda, cam slaydı mikrowell substratından hafifçe çıkarın ve substratı antibiyotikle desteklenmiş ATGN ortamı içeren bir Petri kabına yerleştirin. Örneği bir PDMS tutucusuna yerleştirin ve numune dehidrasyonunu önlemek ve serbest bırakılan hücreler için bir taşıyıcı çözüm sağlamak için tanımlanan ortamı numunenin üzerine ekleyin. Kalibrasyon aynasını yerine getirdikten sonra, hidrojel veya microwell dizisindeki kolonilerin keskin bir görüntüsünü elde etmek için mikroskop odağını ayarlayın ve kolonileri veya ilgi çekici kuyuları tanımlamak için inceleyin.
Burada, kamera görünümü hücre çıkarma için farklı desenleri test etmek ve tanımlanan deseni kaydetmek için numunenin içindeki kolonileri gösterirken ışık desenlerini tasarlayın. Ardından oturum denetimi bölümünü seçin, desenli aydınlatma aracı ürün adıyla başlıklı sekmenin altına kaydedilmiş sırayı ekleyin. İstediğiniz pozlama konumunu görüntülemek ve ayarlamak için deseni uyarma seçeneğini belirleyin.
Ardından, LED kontrol sekmesi altında ışık yoğunluğunu %60'a ve pozlama süresini 40 saniyeye ayarlayın ve pozlama işlemini başlatın. Hücre salınımını sağlamak için hidrojel bozulmasını gerçek zamanlı ve Brightfield modunda izleyin. Serbest bırakılan hücreyi toplamak için mikroskop filtresini Brightfield'dan TRITC'ye değiştirerek numunenin açıkta kalan alanını çıplak gözle görselleştirin.
Açık alan yerleştirildikten sonra, borunun ucunu ışınlanmış noktaya yerleştirin, ardından hücre alımını gerçek zamanlı olarak izlemek için mikroskop filtresini tekrar Brightfield olarak değiştirin. Serbest bırakılan hücreleri içeren 200 mikrolitre çözeltiyi dikkatlice çekmek ve çözeltiyi DNA analizi veya kaplama için 1,5 milimetrelik bir santrifüj tüpüne aktarmak için borunun diğer ucuna bağlı şırıngayı kullanın. Serbest bırakılan hücrelerin morfolojisini etkileyen dökme hidrojellerden hücre ekstraksiyonu için farklı UV ışık mikro desenleri kullanılmıştır.
Halka deseninde UV maruziyeti, koruyucu bir PEG hidrojelinde kapsüllenmiş tüm koloninin serbest bırakılmasına neden oldu. Buna karşılık, koloninin bir kısmını veya tamamını UV ışığına maruz kalarak, hücreler agrega hücre kümeleri veya serbest bireysel hücreler olarak çıkarılabilir. Hücre tohumlama yoğunluğu ve hidrojel kalınlığı hücre kapsülleme için önemlidir.
Daha ince hidrojeller, minimum koloni üst üste binen mikro kolonilerle sonuçlanırken, artan kalınlıktaki hidrojeller üst üste binen kolonilerle sonuçlandı ve bu da birden fazla koloninin çıkarılmasına neden olabilir. Üst üste binen koloniler, ışık deseninin iki boyutlu doğası nedeniyle ekstraksiyon sırasında çapraz kontaminasyona neden olabilir. Üst koloni hedeflendiğinde, alttaki koloni de onunla birlikte çıkarıldı.
Çeşitli UV ışık mikro desenlerinin hücre canlılığı üzerindeki etkisi de değerlendirildi. Mikro koloniler dairesel veya çapraz desende kontrollü dozlarda UV ışığına maruz kaldıklarında hücre iyileşmesi ve DNA saflığı etkilenmedi. Hücreler, dairesel ve halka deseninde ışınlama yapıldıktan sonra hücrelerin ilgili desende çıkarıldığı temsili konfokal mikroskopi görüntülerinden belirgin olan bu yaklaşım kullanılarak microwell dizilerinden başarıyla alınmıştır.
Mikrowell dizilerinden çıkarıldıktan sonra hücre canlılığı ve DNA miktarı değerlendirildi. Maruz kalma şekilleri ne canlı hücre sayısını ne de DNA kalitesini etkiledi, bu da uygulanabilir bakteri hücrelerinin mikroüllerden en az hasarla seçici olarak alınabileceğini ve DNA'larının aşağı akış genomik analizi için yüksek saflıkta izole edilebileceğini gösterdi. Perfloroalkylated kapak sapını çıkarmadan önce her zaman hidrojel oluştuğunu kontrol edin.
Hidrojel biriktirme için ara maddeleri yerleştirmek ve hücrelerin çıkarılması için boruları kullanmak için hassasiyet ve bakım gereklidir.
Genel Bakış
Bu makale, karmaşık topluluklarından spesifik bakterilerin hızlı ve maliyet-etkin çıkarılmasına olanak tanıyan, fotodegrade edici hidrojeller ve yüksek çözünürlüklü ışık desenleme kullanarak bakteri hücrelerini izole etme protokolünü ele almaktadır. Bu yöntem, genomik analizi kolaylaştırmaktadır.
Çalışmanın Temel Bileşenleri
Bilim Alanı
- Mikrobiyoloji
- Hücre Biyolojisi
- Genomika
Arka Plan
- Spesifik bakteri hücrelerinin izolasyonu, genomik karakterizasyon için kritik öneme sahiptir.
- Fotodegrade edici hidrojeller, hücre kapsülleme ve geri kazanım için yeni bir yaklaşım sunar.
- Teknik, gözlemlenebilir hücre özelliklerini genomik verilerle birleştirir.
- Hidrojeller çeşitli tarama arayüzlerine entegre edilebilir.
Çalışmanın Amacı
- Hedeflenen bakteri hücrelerinin hızlı izolasyonu için bir yöntem geliştirmek.
- Hücre çıkarımında ışık desenlerinin etkinliğini değerlendirmek.
- Hidrojel kalınlığının hücre canlılığı ve çıkarma verimliliği üzerindeki etkisini değerlendirmek.
Kullanılan Yöntemler
- Hücre kapsülleme için hidrojel öncü çözeltilerinin hazırlanması.
- Hidrojelleri bozmak ve hücreleri serbest bırakmak için ışık desenleme araçlarının kullanılması.
- Mikroskopi yoluyla hücre çıkarımının izlenmesi.
- Hücre canlılığı ve DNA kalitesinin çıkarma sonrası değerlendirilmesi.
Ana Sonuçlar
- Hücreler, mikro kuyu dizilerinde minimal hasarla başarılı bir şekilde izole edildi.
- Farklı UV ışık desenleri, serbest bırakılan hücrelerin morfolojisini etkiledi.
- Hidrojel kalınlığı, koloni örtüşmesini ve çıkarma sonuçlarını etkiledi.
- Hücre canlılığı ve DNA saflığı çıkarma süreci boyunca korunmuştur.
Sonuçlar
- Yöntem, canlı bakteri hücrelerinin seçici geri kazanılmasına olanak tanır.
- Hidrojeller, bakterilerin genomik çalışmalarında etkili bir şekilde kullanılabilir.
- Bu yaklaşım, hücrelerin sonraki uygulamalar için izolasyonunun verimliliğini artırır.
Sıkça Sorulan Sorular
Executive Industry Relevance
High-resolution photodegradable hydrogel interfaces enable precise screening and isolation of bacterial phenotypes, directly linking observable traits to downstream genomic analysis. This capability addresses a critical bottleneck in early discovery by allowing rapid, high-purity retrieval of rare or emergent bacterial strains from heterogeneous populations. The approach supports portfolio-wide efforts to de-risk target selection and accelerate functional validation in microbiology-driven R&D.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables direct correlation of phenotypic screening with genotypic analysis for functional target validation.
- Supports biological de-risking by isolating rare or emergent bacterial phenotypes from complex libraries.
- Facilitates predictive confidence in target selection by ensuring high-purity retrieval of candidate strains.
Screening & Assay Development
- Prepares validated bacterial systems for downstream workflows through precise, contamination-minimized isolation.
- Standardizes assay outputs by enabling reproducible, spatially controlled cell retrieval.
- Enhances screening readiness and scalability for mutant libraries and consortia studies.
Translational & Preclinical Research
- Aligns with translational biomarker discovery by enabling genomic characterization of phenotypically distinct isolates.
- Maintains continuity from discovery through preclinical validation by preserving cell viability and DNA integrity.
- Supports risk-adjusted advancement decisions by providing high-quality isolates for further functional studies.
Pipeline & Workflow Integration
This photodegradable hydrogel method integrates at the interface of phenotypic screening and genomic analysis, bridging early discovery and preclinical research stages.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway clarification by enabling isolation of functionally relevant bacterial strains.
- Screening: Delivers reproducible, quantitative outputs through controlled cell encapsulation and release.
- Analytics: Provides high-purity samples for comparative genomic and phenotypic analyses.
- Translational Research: Facilitates biomarker alignment by linking phenotype to genotype in isolated strains.
- Enterprise Reuse: Offers a scalable, adaptable platform for diverse microbiology screening and isolation needs.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in target validation.
- Operational Value: Delivers standardized, reproducible, and scalable cell isolation workflows.
- Strategic Value: Improves go/no-go decision quality and capital efficiency by enabling high-fidelity downstream analysis.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization and advancement of microbial targets and consortia.
Implementation Considerations
- Requires expertise in hydrogel chemistry, microscopy, and light patterning instrumentation.
- Needs access to high-resolution light patterning tools and compatible microfluidic or microwell platforms.
- Demands cross-team standardization for hydrogel preparation and cell retrieval protocols.
- Adaptable to various bacterial models but sensitive to hydrogel thickness and colony overlap.
- Careful handling is essential to prevent cross-contamination and ensure high-purity isolation.
