Name: Derin Beyin In Vivo Kalsiyum Görüntüleme için Stereotaksik Viral Enjeksiyon ve Degrade İndeks Lens İmplantasyonu (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-10-08T14:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 11 s
Description: Öğrenin, serbestçe hareket eden farelerde derin beyin yapılarında yüzlerce nöronun kalsiyum dinamiklerini in vivo görüntülemek için miniskop kullanımını. Bu yöntem, nöron devrelerinin işleyişini uzun süreli kayıtlarla araştırır.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Bu çalışma, Ulusal Sağlık Enstitüsü (NIH) 5P20GM121310, R61NS115161 ve UG3NS115608'den gelen hibelerle desteklenmektedir.

<ol><li>Clapham, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calcium+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Calcium signaling.</a> Cell. 131 (6), 1047-1058 (2007).</li>
<li>Brini, M., Cali, T., Ottolini, D., Carafoli, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuronal+calcium+signaling%3A+function+and+dysfunction%5BTitle%5D)+AND+%22Cellular+and+Molecular+Life+Sciences%22%5BJournal%5D)">Neuronal calcium signaling: function and dysfunction.</a> Cellular and Molecular Life Sciences. 71 (15), 2787-2814 (2014).</li>
<li>Chen, T. W., Li, N., Daie, K., Svoboda, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Map+of+Anticipatory+Activity+in+Mouse+Motor+Cortex%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">A Map of Anticipatory Activity in Mouse Motor Cortex.</a> Neuron. 94 (4), 866-879 (2017).</li>
<li>Denk, W., Strickler, J. H., Webb, W. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two-photon+laser+scanning+fluorescence+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Two-photon laser scanning fluorescence microscopy.</a> Science. 248 (4951), 73-76 (1990).</li>
<li>Komiyama, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Learning-related+fine-scale+specificity+imaged+in+motor+cortex+circuits+of+behaving+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Learning-related fine-scale specificity imaged in motor cortex circuits of behaving mice.</a> Nature. 464 (7292), 1182-1186 (2010).</li>
<li>Peters, A. J., Lee, J., Hedrick, N. G., O'Neil, K., Komiyama, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reorganization+of+corticospinal+output+during+motor+learning%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Reorganization of corticospinal output during motor learning.</a> Nature Neuroscience. 20 (8), 1133-1141 (2017).</li>
<li>Barbera, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spatially+compact+neural+clusters+in+the+dorsal+striatum+encode+locomotion+relevant+information%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Spatially compact neural clusters in the dorsal striatum encode locomotion relevant information.</a> Neuron. 92 (1), 202-213 (2016).</li>
<li>Cai, D. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+shared+neural+ensemble+links+distinct+contextual+memories+encoded+close+in+time%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">A shared neural ensemble links distinct contextual memories encoded close in time.</a> Nature. 534 (7605), 115-118 (2016).</li>
<li>de Groot, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NINscope%2C+a+versatile+miniscope+for+multi-region+circuit+investigations%5BTitle%5D)+AND+%22Elife%22%5BJournal%5D)">NINscope, a versatile miniscope for multi-region circuit investigations.</a> Elife. 9, 49987(2020).</li>
<li>Ghosh, K. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Miniaturized+integration+of+a+fluorescence+microscope%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Miniaturized integration of a fluorescence microscope.</a> Nature Methods. 8 (10), 871-878 (2011).</li>
<li>Jacob, A. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+compact+head-mounted+endoscope+for+in+vivo+calcium+imaging+in+freely+behaving+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Protocols+in+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">A compact head-mounted endoscope for in vivo calcium imaging in freely behaving mice.</a> Current Protocols in Neuroscience. 84 (1), 51(2018).</li>
<li>Liang, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distinct+and+Dynamic+ON+and+OFF+neural+ensembles+in+the+prefrontal+cortex+code+social+exploration%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Distinct and Dynamic ON and OFF neural ensembles in the prefrontal cortex code social exploration.</a> Neuron. 100 (3), 700-714 (2018).</li>
<li>Liberti, W. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Unstable+neurons+underlie+a+stable+learned+behavior%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Unstable neurons underlie a stable learned behavior.</a> Nature Neuroscience. 19 (12), 1665-1671 (2016).</li>
<li>Stosiek, C., Garaschuk, O., Holthoff, K., Konnerth, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+two-photon+calcium+imaging+of+neuronal+networks%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">In vivo two-photon calcium imaging of neuronal networks.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 100 (12), 7319-7324 (2003).</li>
<li>Chen, T. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ultrasensitive+fluorescent+proteins+for+imaging+neuronal+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Ultrasensitive fluorescent proteins for imaging neuronal activity.</a> Nature. 499 (7458), 295-300 (2013).</li>
<li>Miyawaki, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescent+indicators+for+Ca2%2B+based+on+green+fluorescent+proteins+and+calmodulin%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Fluorescent indicators for Ca2+ based on green fluorescent proteins and calmodulin.</a> Nature. 388 (6645), 882-887 (1997).</li>
<li>Bassett, J. J., Monteith, G. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetically+encoded+calcium+indicators+as+probes+to+assess+the+role+of+calcium+channels+in+disease+and+for+high-throughput+drug+discovery%5BTitle%5D)+AND+%22Advances+in+Pharmacology%22%5BJournal%5D)">Genetically encoded calcium indicators as probes to assess the role of calcium channels in disease and for high-throughput drug discovery.</a> Advances in Pharmacology. 79, 141-171 (2017).</li>
<li>Lin, M. Z., Schnitzer, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetically+encoded+indicators+of+neuronal+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Genetically encoded indicators of neuronal activity.</a> Nature Neuroscience. 19 (9), 1142-1153 (2016).</li>
<li>Tian, L., Akerboom, J., Schreiter, E. R., Looger, L. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neural+activity+imaging+with+genetically+encoded+calcium+indicators%5BTitle%5D)+AND+%22Progress+in+Brain+Research%22%5BJournal%5D)">Neural activity imaging with genetically encoded calcium indicators.</a> Progress in Brain Research. 196, 79-94 (2012).</li>
<li>Moore, D. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gradient-index+optics%3A+A+review%5BTitle%5D)+AND+%22Applied+Optics%22%5BJournal%5D)">Gradient-index optics: A review.</a> Applied Optics. 19 (7), 1035-1038 (1980).</li>
<li>Zhang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Miniscope+GRIN+Lens+System+for+Calcium+Imaging+of+Neuronal+Activity+from+Deep+Brain+Structures+in+Behaving+Animals%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Protocols+in+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Miniscope GRIN Lens System for Calcium Imaging of Neuronal Activity from Deep Brain Structures in Behaving Animals.</a> Current Protocols in Neuroscience. 86 (1), 56(2019).</li>
<li>Yang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+two-step+GRIN+lens+coating+for+in+vivo+brain+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience+Bulletin%22%5BJournal%5D)">A two-step GRIN lens coating for in vivo brain imaging.</a> Neuroscience Bulletin. 35 (3), 419-424 (2019).</li>
<li>Liang, B., Zhang, L., Moffitt, C., Li, Y., Lin, D. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+open-source+automated+surgical+instrument+for+microendoscope+implantation%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience+Methods%22%5BJournal%5D)">An open-source automated surgical instrument for microendoscope implantation.</a> Journal of Neuroscience Methods. 311, 83-88 (2019).</li>
<li>Giovannucci, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CaImAn+an+open+source+tool+for+scalable+calcium+imaging+data+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Elife%22%5BJournal%5D)">CaImAn an open source tool for scalable calcium imaging data analysis.</a> Elife. 8, 38173(2019).</li>
<li>Barbera, G., Liang, B., Zhang, L., Li, Y., Lin, D. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+wireless+miniScope+for+deep+brain+imaging+in+freely+moving+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience+Methods%22%5BJournal%5D)">A wireless miniScope for deep brain imaging in freely moving mice.</a> Journal of Neuroscience Methods. 323, 56-60 (2019).</li>
<li>Shuman, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Breakdown+of+spatial+coding+and+interneuron+synchronization+in+epileptic+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Breakdown of spatial coding and interneuron synchronization in epileptic mice.</a> Nature Neuroscience. 23 (2), 229-238 (2020).</li>
<li>Werner, C. T., Williams, C. J., Fermelia, M. R., Lin, D. T., Li, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Circuit+mechanisms+of+neurodegenerative+diseases%3A+A+new+frontier+with+miniature+fluorescence+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Circuit mechanisms of neurodegenerative diseases: A new frontier with miniature fluorescence microscopy.</a> Frontiers in Neuroscience. 13, 1174(2019).</li>
<li>Brault, V., Besson, V., Magnol, L., Duchon, A., Herault, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cre%2FloxP-mediated+chromosome+engineering+of+the+mouse+genome%5BTitle%5D)+AND+%22Handbook+of+Experimental+Pharmacology%22%5BJournal%5D)">Cre/loxP-mediated chromosome engineering of the mouse genome.</a> Handbook of Experimental Pharmacology. (178), 29-48 (2007).</li>
<li>McLellan, M. A., Rosenthal, N. A., Pinto, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cre-loxP-mediated+recombination%3A+General+principles+and+experimental+considerations%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Protocols+in+Mouse+Biology%22%5BJournal%5D)">Cre-loxP-mediated recombination: General principles and experimental considerations.</a> Current Protocols in Mouse Biology. 7 (1), 1-12 (2017).</li>
</ol>

Yazarlar rakip finansal çıkarlar olmadığını bildirmektedir.

Sinirbilimdeki merkezi bir soru, sinirsel dinamiklerin ve devrelerin bilgiyi nasıl kodladığını ve depoladığını ve beyin hastalıklarında nasıl değiştirildiğini anlamaktır. Bir miniskop in vivo Ca2+ görüntüleme sistemi kullanılarak, yerel bir mikro devre içindeki yüzlerce nörondan bireysel nöral aktivite, serbestçe davranan bir hayvandan aynı anda izlenebilir. Burada, kemirgenleri özel olarak geliştirilmiş bir miniskop kayıt sistemi aracılığıyla in vivo Ca2+ görüntülemeye derin bir beyin için hazırlamak için viral enjeksiyon ve GRIN lens implantasyonu için ayrıntılı bir cerrahi protokol açıklanmaktadır. Tablo 1, miniskop sistemimizin ticari olarak temin edilebilen ve özel olarak üretilen diğer miniskop sistemleri 7,8,9,10,11,13,25,26 ile karşılaştırmalarını göstermektedir. Mevcut cerrahi protokolü kullanan GRIN lens implantasyonunun, derin bir beyin in vivo kalsiyum görüntüleme için herhangi bir ticari veya özel yapım tek foton ve iki foton görüntüleme sistemleriyle uyumlu olduğunu belirtmek gerekir.
Viral enjeksiyondan miniskobun in vivo kalsiyum görüntülemesinin veri toplanmasına kadar, tüm deneysel prosedürün tamamlanması en az 2 ay sürer. Karmaşık ve emek yoğun bir süreçtir. Deneyin nihai başarısı, GECI'lerin doğru seçimi, hedeflenen beyin bölgesine doğru virüs enjeksiyonu, istenen nöral popülasyonda yeterli viral ekspresyon, GRIN lensin tam olarak istenen yere implantasyonu, ameliyatlardan yeterli iyileşme, ayrıca ameliyat sonrası şiddetli inflamasyonun meydana gelip gelmediği ve hayvanın davranışının ameliyatlardan ciddi şekilde etkilenip etkilenmediği gibi birçok faktöre bağlıdır. ve benzeri.
İki kritik adım stereotaksik virüs enjeksiyonu ve GRIN lens implantasyonunu içerir. Gösterim amacıyla, stereotaksik mikroenjeksiyon, fare mPFC'sinde, mPFC'deki piramidal nöronları seçici olarak etiketleyen CaMKII promotörünün kontrolü altında GCaMP6f'yi kodlayan adeno ilişkili virüs (AAV1) ile gerçekleştirildi. GCaMP6f, 71 ms15'lik yarı bozunma süresine sahip en hızlı ve en hassas kalsiyum göstergelerinden biri olduğu için seçildi. Ek olarak, GCaMP6f'ın AAV viral ekspresyonu uzun ömürlüdür (yani, birkaç ay), nörodejeneratif hastalıkların fare modellerinde uzunlamasına çalışmalar için uzun bir süre boyunca tekrarlayan in vivo Ca2 + görüntüleme yapmak için idealdir27. Mevcut cerrahi protokol, başka herhangi bir beyin bölgesindeki farklı hücre popülasyonlarını hedeflemek için uyarlanabilir. Çeşitli mevcut viral araçlar, istenen yaşta istenen beyin bölgesindeki spesifik nöral popülasyonların seçici olarak etiketlenmesine izin verir. Ek olarak, araştırmacılar genetik modifikasyonlar yapmak ve davranışsal ve nöral devre sonuçlarını incelemek için Cre-LoxP rekombinasyon sisteminden ve çeşitli transgenik fare modellerinden yararlanabilirler28,29.
Sunulan protokolün benzersiz bir özelliği, otomatik katman katman beyin dokusu aspirasyonunun GRIN lens (1 mm çapında) implantasyonundan önce gerçekleştirilmiş olmasıdır. Bu, özel yapım bir robotik kol ve yazılım 23 tarafından kontrol edilen bir vakum sistemine bağlı27 G'lik bir iğne ile elde edilir. Deneyimlerimize dayanarak, bu yöntem GRIN lensin temas etmesi için düzgün bir yüzey oluşturur ve komşu dokuya manuel doku aspirasyonundan daha az zarar verir23. Bu nedenle, bu prosedür nispeten daha geniş çaplı (örneğin, 1 mm) GRIN lensler için belirgin bir avantaj sağlar. Bununla birlikte, daha küçük çaplı (0,5 mm veya 0,25 mm) bir GRIN lensin implante edilmesi için doku aspirasyonu gerekli olmayabilir. Bunun yerine, 30 G iğne21 ile yapılan öncü iz boyunca doğrudan ekilebilir.
Yukarıda tartışılan iki kritik adımın yanı sıra, başarılı bir operasyon için diğer birçok faktör de dikkatlice düşünülmelidir. (1) Beyne temas eden tüm aletler enfeksiyonu önlemek için sterilize edilmelidir. (2) Daha fazla inflamasyonu ve aşırı skar dokusu oluşumunu önlemek için beyne verilen hasarı en aza indirmek için tüm cerrahi adımların uygulanması gerekir. (3) Başlangıçta verilen ve ameliyat sırasında sürdürülen anestezi dozları, özellikle intraperitoneal olarak uygulananlar dikkatle düşünülmelidir. Anestezi dozları, bazıları daha duyarlı olabileceğinden, farklı fare suşlarına göre değiştirilebilir. (4) Ameliyat sırasında farenin durumu sürekli izlenmelidir. Son olarak, (5) farelerin ameliyat sonrası düzenli olarak izlenmesi gerekir, çünkü ameliyattan sonra birçok komplikasyon ortaya çıkabilir.
GRIN lens implantasyon adımı sırasında beyin dokusunun bir kısmı tek taraflı olarak çıkarılmasına rağmen, belirgin bir davranış eksikliği gözlemlemedik 7,12. Miniskopun ağırlığı yaklaşık 2 gramdır ve kablo, hafif hale getirmek ve farenin kolayca taşıyabilmesini sağlamak için özel olarak tasarlanmıştır. Miniskop ve kablo sadece in vivo görüntülemeden önce hayvana bağlanır ve görüntülemeden sonra ayrılır. Tüm görüntüleme işlemi genellikle 30 dakikadan fazla sürmez. Bu nedenle, bu araçlar farenin serbestçe davranmasını engellemez. Miniskop kurulum ve demontaj adımları, hayvan kısıtlaması amacıyla izofluran ile kısa bir anesteziye (2 dakikadan az) ihtiyaç duyar. Genellikle farenin in vivo görüntüleme yapmadan önce 30 dakika boyunca izoflurana kısa süre maruz kalmaktan kurtulmasına izin veriyoruz. Fare sağlığı ve fare sosyal davranışı üzerinde herhangi bir etki fark etmeden birkaç hafta boyunca haftada bir kez miniskop in vivo kalsiyum görüntüleme yaptık12.
Mevcut miniskop kayıt sisteminin en büyük sınırlamalarından biri, mikroskobu veri toplama için bir kabloya bağlama ihtiyacıdır. Kablonun varlığı bazen fare görev performansını kısıtlar ve aynı anda bir hayvanın kaydını sınırlar. Son zamanlarda, kablosuz bir miniskop geliştirildi25,26. Bu, görev performansını genişletecek ve bir gruptaki birden fazla hayvandan eşzamanlı in vivo görüntülemeye izin verecektir. Dahası, çift renkli bir miniskop ile birleştirilmiş spektral olarak ayrılabilir dalga boylarına sahip daha hassas GECI'ler geliştirmek, sinirbilim araştırmaları için daha heyecan verici olanaklar sunacaktır.

An erratum was issued for:&#160;<a href="https://www.jove.com/t/63049">Stereotaxic Viral Injection and Gradient-Index Lens Implantation for Deep Brain In Vivo Calcium Imaging</a>. The Discussion&#160;was&#160;updated.
The following paragraph was added to the end of the Discussion:
Although a chunk of brain tissue is removed unilaterally during the GRIN lens implantation step, we did not observe any obvious behavior deficits7,12. The weight of the miniscope is around 2 grams and the cable is custom-designed to make it light and to ensure that the mouse can easily carry it. The miniscope and cable are only attached to the animal prior to in vivo imaging and detached after imaging. The entire imaging process usually takes no longer than 30 minutes. Therefore, these instrumentations do not prevent the mouse from freely behaving. The miniscope installation and deinstallation steps need a brief anesthesia (less than 2 minutes) with isoflurane for the purpose of animal restraining. We typically let the mouse recover from the brief exposure of isoflurane for 30 minutes before performing in vivo imaging. We have performed miniscope in vivo calcium imaging once per week for a few weeks without noticing any impact on mouse health and mouse social behavior12.

An erratum was issued for:&#160;<a href="https://www.jove.com/t/63049">Stereotaxic Viral Injection and Gradient-Index Lens Implantation for Deep Brain In Vivo Calcium Imaging</a>. The Discussion&#160;was&#160;updated.

Erratum: Stereotaxic Viral Injection and Gradient-Index Lens Implantation for Deep Brain In Vivo Calcium Imaging

Hücre içi Ca2+ sinyalizasyonu, hücre büyümesi, proliferasyon, farklılaşma, migrasyon, gen transkripsiyonu, sekresyon ve apoptozun önemli bir düzenleyicisidir1. Nöronlarda, Ca 2+ sinyallemesi tam olarak kontrol edilir, çünkü uzay-zamansal paterni, membran uyarılabilirliği, nörotransmitter salınımı ve sinaptik plastisite2 gibi önemli işlevlerle ilgilidir.
İn vivo kalsiyum görüntüleme, normal hayvan davranışlarına temel nöral devre temsilini çözmek, beyin bozukluklarının hayvan modellerinde anormal nöronal aktiviteleri tanımlamak ve bu değiştirilmiş devreleri normalleştirebilecek potansiyel terapötik hedefleri çözmek için kullanılabilecek güçlü bir tekniktir. İki yaygın in vivo kalsiyum görüntüleme sistemi iki fotonlu lazer taramalı floresan mikroskopi 3,4,5,6 ve başa monte minyatür mikroskopi (miniskop)7,8,9,10,11,12,13 . Geleneksel iki foton mikroskobu, daha iyi çözünürlük, daha düşük gürültü ve daha düşük fotobeyazlatma gibi komuta avantajları sunar; ancak deney hayvanlarının kafalarının sabit olması ve yapılabilecek davranış çalışmalarınısınırlayan 3,4,5,6 olması gerekmektedir. Buna karşılık, başa monte miniskop sistemi küçük ve taşınabilirdir, bu da serbestçe davranan hayvanlarıkullanarak çok çeşitli davranış testlerini incelemeyi mümkün kılar 7,8,9,10,11,12,13.
İki önde gelen Ca2+ göstergesi, kimyasal göstergeler5,14 ve genetik olarak kodlanmış kalsiyum göstergeleri (GECI'ler) 15,16 vardır. Ca2+ görüntüleme, hedeflenen devredeki nöronların spesifik olarak etiketlenmesine izin veren viral vektörlerle birlikte verilen oldukça hassas GECI'ler kullanılarak kolaylaştırılmıştır. Hassasiyeti, uzun ömürlülüğü ve hücre altı bölmeleri bile etiketleme yeteneğini arttırmaya yönelik sürekli çaba, GECI'leri çeşitli in vivo kalsiyum görüntüleme çalışmaları için ideal kılmaktadır17,18,19.
Görüntüleme sırasında ışığın beyin dokusuna saçılması, iki fotonlu mikroskopi ile bile optik penetrasyonu derinlemesine sınırlar. Bununla birlikte, Gradient Index (GRIN) lens, GRIN lensi doğrudan biyolojik dokulara gömülebildiği ve derin beyin bölgesinden gelen görüntüleri mikroskop hedefine aktarabildiği için bu sorunun üstesinden gelir. Optik olarak homojen malzemeden yapılmış geleneksel lenslerin aksine ve odaklamak ve görüntü oluşturmak için karmaşık şekilli bir yüzey gerektiren GRIN lens performansı, lens malzemesi içinde düzlem yüzeyi20 ile odaklanmayı sağlayan kademeli bir kırılma indisi değişikliğine dayanır. GRIN lens çapı 0,2 mm'ye kadar üretilebilir. Bu nedenle, minyatür bir GRIN lens, çok fazla hasara neden olmadan derin beyne implante edilebilir.
Bu makalede, derin beyin in vivo kalsiyum görüntülemesi için tam bir cerrahi protokol sunulmuştur. Gösterim amacıyla, özellikle fare beyninin medial prefrontal korteksi (mPFC) ve in vivo kalsiyum görüntüleme kaydını hedefleyen beyin ameliyatlarını, Ulusal Uyuşturucu Bağımlılığı Enstitüsü'ndeki (NIDA / IRP) Dr. Lin'in grubu tarafından geliştirilen özel yapım bir miniskop sistemi aracılığıyla tanımladık7,12. Deneysel prosedür iki büyük beyin ameliyatını içerir. İlk ameliyat, mPFC'de GCaMP6f'yi (bir GECI) eksprese eden bir viral vektörün stereotaksik olarak enjekte edilmesidir. İkinci ameliyat, GRIN lensini aynı beyin bölgesine implante etmektir. Bu beyin ameliyatlarından kurtulduktan sonra, sonraki prosedür, diş çimentosu kullanarak fare kafatasına miniskop tutucusunu (taban) yapıştırmaktır. İn vivo Ca2+ görüntüleme, miniskobu tabanına monte ettikten sonra herhangi bir zamanda gerçekleştirilebilir. Viral enjeksiyon ve GRIN lens implantasyonu için cerrahi protokol, derin beyin in vivo kalsiyum görüntüleme için herhangi bir ticari veya özel yapım tek foton ve iki foton görüntüleme sistemleriyle uyumludur.

<table><tbody><tr><td>0,6 mm ve 1,2 mm matkap çapakları</td><td>KF teknolojisi</td><td>8000037800</td><td>Kraniyotomi</td></tr><tr><td>için 27-G ve 30-G iğne</td><td>BD PrecisionGlide İğne</td><td>REF 305109 ve REF305106</td><td>Her iki ameliyat için</td></tr><tr><td>de 45 açılı forseps</td><td>Güzel Bilim araçları</td><td>11251-35</td><td>Ameliyatlar için</td></tr><tr><td>% 7.5 povidon-iyot çözeltisi (Betadine)</td> <td>Purdue Products L.P.</td><td>NDC 67618-151-17</td><td>Yüzey dezenfektanı</td></tr><tr><td>Aseton</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>179124-1L</td><td>GRIN lens temizleyici</td></tr><tr><td>Agarose</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9539-25G</td><td>GRIN lens implantasyonu için</td></tr><tr><td>Antibiyotik merhem</td><td>Virüs</td><td>enjeksiyonu için</td><td>81073087</td></tr><tr><td>Anti-enflamatuar ilaç (Ibuprofen)</td><td>Johnson & Johnson Consumer Inc</td><td>30043308</td><td>Ameliyatlardan sonra ağrı kesici görevi görür</td></tr><tr><td>GRIN lens implantasyonu için</td><td>AutoStereota</td><td>NIDA / IRP</td><td>github.com/liang-bo/autostereota</td></tr><tr><td>Davranış Yeniden Kodlama Yazılımı (Point Grey FlyCap2)</td> <td>Point Grey</td><td>Point Grey Araştırma Karasinek BFLY-PGE-12A2C</td> Kayıt <td>davranışı için</td></tr><tr><td>Pirinç altıgen somun</td><td>McMASTER-CARR</td><td>92736A112</td><td>GRIN lens implantasyonu için</td></tr><tr><td>GRIN lens implantasyonu için</td> <td>Buprenorfin</td><td>Par Pharmaceuticals</td><td>NDC 4202317905</td></tr><tr><td>Kalsiyum klorür</td><td>Sigma</td><td>10043-52-4</td><td>aCSF</td></tr><tr><td>Komütatörü</td><td>NIDA / IRP</td> hazırlamak için Görüntü <td>elde etme sisteminin</td><td>özel tasarlanmış</td> Bileşeni</tr><tr><td>Basınçlı Oksijen ve Caxbondioxide tankı</td><td>GRIN lens için Rocky Mountain Air Solutions</td><td>BI-OX-CD5C-K</td><td> implantasyon</td></tr><tr><td>Basınçlı Oksijen tankı</td><td>Rocky Mountain Air Solutions</td><td>OX-M-K</td><td>Virüs enjeksiyonu için</td></tr><tr><td>Akülü Microdrill</td><td>KF teknolojisi</td><td>8000037800</td><td>Kraniyotomi için</td></tr><tr><td>Siyanoakrilat</td><td>Henkel İşbirliği</td> <td># 1811182</td><td>GRIN lens implantasyonu için</td></tr><tr><td>Veri toplama denetleyicisi</td><td>NIDA/IRP</td><td>Özel olarak tasarlanmış</td><td>Görüntü elde etme bileşeni sistem</td></tr><tr><td>Veri iletim kablosu</td><td>NIDA/IRP</td> Görüntü <td>elde etme sisteminin</td><td>özel tasarlanmış</td> bileşeni</tr><tr><td>Dental çimento seti</td><td>C& GRIN</td><td>lens implantasyonu için</td>B Metabond ve Katalizör <td>A00253revA306 ve A00168revB306</td></tr><tr><td>GRIN lens implantasyonu için</td><td>diş çimento seti</td><td>Duralay</td><td>2249D</td> GRIN</tr><tr><td>lens implantasyonu için</td><td>deksametazon</td><td>VETone</td><td>NDC 1398503702</td></tr><tr><td>Dekstroz</td><td>Sigma</td><td>50-99-7</td><td>aCSF</td></tr><tr><td>hazırlamak için Diyet jeli</td><td>Şeffaf H20</td><td>72-06-5022</td><td>Diyet Takviyesi fare için</td></tr><tr><td>GRIN lens</td><td>GRINTECH</td><td>NEM-100-25-10-860-S</td><td>GRIN lens implantasyonu için</td></tr><tr><td>Isıtma Yastığı</td><td>Physitemp Instruments LLC.</td><td>#10023</td><td>Ameliyatlar sırasında fare vücudunu sıcak tutmak için</td></tr><tr><td>Anestezi 502017 İzofluran</td><td></td><td>VETone</td><td>V1</td></tr><tr><td></td><td></td><td>501072</td><td>GRIN lens implantasyonu için</td></tr><tr><td>Lidokain</td><td>WEST-WARD</td><td>NDC 0143-9575-01</td><td>Lokal anestezi</td></tr><tr><td>Magnezyum klorür hekzahidrat</td><td>Sigma</td><td>7791-18-6</td><td>aCSF</td></tr><tr><td>Mikrolitre hazırlamak için şırınga (Hamilton)Hamilton</td><td></td> <td>7653-01</td><td>Virüs enjeksiyonu için</td></tr><tr><td>MicroSyringe Pump Controller</td><td>World Hassas Alet</td> <td># 178647</td><td>Virüs enjeksiyonu için</td></tr><tr><td>Miniscope</td><td>NIDA / IRP</td><td>Görüntüleme için</td><td>özel olarak tasarlanmış</td></tr><tr><td>Miniskop tabanı</td><td>Protolabs</td><td>Özel olarak tasarlanmış</td><td>Tabanı monte etmek için</td>Miniskop</tr><tr><td>tutma kolu</td><td>NIDA / IRP</td><td>Özel tasarım Tabanı</td><td>monte etmek için</td></tr><tr><td>Miniskop koruma kapağı</td><td>Protolabs</td><td>Özel olarak tasarlanmış</td><td>Miniskopu korumak için</td></tr><tr><td>Motorlu kontrolör</td><td>Thorlabs</td><td>KMTS50E</td><td>Tabanı monte etmek için</td></tr><tr><td>NeuView</td><td>NIDA/IRP</td><td>https://github.com/giovannibarbera/miniscope_v1.0</td><td>In vivo görüntüleme için</td></tr><tr><td>Oftalmik merhem</td><td>Puralube Veteriner Merhemi</td><td>NDC 17033-211-38</td><td>Oftalmik</td></tr><tr><td>PCR tüpü</td><td>Thermo Scientific</td><td>AB-0622</td><td>GRIN lens implantasyonu için</td></tr><tr><td>Pinch Clamp</td><td>World Precision Instrument</td><td>14040</td><td>Boruyu sıkıştırmak için</td></tr><tr><td>Politetrafloroetilen (PTFE) bant</td><td>TegaSeal PTFE Bant</td><td>AA-58092</td><td>MiniScope'u tabana sabitlemek için</td></tr><tr><td>Potasyum klorür</td><td>Sigma</td><td>7447-40-7</td><td>aCSF Robotik</td></tr><tr><td>kol</td><td>hazırlamak için NIDA/IRP</td><td>GRIN lens implantasyonu için</td><td>özel olarak tasarlanmış</td></tr><tr><td>Saline</td><td>Hospira</td><td>RL 7302</td><td>Her iki ameliyat için de</td></tr><tr><td>Ayar vidası</td><td>DECORAH LLC.</td><td>3BT-P9005-00-0025</td><td>Miniskop tabanındaki pirinç altıgen somunu vidalamak için</td></tr><tr><td>&nbsp; Silikon Kauçuk boru, 0.062 "ID, 1/8" OD</td><td>McMaster</td><td>2124T3</td><td>aCSF</td></tr><tr><td>Sodyum bikarbonat</td><td>Sigma</td><td>144-55-8</td> sulanması <td>için aCSF</td></tr><tr><td>Sodyum klorür</td><td>Sigma</td><td>7647-14-5</td><td>hazırlamak için aCSF</td></tr><tr><td>hazırlamak için Sodyum fosfat monobazik</td><td>Sigma</td><td>7558-80-7</td><td>aCSF Stereotaksik</td></tr><tr><td>aşama</td><td>hazırlamak için KOPF</td><td>Model 962 Çift Ultra Hassas Küçük Hayvan Stereotaksik</td><td>Her iki ameliyat için</td></tr> de<tr><td>Steril pamuklu çubuk</td><td>Puritan</td><td>REF 806-WC</td><td>Her iki ameliyat için</td></tr><tr><td>Cerrahi aletler</td><td>Güzel Bilim araçları</td><td>11251-35</td><td>Ameliyatlar için</td></tr><tr><td>Sütür</td><td>Sofsilk</td><td>REF SS683</td><td>Virüs enjeksiyonu için</td></tr><tr><td>&nbsp; Şırınga filtresi (0.22 & mikro; m)</td> <td>Millex</td><td>SLGVR33RS</td><td>GRIN lens implantasyonu sırasında aCSF'yi filtrelemek için</td></tr><tr><td>Viral süspansiyon (AAV1-CamKII-GCamp6f)</td> <td>Addgene</td><td>100834-AAV1</td><td>Virüs enjeksiyonu</td></tr><tr><td></td><td></td> için <td>Titre: 2.8 X 10 ^ 13 GC / ml</td><td></td></tr><tr><td>Ksilazin</td><td>VETone</td><td>V1 510650</td><td>GRIN lens implantasyonu için</td></tr></tbody></table>

derin beyin in vivo kalsiyum görüntüleme için stereotaksik viral enjeksiyon ve degrade İndeks lens İmplantasyonu

Stereotaxic Viral Injection and Gradient-Index Lens Implantation for Deep Brain In Vivo Calcium Imaging

Minyatür floresan mikroskop (miniskop), serbestçe davranan hayvanlardan in vivo kalsiyum görüntüleme için güçlü bir araçtır. Geleneksel çoklu foton kalsiyum görüntüleme sistemlerine göre çeşitli avantajlar sunar: (1) kompakt; (2) hafif; (3) uygun fiyatlı; ve (4) serbestçe davranan hayvanlardan kayıt yapılmasına izin verir. Bu protokol, özel olarak geliştirilmiş bir miniskop kayıt sistemi kullanarak derin beyin in vivo kalsiyum görüntüleme için beyin ameliyatlarını tanımlar. Hazırlık prosedürü, (1) genetik olarak kodlanmış kalsiyum sensörü ile belirli bir nöron alt grubunu etiketlemek için virüsü bir fare beyninin istenen beyin bölgesine stereotaksik olarak enjekte etmek; (2) kalsiyum görüntüsünü derin beyin bölgesinden miniskop sistemine aktarabilen gradyan indeksli (GRIN) lensin implantasyonu; ve (3) miniskop tutucusunu, miniskobun daha sonra takılabileceği fare kafatasının üzerine yapıştırmak. İn vivo kalsiyum görüntülemeyi gerçekleştirmek için, miniskop tutucuya bağlanır ve eşzamanlı davranış kayıtlarıyla birlikte nöronal kalsiyum görüntüleri toplanır. Mevcut cerrahi protokol, derin beyin in vivo kalsiyum görüntüleme için herhangi bir ticari veya özel yapım tek foton ve iki fotonlu görüntüleme sistemleriyle uyumludur.

Şekil 1, viral enjeksiyon, GRIN lens implantasyonu, miniskop tabanının fare kafatasına yapıştırılması ve bir miniskop aracılığıyla in vivo kalsiyum görüntüleme dahil olmak üzere şematik deneysel prosedürü göstermektedir. Tüm prosedür ~ 2 ay sürer. Şekil 2, miniskop in vivo kalsiyum görüntüleme protokolünde açıklanan ana bileşenleri göstermektedir. Şekil 3, GRIN lens implantasyonu sırasında AutoStereota yazılımının arayüzlerini göstermektedir. Şekil 4, in vivo kalsiyum görüntüleme sırasında NeuView ve davranış kayıt yazılımının arayüzlerini göstermektedir.
İn vivo kalsiyum görüntülemenin sonucu hem viral enjeksiyon hem de GRIN lens implantasyon ameliyatlarının başarısına bağlıdır. Şekil 5 , in vivo kalsiyum görüntüleme kayıtlarından bir dizi sonucu (yani başarısız, optimal olmayan ve iyi) göstermektedir. Başarısız vakalarda, kalsiyum görüntüsü karanlık veya parlak görünebilir, ancak genellikle hiç veya çok az aktif nöron ortaya çıkarır. Beşten az aktif nöron varsa, tipik olarak in vivo kalsiyum kayıt deneylerini takip etmiyoruz. İyi bir in vivo kalsiyum görüntüleme tipik olarak yüzlerce aktif nöronu ortaya çıkarır. Bir kayıt yüzden az aktif nöron içeriyorsa, bunu yetersiz bir kayıt olarak kabul ederiz.
Hem suboptimal hem de iyi kayıtlarda in vivo kalsiyum görüntüleme deneyleri takip edildi ve ardından veri analizi yapıldı. Film 1 , fare mPFC'sinden temsili bir in vivo kalsiyum görüntüleme kaydını gösterir. Davranış videoları ve kalsiyum görüntüleme verileri genellikle ayrı ayrı işlenir. Fare davranışı videoları manuel olarak puanlanabilir. Kalsiyum görüntüleme dosyaları, CaImAn kalsiyum görüntü işleme araç kutusu24 kullanılarak işlenir. Şekil 6 , temsili bir hücre haritasını ve iyi bir in vivo kalsiyum görüntüleme kaydından elde edilen birkaç kalsiyum izini göstermektedir.
İn vivo kalsiyum görüntülemeyi tamamladıktan sonra, son adım, viral enjeksiyon ve GRIN lens implantasyonunun istenen beyin bölgesinde gerçekleşip gerçekleşmediğini doğrulamaktır. Bu amaçla, fare fosfat tamponlu salin (PBS) ve ardından% 4 paraformaldehit (PFA) ile perfüze edildi. Fare beyni hasat edildi, 12 saat boyunca% 4 PFA'ya sabitlendi ve 4 ° C'de PBS'de saklandı. Fare beyni daha sonra bir vibratom ile 50 μm kalınlığında dilimler halinde bölümlendi. Beyin dilimleri DAPI ile boyandı ve mikroskop altında gözlemlendi (protokolde tanımlanmadı)12. Şekil 7, GRIN lensinin implante edildiği izi gösteren, deneysel bir fareden bregma'ya ~ 1.94 mm ön tarafta bir fare beyin dilimidir. GRIN lens izinin altındaki ve etrafındaki yeşil floresan bölgesi, mPFC bölgesindeki GCaMP6f ekspresyonunu gösterir.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63049/63049fig01.jpg"> Şekil 1: Deneysel prosedüre şematik genel bakış . (A) mPFC'de virüsün stereotaksik enjeksiyonu. (B) mPFC'de GRIN lens implantasyonu. (C) Miniskop tabanının fare kafatasına yapıştırılması. (D) Miniskop montajı ve in vivo kalsiyum görüntüleme. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63049/63049fig01large.jpg" target="_blank">Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63049/63049fig02.jpg"> Şekil 2: İn vivo kalsiyum görüntüleme için gerekli ana bileşenler. (A) 1 mm çapında ve 4,38 mm uzunluğunda GRIN lens. (B) Beyin dokusu aspirasyonu için kullanılan 27 G manuel olarak cilalanmış künt uçlu iğne. (C) Robotik kol iğne tutucuya bağlandı. (D) Açıkta kalan GRIN lensi fare kafatasına miniskop tabanının yapıştırılmasına kadar korumak için bir PCR tüpünden özel yapım bir kapak. (E) Altıgen somunlu miniskop tutucu (taban). (F) İplik kısmı PTFE bant ile sarılmış bir miniskop. (G) Tabanına bir kilitleme vidası ile tutturulmuş bir miniskop. (H) Miniskop tutma kolu. (I) Miniskobun XYZ konumlarında hareketini kolaylaştırmak için kullanılan özel yapım bir 3D motorlu kontrolör. (J) Fare in vivo kalsiyum görüntüleme yapmazken açıkta kalan GRIN lensi korumak için tabana tutturulmuş koruyucu bir kapak. (K) Kabloya bağlı miniskop. (L) İn vivo Ca2+ görüntüleme için Veri Toplama Sistemi. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63049/63049fig02large.jpg" target="_blank">Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63049/63049fig03.jpg"> Şekil 3: Katman katman beyin dokusu aspirasyonu sırasında AutoStereota yazılımının arayüzleri. (A) Adım 2.17.1 ila 2.17.3'e karşılık gelen arayüz. (B) Adım 2.17.4 ila 2.17.6'ya karşılık gelen arayüz. (C) 2.17.7 ila 2.17.9 arasındaki adımlara karşılık gelen arayüz. (D) 2.17.10 ila 2.17.12 arasındaki adımlara karşılık gelen arayüz. Kırmızı kutular giriş değerlerini vurgular. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63049/63049fig03large.jpg" target="_blank">Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63049/63049fig04.jpg"> Şekil 4: NeuView yazılımının arayüzleri ve in vivo kalsiyum görüntüleme sırasında davranış kayıt yazılımı. (A) NeuView arayüzü. (B,C) Davranış kayıt yazılımının arayüzleri. Kırmızı kutular, tıklatılması gereken düğmeleri vurgular. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63049/63049fig04large.jpg" target="_blank">Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63049/63049fig05.jpg"> Şekil 5: Olası sonuçların aralığını göstermek için maksimum projeksiyon floresan hücre haritaları . (A,B) Sonraki veri analizi için kabul edilemez başarısız in vivo kalsiyum görüntüleme. (A) karanlıktır ve 5'ten az aktif nöron içerir. (B) parlaktır ancak aktif nöronları yoktur. (C) Bazı aktif nöronları içeren suboptimal bir in vivo kalsiyum görüntülemeden elde edilen hücre haritası. (D) Birkaç yüz aktif nöron içeren iyi bir in vivo kalsiyum görüntülemeden elde edilen hücre haritası. Ölçek çubuğu: 100 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63049/63049fig05large.jpg" target="_blank">Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63049/63049fig06.jpg"> Şekil 6: Başarılı bir in vivo kalsiyum görüntülemeden elde edilen temsili hücre haritası ve kalsiyum geçicileri. Sol panel, açık alan testi sırasında mPFC'deki in vivo kalsiyum görüntüleme kaydından maksimum projeksiyon floresan hücre haritasıdır. Kayıt 5 dakika sürer. Sağ panel, ilgi çekici 15 bölgeden (renk eşli) kalsiyum geçicilerini gösterir. Ölçek çubuğu: 100 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63049/63049fig06large.jpg" target="_blank">Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63049/63049fig07.jpg"> Şekil 7: Deneysel bir farenin ölüm sonrası değerlendirmesi. Deneysel bir farenin mPFC'sinde GCaMP6f ekspresyonu ve GRIN lens implantasyonu için postmortem değerlendirme. Dikdörtgen alan, GRIN lens implantasyonunun yolunu gösterir. GRIN lens implante edilen bölgenin altındaki yeşil alan, GCaMP6f'nin ifade edildiğini ve GRIN lensin tam olarak istenen beyin bölgesine implante edildiğini doğrulamaktadır. Cg, singulat korteks; PrL, prelimbik korteks; IL, infralimbik korteks. Ölçek çubuğu: 400 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63049/63049fig07large.jpg" target="_blank">Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
Tablo 1: NIDA'daki özel yapım miniskop sisteminin diğer miniskop sistemleriyle karşılaştırılması 7,8,9,10,11,13,25,26. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63049/63049_Table%201_1.xlsx" target="_blank">Bu tabloyu indirmek için lütfen tıklayınız.</a>
Film 1: Açık alan testi sırasında fare mPFC'sinden in vivo kalsiyum görüntüleme kaydı. Tanıtım amacıyla, bu video sadece 1 dakikalık kayıt gösterir. Orijinal kayıt kare hızı 10 kare/sn'dir. Video, orijinal kayıttan 6 kat daha hızlıdır. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63049/movie.mp4" target="_blank">Bu Filmi indirmek için lütfen tıklayınız.</a>

Miniskop in vivo kalsiyum görüntüleme, serbestçe davranan farelerde nöronal dinamikleri ve mikro devreleri incelemek için güçlü bir tekniktir. Bu protokol, bir miniskop kullanarak iyi in vivo kalsiyum görüntüleme elde etmek için beyin ameliyatları yapmayı açıklar.

Derin Beyin In Vivo Kalsiyum Görüntüleme için Stereotaksik Viral Enjeksiyon ve Degrade İndeks Lens İmplantasyonu

A miniature fluorescence microscope (miniscope) is a potent tool for in vivo calcium imaging from freely behaving animals. It offers several advantages ...

Miniskop in vivo kalsiyum görüntüleme, araştırmacıların serbestçe davranan hayvanların derin beyin yapılarındaki yüzlerce nörondan mekansal ve geçici olarak koordine edilmiş aktiviteyi incelemelerini sağlar. Miniskop in vivo kalsiyum görüntüleme, hücre tipine özgü, büyük ölçekli ve uzunlamasına kayıtlar yapma yeteneği de dahil olmak üzere birçok avantaj sunar. Viral enjeksiyon ve GRIN lens implantasyonu için cerrahi protokolümüz, derin beyin in vivo kalsiyum görüntüleme için herhangi bir ticari veya özel yapım tek foton ve iki foton görüntüleme sistemi ile uyumludur.Prosedürü gösteren, laboratuvarımdan yüksek lisans öğrencisi olan Rashmi Thapa olacak. Anestezi uygulanan bir farenin tıraş edilmiş cerrahi alanını dezenfekte ettikten sonra, kafatasının lambda ve bregmasını ortaya çıkarmak için orta hat boyunca deriden iki santimetrelik bir kesi yapmak için bir neşter kullanın. 0,5 milimetrelik dental matkap çapağını anterior posterior 1,94 milimetre ve medial lateral 0,5 milimetre pozisyonuna getirdikten sonra, kafatasını delmeye başlayın.Daha sonra, mikro pompanın kontrol panelini kullanarak virüsü mikrolitre şırıngaya yükleyin ve saniyede 50 nanolitre akış hızında 500 nanolitre hava kabarcığı ve ardından 800 nanolitre virüs çekin. İğneyi yavaşça beyin dokusuna 1.75 milimetrelik dorsal ventralin hedeflenen Z koordinatına doğru hareket ettirin ve ardından hafifçe dorsal ventral 1.65 milimetrenin Z koordinatına kadar hareket ettirin. Kontrol panelinde, virüsü enjekte etmek için Çalıştır düğmesine basmadan önce mikro pompayı dakikada 50 nanolitre akış hızında 500 nanolitre virüs enjekte edecek şekilde ayarlayın.Enjeksiyon bittiğinde, cilt kenarlarını hizalayın ve insizyonu 4-0 dikişle dikkatlice kapatın. Enfeksiyonu önlemek için dikişli bölgeye antibiyotik merhem uygulayın. Degrade indeksi veya GRIN lensi implante etmek için, ince makas kullanarak cildin 1,5 santimetre yüksekliğinde ve 1,5 santimetre tabandaki üçgen bir alanını, gözler arasındaki ön taraftan lambda'nın arkasındaki arka tarafa kadar çıkarın.Kafatası iyice temizlendikten ve kurutulduktan sonra, cildin kenarlarına siyanoakrilat uygulayın ve cildi kafatasına takın. Siyanoakrilat kuruduğunda beş dakika sonra, 1.2 milimetre çapında bir diş matkap çapağını anterior posterior 1.94 milimetre, medial lateral 0.8 milimetre pozisyonuna getirin. Kafatasını delin, ardından 30 gauge iğne ucu kullanarak dura'yı çıkarın.Tüm kemik kalıntılarını 45 derece açılı keskin forseps ile temizleyin. Daha sonra, 10 derecelik bir açıyla eğilmiş bir robotik kola bağlı iğne tutucuya manuel olarak parlatılmış bir 27 gauge künt uç iğnesi takın ve iğne tutucunun diğer ucunu ev vakum sistemine bağlayın. Bregma'nın Z koordinatını sıfıra ayarlamak için Bregma düğmesine tıklamadan önce iğnenin ucunu sadece bregma'ya dokunmak için bulun.Giriş X değerini 0,8, giriş Y değerini 1,94, giriş Z değerini 1,0 olarak ayarlayın ve iğneyi kafatasındaki delinmiş deliğin üstüne taşımak için Bul düğmesine tıklayın. İğnenin ucunu delinmiş deliğe ortalayın ve Z pozisyonu sıfıra indirin. Vakumu açın ve maruz kalan beyin bölgesini, bükülmüş uçlu 30 gauge bir iğneye bağlı yerçekimi kontrollü bir boru sistemi aracılığıyla yapay beyin omurilik sıvısı veya ACSF ile durulamaya başlayın.ACSF, 0,2 mikronluk bir filtreden süzülürken,% 95 oksijen ve% 5 karbondioksit gaz karışımı ile sürekli olarak kabarcıklanır. AutoStereota yazılımını kullanarak, beyin dokusunun aspirasyonu dört turda tamamlanacaktır. İlk aspirasyon turu için, Z değerinin sıfır görüntülediğinden emin olun.Ardından zStep oturumunda, birinci ve ikinci satırları tıklayıp kontrol edin. İlk satırın değerlerini 0,2 ve 1 olarak ayarlayın. İkinci satırın değerlerini 0,15 ve 4 olarak ayarlayın.Mod oturumunda, iğne boyutunu 27 ölçer ve 1,2 olarak ayarlayın. Dims 0.9'u ayarlayın. Diğer tüm değerler varsayılan olacaktır.Aspirasyonu başlatmak için sırayla NotSet, KeepZero ve Start düğmelerine tıklayın. İlk aspirasyon turu, 0,8 milimetre derinliğinde ve 1 milimetre çapında bir sütun cebi oluşturur. Üçüncü aspirasyon turunda, zStep oturumu için ilk satırı tıklayıp kontrol edin ve ilk satırın değerlerini 1,8 ve 1 olarak ayarlayın.Mod oturumunda, iğne boyutunu 27 ölçer ve 2,2 olarak ayarlayın. Diğer değerleri önceki turunkiyle aynı tutarak aspirasyona başlayın. Üçüncü aspirasyon turundan sonra, sütun cebinin derinliği 1,8 milimetredir.Son aspirasyon turu, cebin dibinde biriken kanı temizlemektir. zStep oturumunda ilk satırın değerlerini 1,6 ve 1 olarak ayarlayın ve aspirasyona başlamadan önce Mod oturumunda iğne boyutu 27 ölçer ve 2,2 ve Dims 0,6 olarak ayarlayın. Cep kansız hale geldiğinde, vakumu durdurun, ACSF'nin sulanmasını durdurun ve iğneyi Z koordinatında 2 milimetre ve merkeze 0,5 milimetre önden getirin.Steril 1 milimetre GRIN lensi beyin dokusu cebine yerleştirin. Daha sonra, erimiş agarozu GRIN lens ve beyin dokusu arasındaki boşluğa bir spatula yardımıyla uygulayın. Agaroz bir jel oluşturduktan sonra, bir mikro bıçak kullanarak fazla agarozu çıkarın.Diş çimento tozunu ve katalizör sıvısını önceden soğutulmuş bir karıştırma kuyusunda karıştırın ve GRIN lensini çevreleyerek ve daha sonra maruz kalan tüm kafatasını kaplayarak kafatasına kendi kendine sertleşen yapışkan reçine çimento tabakası uygulayın. Temiz bir plastik kutuda, ilk diş çimentosu tabakasının üzerine karışımın ince bir tabakasını uygulamak için diş çimento tozu ve siyah odun kömürünü sıvı ile karıştırın. Beş dakika sertleşmesine izin verin.Miniscope'u kabloya bağlayın ve özel olarak geliştirilen NuView yazılımını açın. NuView'da Donanım'a tıklayın, LED1'i kontrol edin ve canlı görüntüleri görüntülemek için Akış düğmesine tıklayın. Canlı yayını durdurmak için, Durdur düğmesine tıklayın.Ardından, Miniscope'u özel yapım bir Miniscope tutma koluna yerleştirin. Motorlu kontrolörlerin yardımıyla, Miniscope'u açıkta kalan GRIN lensin hemen üzerine yerleştirin ve lensin yüzeyine paralel hale getirin. Miniskopu GRIN lense doğru yavaşça indirin ve en iyi netleme düzlemi bulunana kadar Z konumunu ayarlayın.Miniscope'un konumunu değiştirmeden Miniscope tabanının etrafına ilk diş çimentosu tabakasını uygulayın. Çimento sertleştikten sonra, Miniscope'un fare kafasında kendi başına durabilmesi için tutma kolunu yavaşça çıkarın. Tüm boşlukları doldurmak için tabanın etrafına ikinci bir diş çimentosu tabakası uygulayın, boşluklardan LED ışık sızıntısı olmadığından emin olun.Diş çimentosunun sertleşmesine izin verin. Fareyi izofluran ile kısa bir süre uyuşturduktan sonra, koruyucu kapağı çıkarmadan önce tabandaki kilitleme vidasını küçük bir tornavida ile gevşetin ve GRIN lensin yüzeyini asetonla ıslatılmış pamuklu çubukla temizleyin. Miniscope'u kabloya bağlayın ve künt forseps yardımıyla hafifçe sıkarak veya gevşeterek Miniscope'un tabana göre konumunu ayarlayarak en iyi odak düzlemini tanımlamaya başlamak için NuView yazılımını başlatın.En iyi odak düzlemi belirlendikten sonra, kablonun bağlantısını kesmeden ve fareyi tekrar ev kafesine yerleştirmeden önce kilitleme vidasını sıkın. Fare davranış alanını bir canlı yayın işlevi aracılığıyla görüntülemek için davranış kamerası yazılımını açın. Üst kameranın odağını manuel olarak ayarlayın.Trigger Strobe (Tetikleyici Flaşörü) öğesini seçin ve enable/disable trigger (Tetikleyiciyi etkinleştir/devre dışı bırak) seçeneğini işaretleyin ve ardından Record (Kaydet) düğmesini tıklayın. Ardından, davranış kayıtlarının kaydedileceği konumu seçmek için Gözat'ı kullanın. İstediğiniz görüntü formatını seçin.Fareyi arenaya yaklaştırın ve Miniscope'u veri toplama sistemine bağlı kabloya bağlayın. Ardından fareyi arenanın ortasına yerleştirin. Behavior camera yazılımında, Kaydı Başlat'ı tıklatın.NuView'da LED1'i kontrol edin, Yakala'ya tıklayın ve ardından kayda başlamak için düğmeleri tetikleyin. Bu, kalsiyum görüntüleme ve fare davranışının eşzamanlı olarak kaydedilmesini sağlar. 3.000 kare sonra Durdur'a basın ve dosyaları kaydedin.Kayıt tamamlandığında, fareyi izofluran ile kısaca uyuşturun, Miniscope'u tabandan ayırın ve fareyi ana kafesine geri yerleştirmeden önce koruyucu kapağı tabanın üzerine yerleştirin. Suboptimal in vivo kalsiyum görüntülemeden elde edilen hücre haritası bazı aktif nöronlar içerirken, başarılı görüntülemeden odaklanmış alanda yüzlerce aktif nöron içeriyordu. Başarısız bir in vivo kalsiyum görüntülemenin tipik örneğinde, bölgenin karanlık olduğu ve beşten az aktif nöron içerdiği gözlendi veya bölge parlaktı ancak aktif nöronları yoktu.Temsili analizde, maksimum projeksiyon floresan hücre haritası ve ardışık in vivo kalsiyum görüntüleme kaydından kalsiyum geçicileri gösterilmiştir. Deneysel bir farenin medial PFC'sinde GCaMP6f ekspresyonu ve GRIN lens implantasyonu için postmortem değerlendirme, GCaMP6f'nin eksprese edildiğini ve GRIN lensin tam olarak istenen beyin bölgesine implante edildiğini göstermiştir. İyi bir kalsiyum görüntüleme elde etmek için, GRIN lensini implante etmeden önce kanamanın tamamen durduğundan ve alanın kan pıhtılarından arındırıldığından emin olmak gerekir.Bu teknik, farklı insan beyni bozukluklarının fare modelindeki nöral devre değişikliklerini incelemek ve bir ilaç adayının değiştirilmiş devreyi normalleştirip normalleştiremeyeceğini test etmek için kullanılabilir.

stereotaxic-viral-injection-gradient-index-lens-implantation-for-deep

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Sinirbilim

Neokorteks mikrodevreler ağ dinamiklerini anlamak için, aynı anda çok sayıda nöron aktivitesini kaydetmek için esastır. In vivo iki foton kalsiyum görüntüleme, bir tek hücre çözünürlük ile yoğun bir nöronal nüfusun faaliyet kaydetmenize olanak sağlayan tek yöntem.

Katman In Vivo 2-Foton Kalsiyum Görüntüleme Fare 2 / 3

Bu makalede, 50 mikron lümen cam kılcal iğneler yapmak için bir yöntem gösteriyor. Bu teknik, beyin hasarı önemli ölçüde azaltır, ilaç pasif difüzyon en aza indirir ve kemirgen beyin içine hassas bir hedefleme sağlar.

İlaçlar, Viral Vektörler, veya Hücre Transplantasyon teslimi için Microinjections Derin Beyin Yapıları Hedefleme

Kaynak: Lee, H. et. al., Serbestçe Davranan Farenin Amigdalasında Başa Monte Minyatür Mikroskopla Başarılı İn vivo Kalsiyum Görüntüleme. J. Vis. Uzm. (2020)Bu video, gradyan kırılma indisi veya GRIN lens ve minyatür bir mikroskop kullanılarak bir farede in vivo kalsiyum görüntülemeyi göstermektedir. Kurulum, sürtünmesiz bir mobil kafes sistemi içinde kafa sabitlemesini birleştirir, nöronları uyarır ve kalsiyum iyonu akışını tetikler. GRIN lens, beyindeki kalsiyum sinyalini yakalayarak nöronal...

Serbestçe Hareket Eden Bir Farede Gerçek Zamanlı Mikroendoskopik Kalsiyum Görüntüleme

Kaynak: Thapa, R., et. al., Derin Beyin için Stereotaksik Viral Enjeksiyon ve Gradyan İndeksli Lens İmplantasyonu In Vivo Kalsiyum Görüntüleme.  J. Vis. Uzm. (2021)Video, transdüksiyonlu bir farede bir miniskop kullanarak nöronal aktiviteyi davranışla ilişkilendiren gerçek zamanlı kalsiyum görüntülemeyi göstermektedir.

Bir farenin gerçek zamanlı kalsiyum görüntülemesi Bir miniskop kullanarak medial prefrontal korteks

Burada bir sanal gerçeklik ortamında davranış sırasında fare korteksin iki foton görüntüleme katılan deneysel işlemleri.

Sanal Gerçeklik Çevre gezinme Farelerde iki foton Kalsiyum Görüntüleme

In vivo mikroendoskopik kalsiyum görüntüleme, özgürce davranan hayvanlarda nöronal aktivitelerin gerçek zamanlı izlenmesini sağlayan paha biçilmez bir araçtır. Ancak bu tekniği amigdalaya uygulamak zor olmuştur. Bu protokol, farelerde minyatürleştirilmiş bir mikroskopla amigdala hücrelerini başarıyla hedeflemek için yararlı bir kılavuz sağlamayı amaçlamaktadır.

Özgürce Davranan Farenin Amigdalasında Kafaya Monte Minyatür Mikroskop ile Başarılı In vivo Kalsiyum Görüntüleme

Yetişkin farenin beyin ata tarafından beyin atmasını ortaya çıkarmak için bir protokol sunuyoruz. Minyatür mikroskoplu gradyan-kırılma indeksi lens kullanılarak, in vivo zeytin nöral somata aktivitesini incelemek için kalsiyum görüntüleme kullanılabilir.

In vivo Fare Kalitesiz Zeytinde Kalsiyum Görüntüleme

Kürleme sırasında diş çimentosunun büzülmesi, taban plakasının yerini alır. Bu protokol, taban plakasını çimentolamak için yer bırakan diş çimentosunun ilk temelini oluşturarak sorunu en aza indirir. Haftalar sonra, taban plakası bu iskele üzerinde çok az yeni çimento kullanılarak yerinde çimentolanabilir, böylece büzülme azalır.

Farelerde Kalsiyum Geçici Araştırma için Objektif Lens ile Önceden Sabitlenmiş Bir Taban Kaplaması ve Miniskop Kullanımı

Hipokampusun dentat girusu, öğrenme ve hafızada temel ve farklı işlevleri yerine getirir. Bu protokol, serbestçe hareket eden farelerde dentat girustaki granül hücrelerinin in vivo kalsiyum görüntülemesi için bir dizi sağlam ve verimli prosedürü tanımlar.

Farelerde Hipokampusun Dentat Girusundaki Granül Hücrelerin İn Vivo Kalsiyum Görüntülenmesi 

Bu protokol, sosyal durum manipülasyonu (sosyal izolasyon ve sosyal birleşme) sırasında serbest davranan farelerde minyatürize mikroskop (miniskop) kullanılarak hipotalamik nöronların in vivo kalsiyum görüntülemesini detaylandırır. Bu yöntem, sosyal ihtiyaç ve sosyal doygunluğu temsil eden hipotalamik aktivitenin tek nöron çözünürlükte görüntülenmesini sağlar ve sosyal homeostazın mekanik çalışmalarını mümkün kılar.

In Vivo'da Farelerde Sosyal Davranışları Anlamak İçin Hipotalamus'ta Minyatürize Mikroskopla Kalsiyum Görüntüleme

Öğrenin, serbestçe hareket eden farelerde derin beyin yapılarında yüzlerce nöronun kalsiyum dinamiklerini in vivo görüntülemek için miniskop kullanımını. Bu yöntem, nöron devrelerinin işleyişini uzun süreli kayıtlarla araştırır.

Derin Beyin In Vivo Kalsiyum Görüntüleme için Stereotaksik Viral Enjeksiyon ve Degrade İndeks Lens İmplantasyonu

Daha fazla video keşfet