İmmünopeptidomik: Kütle Spektrometresi Analizi için Fare ve İnsan MHC Sınıfı I ve II İlişkili Peptitlerin İzolasyonu

Bu protokol önemlidir, çünkü herhangi bir laboratuvarın ulaşabileceği ve gerçekleştirmesi kolaydır. Bu protokol, HLA veya MHC tip I veya tip II peptitlerin insan veya fare örneklerinden yalıtını sağlar. Bu yöntem, kanser, viroloji veya otoimmün hastalıklarda olsun, bağışıklık sistemini içeren tüm araştırma alanlarıyla ilgili bilimsel soruları ele alabilir.

Bu protokol, bir araştırma laboratuvarında çalışan herkesin erişebileceği şekilde inşa edildi. Sadece adımları izleyin. Sepharose siyanojen bromür boncuklarını numune başına 80 miligram ağırlığında ve 15 mililitrelik konik bir tüpe aktararak aktive etmeye başlayın.

Beş mililitre bir milimoler hidroklorik asit ekleyin. Pipet, kurutulmuş boncukların yeniden doğuşunu kolaylaştırmak için beş kez yukarı ve aşağı ve ardından konik tüpü 8,5 mililitrelik ek bir milimoler hidroklorik asitle doldurun. Boncukları bir rotator cihazı kullanarak oda sıcaklığında 30 dakika boyunca 20 RPM'de döndürün.

Boncukları oda sıcaklığında iki dakika boyunca 200x G'de santrifüjleyin ve aspirasyonla süpernatantı çıkarın. Boncuk paletine 500 mikrolitre kavrama tamponu ekleyin, ardından boncuk süspansiyonu yeni, iki mililitrelik bir santrifüj tüpüne aktarın ve bir kenara koyun. Antikorları bu boncuklara çarpmak için, seçilen antikorun iki miligramını yeni, iki mililitrelik bir mikrosantrifüj tüpüne ekleyin ve mililitre başına iki miligramlık son bir konsantrasyon elde etmek için bir kavrama tampon çözeltisi ile hacmi bir mililitreye uydurun.

Önceden hazırlanmış boncuk çözeltisini aktarın ve antikor çözeltisine ekleyin. Ardından, mikrosantrifüj tüpünü bir rotator cihazı kullanarak 120 dakika boyunca 20 RPM'de döndürün, boncukları santrifüjleyin, ardından daha önce açıklandığı gibi süpernatantı çıkarın. Şimdi, önce antikor bağlantılı boncukları içeren mikrosantrifüj tüpüne bir mililitre 0,2 mililitre glisin ekleyerek ve bir rotator cihaz kullanarak oda sıcaklığında 60 dakika boyunca 20 RPM'de döndürerek boncukların bloke edilmesine ve yıkanmaya başlayın.

Süpernatantı santrifüjleyıp çıkardıktan sonra, boncukları bir mililitre PBS ile yıkayın, santrifüjleme ile süpernatantı çıkarın ve boncukları kullanıma kadar dört santigrat derecede bir mililitre PBS'de saklayın. MHC sınıf I veya II peptitleri izole etmek için, tüpün altını bir avuç içi ile ısıtarak 100 milyon hücreden oluşan donmuş bir paleti çözün. Palete 500 mikrolitre PBS ekleyin ve süspansiyon homojen olana kadar pipet yukarı ve aşağı.

Süspansiyonu yeni, iki mililitrelik bir mikrosantrifüj tüpüne aktarın ve eşit miktarda hücre liziz tamponu ekleyin. Bir rotator cihazı kullanarak 10 RPM'de dört santigrat derecede 60 dakika döndürün. Hücre lirfatını 18.000x G'de 20 dakika boyunca tam frenle dört santigrat derecede santrifüjleyin ve süpernatantı yeni, iki mililitrelik bir mikrosantrifüj tüpüne aktarın.

Antikor bağlantılı boncukları santrifüjleme ve süpernatantı çıkararak geri kazan. Daha sonra, hücre lisat süpernatantını antikor bağlantılı boncuklara aktarın ve bir rotator cihazı kullanarak gece boyunca 14 ila 18 saat boyunca 10 RPM'de kuluçkaya yatırın. İkinci gün, polipropilen sütununun alt kapağını çıkarın, sütunu polipropilen sütun rafına yerleştirin ve akış toplamak için altına boş bir kap takın.

Şimdi polipropilen kolonu 10 mililitre tampon A ile durulayın ve yerçekimi ile boşalmasına izin verin. Sıvı elution akış hızı çok yavaşsa, polipropilen kolonun alt ucunu daha da kesin. Boncuk/lisat karışımını ölçün ve toplayın ve polipropilen sütununa aktarın.

Sıvı karışımın yerçekimi tarafından ayıklanmasına izin verin. İsteğe bağlı olarak, Batı şişkinliği için 20 mikrolitre aliquot toplayın ve dondurun. Şimdi polipropilen kolonda tutulan boncukları 10 mililitre tampon A ekleyerek ve yerçekimi tarafından ayıklanarak yıkayın.

Polipropilen kolonu raftan çıkarın ve kolon ve tüpü elle tutarak yeni, iki mililitrelik bir mikrosantrifüj tüpünün üzerine yerleştirin. Polipropilen kolonuna %1 TFA'nın 300 mikrolitresini ekleyin ve boncukları beş kez yukarı ve aşağı borulayarak karıştırın. Ardından, elüatları yeni, iki mililitrelik bir mikrosantrifüj tüpüne aktarın.

MHC peptitlerini tuzdan arındırmak ve çıkarmak için, C-18 sütununun üzerine 200 mikrolitre metanol ekleyin ve akıştan atmak için üç dakika boyunca 1, 546x G'de santrifüj ekleyin. C-18 sütununun üzerine %0,1 TFA'da %80 asetonitril 200 mikrolitre ekleyin ve akışı atmak için yine santrifüj ekleyin. Ardından, 200 mikrolitre % 0,1 TFA ekleyin ve akış içinden santrifüjleme ile atın.

Son olarak, MHC peptit komplekslerinin 200 mikrolitresini C-18 sütununun üzerine yükleyin, akışı santrifüjleme ile atın ve tam hacim yüklenene kadar tekrarlayın. Ardından, %0,1 TFA'lık 200 mikrolitre, akışı atmak için santrifüj ekleyin, C-18 sütununu yeni, iki mililitrelik bir mikrosantrifüj tüpüne aktarın ve %0,1 TFA'da %28 asetonitril 150 mikrolitre ekleyerek MHC peptitlerini elüte edin. Santrifüjlemeden sonra, akış akışını yeni, 1,5 mililitrelik bir mikrosantrifüj tüpünde toplayın.

Toplam 450 mikrolitre hacim için elution işlemini iki kez tekrarlayın ve LC-MS-MS tarafından analiz edilene kadar eksi 20 santigrat derecede dondurun. MHC sınıfı I ve II peptitlerin kütle spektrometresinde tanımlanması için bu saflaştırılmış peptitleri kullanın. Boncukların bağlama verimliliği, boncuklar CNBr boncuklarına yaygın olarak bağlandığında, kavramadan önceki antikora kıyasla ışık ve ağır zincirlerin sinyal boyama yoğunluğunda önemli bir azalma ile gösterilmiştir.

Asidik elüasyon sonrası MHC peptit komplekslerinin izolasyonu, anti-HAL-ABC ağır zincir antikoru kullanılarak MHC peptit komplekslerinin güçlü algılama sinyali ile doğrulandı. Mevcut protokol kullanılarak sonuçların birey içi ve bireyler arası tekrarlanabilirliği de tahmin edildi. Üç farklı biyolojik kopyada tespit edilen peptit sayısı için ortalama değişim katsayısı küçüktü, bu da% 1.9 ila% 11 arasında değişiyordu, ancak peptitlerin kimliği önemli ölçüde değişti ve üç biyolojik kopyada tekrar tekrar tespit edilen peptitlerin oranı% 39 ila% 63 arasında değişiyordu Oluşturulan ısı haritaları, tanımlanan peptitlerin tahmini MHC bağlama gücünü gösterdi.

Fare MHC sınıf I ve sınıf II peptitler için, predicated güçlü veya zayıf bağlayıcılar sırasıyla% 89 ve% 87 idi. İnsan HLA sınıf I ve sınıf II peptitler için, predicated güçlü veya zayıf bağlayıcılar sırasıyla% 97 ve% 70 idi. LHC sınıf I ve sınıf II peptitler için fare ve insanın peptit bağlama motifleri de üretildi.

Bu protokolün optimizasyonundan önce, murine MHC sınıf I ve II peptitlerin izolasyonu oldukça zordu. Bu optimize edilmiş protokol, örneğin, rutin olarak birçok farklı, hastalıkla ilgili çalışmanın doğrulanması için kullanılan, vivo fare modellerinden murine MHC sınıfı I ve II peptitlerin izolasyonunun kolaylaştırılmasını kolaylaştıracaktır.