Fare kardiyomiyositlerini sürekli olarak izole etmek için basit ve etkili bir yöntem
November 11th, 2022
Kardiyolojide hücresel ve moleküler fonksiyonel deneyler için altın standart kardiyomiyositlerdir. Bu makalede, fare kardiyomiyositlerini izole etmek için Langendorff dışı tekniğe yapılan uyarlamalar açıklanmaktadır.
Bu teknik daha güvenilir ve verimlidir ve en yaygın kullanılan Langendorff aparat tekniklerine kıyasla kapsamlı bir uygulama veya eğitim gerektirmez. Bu tekniğin temel avantajı, ilk perfüzyon in vivo olarak gerçekleştiği için iskemik zamanı sınırlamasıdır. Bu tekniği uygularken, manifolddaki kabarcıklardan kaçınmak ve sindirim sırasında kalbin aşırı hareketinden kaçınmak önemlidir, bunlar verimi düşürebilir.
Bu tekniği gösteren, Dr. Mark Ziolo'nun laboratuvarında yüksek lisans öğrencisi olan Sarah Sturgill olacak. Yeni hazırlanmış perfüzyon tamponunu kullanarak sıcaklık kontrollü manifoldun temizlenmesiyle başlayın. Bunu yapmak için, 27 gauge'lik bir iğneye vidalayın ve bir luer kilit konektörü kullanarak kabarcıkları temizleyin.
Hiçbir kabarcık kalmadığından emin olun. Kardiyomiyositi izole etmek için, tamamen anestezi uygulanan farenin sternumunu ve orta hatta yanal olarak maruz bırakın, kaburgalardan ve aksilladan proksimal olarak kesin. Daha sonra diyaframı kesin ve kalbi önlemek için sığ kesimler sağlayın.
Sternumu bir hemostatla sıkıştırın ve göğüs boşluğunu ortaya çıkarmak için kaburgaları geriye doğru katlayın. İnferior vena kava'yı hemen kalbe distal kesmeden önce perikardı kalpten yavaşça çıkarın. 27 gauge'lik bir iğne kullanarak bir dakika boyunca kalbin sağ ventrikülüne üç mililitre buz gibi soğuk temizleme tamponu enjekte edin.
Ardından, cımbız kullanarak kalbi tutun. Vücuttan uzağa çekin ve aortun mümkün olduğunca çoğunu açığa çıkarın. Daha sonra yükselen aortu bir hemostat kullanarak kelepçeleyin ve kalbi eksize edin.
Kelepçeli kalbi hızlı bir şekilde 10 mililitre sıcak perfüzyon tamponu içeren bir polipropilen Petri kabının kapağına aktarın. Kelepçeli kalbi destek platformuna yerleştirin ve manifolda bağlı stabilize edilmiş 27 gauge iğne kullanarak beş dakika boyunca sol ventriküle 37 santigrat derecede 10 mililitre sıcaklık kontrollü perfüzyon tamponu enjekte edin. Ardından, kelepçeli kalbi ve destek platformunu yaklaşık beş mililitre sindirim tamponuna sahip bir Petri kabına aktarın.
Giriş şırıngalarını, 25 mililitre sindirim tamponu içeren 50 mililitrelik bir şırınga için değiştirin. Enjeksiyondan önce herhangi bir kabarcığın manifoldunu ve kalan perfüzyon tamponunu temizleyin. İğneyi dikkatlice sol ventrikül tepesindeki aynı iğne pozisyonuna yerleştirin.
Bir perfüzyon pompası yardımıyla, 50 mililitrelik bir şırınga kullanarak 15 dakika boyunca sol ventriküle 37 santigrat derece sindirim tamponu enjekte edin. Çözeltinin sıcaklığını, 37 santigrat derece çözeltiyi çıkarmak için kalibre edilmiş bir su ceketi ile kontrol edin. Ventrikülleri 10 mililitrelik bir behere aktarmadan önce atriyumdan çıkarın.
Beherin içine üç mililitre sindirim tamponu ekleyin ve ventrikülleri keskin makas kullanarak büyük parçalar halinde kesin. Beheri alüminyum folyo ile örtün ve beş dakika boyunca 37 santigrat dereceye kadar önceden ısıtılmış sallanan bir su banyosuna yerleştirin. Süpernatanı attıktan sonra, doku parçalarını üç mililitre sindirim tamponunda yeniden askıya alın ve yaklaşık dört dakika boyunca veya homojen bir karışım elde edilene kadar tritüre edin.
İşiniz bittiğinde, hücreleri 70 mikrometrelik naylon hücre süzgeci kullanarak 50 mililitrelik bir polipropilen tüpe filtreleyin. Naylon hücre süzgecini üç mililitre sindirim tamponu ile yıkayın. Filtratı 14 mililitrelik yuvarlak tabanlı bir polipropilen tüpe geri koyun ve santrifüj edin.
Peletleri üç mililitre durdurma tamponunda yeniden askıya almadan önce süpernatantı atın. Hücre süspansiyonuna, nihai kalsiyum klorür konsantrasyonunu 1.8 milimolar yapmak için 54 mikrolitre 100 milimolar kalsiyum klorür stoğu ekleyin. Canlı hücrelerin 10 dakika boyunca yerleşmesine izin verin ve ölü hücreler içeren süpernatantı çıkarın.
Pelet bir depolama çözeltisinde yeniden askıya alındıktan sonra, hücreler fonksiyonel deneyler ve kültürler için kullanılabilir. İzole hücrelerin parlak alan mikroskop görüntüleri, fare kardiyomiyositlerinin izolasyonunun, membran lekeleri veya yuvarlak kenarları olmayan çubuk şeklinde sessiz hücreler ürettiğini göstermiştir. Hücreler, izolasyon tekniğinin başarısını belirleyen yaklaşık% 80 verim ve yüksek sağkalım oranları göstermiştir.
Başarılı bir izolasyon için, kabarcıkları manifolddan çıkarmak ve iğneyi kalpteki aynı deliğe sokmak en önemlisidir. İzole edildikten sonra, kardiyomiyositler hücresel ve moleküler fonksiyonel deneyler için kullanılabilir.
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
Genel Bakış
Bu makale, kapsamlı bir eğitime ihtiyaç duymadan fare kardiyomiyositlerini izole etmek için güvenilir ve verimli bir teknik açıklamaktadır. Yöntem, in vivo olarak yapılan ilk perfüzyonla iskemik süreyi en aza indirir.
Çalışmanın Temel Bileşenleri
Bilim Alanı
- Kardiyoloji
- Hücresel Biyoloji
- Moleküler Biyoloji
Arka Plan
- Kardiyomiyositler, kardiyolojik hücresel ve moleküler işlevsel deneyler için gereklidir.
- Langendorff tekniği yaygın olarak kullanılmaktadır ancak sınırlamaları vardır.
- Bu makale, izolasyon sürecini iyileştirmek için yapılan uyarlamaları sunmaktadır.
- İskemik süreyi en aza indirmek, daha iyi verim için kritik öneme sahiptir.
Çalışmanın Amacı
- Fare kardiyomiyositlerini izole etmek için Langendorff dışı bir teknik sunmak.
- Bu yöntemin geleneksel tekniklere göre avantajlarını göstermek.
- Araştırmacılar için güvenilir bir protokol sağlamak.
Kullanılan Yöntemler
- İskemik süreyi sınırlamak için in vivo olarak yapılan ilk perfüzyon.
- Taze hazırlanmış perfüzyon tamponu ile sıcaklık kontrollü manifold kullanımı.
- Luer lock konektör kullanılarak manifolddaki kabarcıkların temizlenmesi.
- Verimi korumak için sindirim sırasında kalbin dikkatli kullanılması.
Ana Sonuçlar
- Teknik, Langendorff yöntemlerine göre daha güvenilir ve verimlidir.
- Kapsamlı bir eğitime olan ihtiyacı azaltır.
- İzole edilen kardiyomiyositlerin verimini artırır.
- Bir laboratuvar ortamında bir lisansüstü öğrencisi tarafından gösterilmiştir.
Sonuçlar
- Langendorff dışı teknik, kardiyomiyositlerin izole edilmesi için uygun bir alternatiftir.
- Verimlilik ve güvenilirlik açısından önemli avantajlar sunar.
- Bu yöntem, kardiyoloji ve ilgili alanlardaki araştırmaları geliştirebilir.
Sıkça Sorulan Sorular
Executive Industry Relevance
Consistent isolation of high-quality mouse cardiomyocytes is critical for cardiac target validation and mechanistic de-risking in early discovery. This streamlined, Langendorff-free protocol reduces technical barriers and ischemic artifact, enabling reliable functional assays that inform portfolio triage and predictive confidence. The method supports scalable, reproducible workflows essential for cross-program comparability in cardiovascular R&D.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables robust interrogation of cardiac disease mechanisms using primary mouse cardiomyocytes.
- Reduces technical variability, supporting functional target validation and mechanistic clarity.
- Facilitates predictive confidence in early-stage cardiac biology studies.
Screening & Assay Development
- Provides a reproducible source of viable cardiomyocytes for downstream functional assays.
- Supports standardization of contraction, electrophysiology, and calcium cycling measurements.
- Improves assay readiness and scalability for compound screening platforms.
Translational & Preclinical Research
- Aligns with disease-relevant functional endpoints for translational biomarker studies.
- Enables continuity from discovery through preclinical validation using consistent cell preparations.
- Supports risk-adjusted advancement decisions by reducing biological ambiguity.
Pipeline & Workflow Integration
This isolation protocol fits at the interface of early discovery and assay development, providing high-quality cardiomyocytes for functional testing, screening, and translational research.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and mechanistic de-risking by enabling direct functional analysis of cardiac cells.
- Screening: Delivers reproducible, quantitative outputs for compound evaluation in validated biological systems.
- Analytics: Facilitates measurement of contraction, viability, and electrophysiological parameters for comparative studies.
- Translational Research: Maintains continuity of functional endpoints from in vitro to preclinical models.
- Enterprise Reuse: Establishes a standardized, scalable protocol for repeated use across cardiovascular research programs.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in cardiac target validation.
- Operational Value: Simplifies training requirements and enhances reproducibility across teams.
- Strategic Value: Enables more informed go/no-go decisions and capital-efficient portfolio management.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization and advancement of cardiac programs.
Implementation Considerations
- Requires basic surgical and perfusion skills, but less technical expertise than Langendorff methods.
- Needs temperature-controlled perfusion and digestion infrastructure.
- Demands rigorous bubble removal and consistent needle placement for reproducibility.
- Adaptable to various mouse models and cardiac disease contexts.
- Yield and viability depend on precise handling and timing as described in the protocol.
