Name: İçsel Olarak Düzensiz Proteinlerin Kendi Kendine İlişkilerini Tespit Etmek ve Karakterize Etmek için Paramanyetik Gevşeme Geliştirmesi (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-09-23T15:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 24 s
Description: Keşfedin, içsel olarak düzensiz proteinlerin kendi kendine ilişkilerini tespit etmek ve karakterize etmek için paramanyetik gevşeme geliştirmesini. Bu yöntem, geçici biyomoleküler etkileşimleri atomik çözünürlükte nicelendirmeye olanak tanır.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Yararlı tartışmalar ve teknik yardım için Dr. Jinfa Ying ve Kristin Cano'ya teşekkür ederiz. DSL bir St. Baldrick's Scholar'dır ve St. Baldrick's Foundation'ın (634706) desteğini kabul eder. Bu çalışma kısmen DSL'ye Welch Vakfı (AQ-2001-20190330), Max ve Minnie Tomerlin Voelcker Fonu (DSL'ye Voelcker Vakfı Genç Araştırmacı Hibesi), DSL'ye UTHSA Başlangıç Fonları ve CNJ'ye Çocuk Sağlığı alanında Greehey Yüksek Lisans Bursu tarafından desteklenmiştir. Bu çalışma, San Antonio'daki Texas Üniversitesi Sağlık Bilimleri Merkezi'ndeki Kurumsal Araştırma Çekirdeklerinin bir parçası olan Yapısal Biyoloji Çekirdek Tesislerinde yürütülen ve Araştırma Başkan Yardımcılığı Ofisi ve Mays Kanser Merkezi İlaç Keşfi ve Yapısal Biyoloji Ortak Kaynağı (NIH P30 CA054174) tarafından desteklenen araştırmalara dayanmaktadır.

Protokol için genel gereksinimler: protein saflaştırma tesisleri, UV-Vis spektrometresi, yüksek alanlı NMR spektrometresi ve işletim yazılımı, işlem sonrası analiz yazılımı; NMRPipe32, Sparky 33 (veya CCPN Analizi 34 veya NMRViewJ35).
1. PRE ölçümleri için bir proteinin rekombinant ekspresyonu ve saflaştırılması
<ol><li>İlgilenilen protein için tek bir sistein kalıntısı olacak şekilde bir ekspresyon yapısı tasarlayın. İlgilenilen proteinde farklı pozisyonlarda serbest bir sistein eklemek için çoklu mutasyonlar gerekecektir36.</li>
	<li>Yerleşik bir protokol37 kullanarak ilgilenilen proteinin doğal bolluğu (14N) veya 15N etiketli bir örneğini ifade edin ve saflaştırın. NOT: E. coli ekspresyon sistemleri, 15 N'lik izotopik zenginleştirme, biyomoleküler heteronükleer NMR spektroskopisi için minimum bir gereklilik olduğundan, rekombinant protein ekspresyonu için uygun maliyetli ve sağlam bir yöntem sağlar. Tipik adımlar, minimal ortamda ekspresyon, kromatografik saflaştırma ve afinite saflaştırma etiketinin çıkarılmasıdır. Bu protokol, NMR araştırmaları için uygun kalitede yeterli protein üretebilen sağlam bir ekspresyon ve saflaştırma protokolünün oluşturulduğunu varsayar.<ol><li>Serbest sisteinin reaksiyonunu ve IDP'ler için moleküller arası disülfür bağlarının oluşumunu önlemek için tüm saflaştırma adımlarında tamponlarda 1 mM indirgeyici ajan (DTT veya TCEP) bulundurun. NOT: Bazı sistemler, proteinin spesifik özelliklerinin yanı sıra saflaştırma için seçilen sıcaklık, pH ve tampon sistemine bağlı olarak indirgeyici olmayan koşullara daha toleranslı ve daha az agregasyona eğilimli olabilir38.</li>
		<li>Devam etmeden önce saflaştırma için kullanılan afinite etiketlerini çıkarın, çünkü bunlar proteinle öngörülemeyen şekillerde spesifik olmayan bir şekilde etkileşime girebilir veya muhtemelen yanlışlıkla istenmeyen bir bağlanma bölgesi olarak hizmet edebilecek reaktif sistein kalıntıları içerebilir.</li>
		<li>Çözücü PRE'lerin katkısını değerlendirmek için spin etiketinin çözünür bir versiyonu ile karıştırılmış sistein mutasyon(lar)ı olmadan 15N etiketli bir referans numunesi hazırlayın.</li>
	</ol></li>
</ol>2. 3-Maleimido-PROXYL nitroksit spin etiketinin konjuge edilmesi
<ol><li>Saflaştırılmış proteini 50 mM Tris pH 7 ve 1 mM TCEP içeren gazı alınmış bir tamponda saklayın veya değiştirin; tampon ayrıca protein çözünürlüğüne yardımcı olmak için gerekirse 8 M'ye kadar üre içerebilir. Alternatif olarak, bir protein stok çözeltisini, gazı alınmış 50 mM Tris pH 7 ve 1 mM TCEP tamponunun en az 10 hacim eşdeğerine hızla seyreltin. Spin etiketi eklemeden önce protein konsantrasyonunun en az 100 μM olduğundan emin olun.</li>
	<li>İlgilenilen proteinin 20x molar fazlasına bir stok çözeltisinden 3-Maleimido proxyl ekleyin. Numuneyi ışıktan ve oksijenden koruyun ve gece boyunca oda sıcaklığında veya 4 °C'de inkübe edin; Nazik sallama veya nutasyon, etiketleme verimliliğini artırabilir.</li>
	<li><li> </li><li><li><ol><li> </li><li> </li></ol></li></ol><ol><li><ol><li> </li><li> </li></ol></li><li><ol><li></li><li></li><li> </li></ol></li><li> </li></ol><ol><li> </li><li> <ol><li></ol></li><li></li><li></li><li><ol><li></li><li></li><li></li><li></li><li></li><li></li><li></ol></li><li></li><li></li></ol><ol><li></li><li><ol><li></li><li></li><li> </li></ol></li><li> </li><li></li></ol><ol><li><li><li></li><li><li></li><li><li></li></ol><ol><li></li><li><ol><li></li><li></li><li> </li></ol></li></ol><ol><li></li><li></li><li></li><li> <ol><li></li></ol></li><li></li></ol><ol><li> </li><li> <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/63057/63057eq01.jpg"> <img alt="Equation 2" src="/files/ftp_upload/63057/63057eq02.jpg"></li><li><li> <img alt="Equation 3" src="/files/ftp_upload/63057/63057eq03.jpg"></li><li><li> <img alt="Equation 4" src="/files/ftp_upload/63057/63057eq04.jpg"></li><li></li></ol>

Tüm yazarlar makaleyi okumuş ve onaylamıştır. Herhangi bir çıkar çatışması beyan edilmez.

Kendinden düzensiz proteinler ve PRE kullanan çeşitli bağlanma ortakları arasında düşük popülasyonlarda var olan geçici etkileşimleri karakterize etmek için bir yöntem sunulmuştur. Gösterilen örnekte, protein kendi kendine ilişkilidir ve bu nedenle PRE, moleküller arası ve moleküller arası etkileşimlerin bir kombinasyonundan kaynaklanabilir. Bu yöntem, iki farklı protein arasındaki etkileşimlerin karakterize edilebildiği heterojen numunelere kolayca genişletilebilir. Proteinin farklı bölgelerinin nasıl etkileşime girdiği...

İçsel bozukluk (ID), kendiliğinden stabil ikincil veya üçüncül yapılara katlanmayan, ancak biyolojik olarak aktif olan proteinleri (IDP'ler) veya proteinler (IDR'ler) içindeki bölgeleri tanımlar. Genel olarak, IDP/IDR'lerin işlevi, fizyolojik koşullarda biyomoleküllerle spesifik ancak geri dönüşümlü etkileşimleri kolaylaştırmaktır1. Bu nedenle, IDP'ler ve IDR'ler, çoklu protein komplekslerinin işe alınması, organizasyonu ve stabilizasyonu dahil olmak üzere bir dizi hücresel fonksiyonda yer alır, örneğin, splisozom2'nin montajı ve aktivitesi, DNA hasarı3 bölgelerinde bileşenlerin işe alınması ve organizasyonu, transkripsiyon komplekslerinin4 veya kromatin yeniden şekillendirici BAF5'in işe alınmasının organizasyonu ve stabilizasyonu. Ek olarak, IDP'ler, farklı bağlanma ortakları için rastgele cinsel ilişkilerinin hücresel protein ağları aracılığıyla bilgi aktarımına aracılık etmelerini sağladığı sinyal bağlantı noktalarında bulunur6. Son zamanlarda yapılan çalışmalar, IDR bölgelerinin sıvı-sıvı faz ayırma işlemi yoluyla biyomoleküler kondensatlar oluşturarak kendi kendine birleşme eğilimini de ortaya koymuştur7. ID'yi içeren yukarıda bahsedilen işlevlerin birçoğunun artık kondens oluşumunun bir yönünü de içerdiği düşünülmektedir8. ID'nin biyomoleküler kompleks montajı, stabilizasyonu, iskelesi ve sinyal iletimi için önemine rağmen, IDP'ler ve IDR'ler tipik olarak x-ışını kristalografisi veya kriyojenik elektron mikroskobu kullanılarak yapısal araştırmalara uygun olmadığından, spesifik etkileşimlerinin atomik ayrıntılarının tanımlanması zordur.
Nükleer manyetik rezonans (NMR), sert veya homojen yapısal toplulukların varlığına bağlı olmadığı, ancak tek tek çekirdeklerin yakın yerel ortamı hakkında rapor verdiği için ID'yi araştırmak için ideal bir tekniktir. Belirli bir moleküldeki bir çekirdeğin rezonans frekansı veya kimyasal kayması, yerel elektronik dağılımın neden olduğu zayıf manyetik alanlardan etkilenir ve bu da bağ uzunluklarına, açılarına, diğer çekirdeklerin yakınlığına, bağlanma ortaklarıyla etkileşimlere ve diğer faktörlerebağlıdır 9. Böylece, her çekirdek, yerel kimyasal ortamındaki değişikliklere duyarlı, benzersiz, bölgeye özgü bir yapısal prob görevi görür. Bu avantajlara rağmen, NMR bir yığın tekniğidir ve gözlemlenen kimyasal kayma, belirli bir çekirdek tarafından örneklenen tüm ortamların ortalamasıdır. Birçoğu bu sayıda açıklanan bir dizi NMR tekniği, ortalama kimyasal kaymada10,11 bulunan yüksek enerjili, düşük nüfuslu biyomoleküler konformasyonlar hakkında yapısal, dinamik ve kinetik bilgileri geri kazanmak için geliştirilmiştir. Geçici olarak doldurulmuş olmasına rağmen, bu durumların tanımlanması ve ölçülmesi, işlevsel mekanizmaların ayrıntılarını belirlemek için önemlidir12. Örneğin, IDP'ler ve IDR'ler söz konusu olduğunda, konformasyonel topluluk, fizyolojik bağlanma ortaklarıyla karşılaşma komplekslerinin oluşumu için üretken olan konformasyonları tercihen örneklemek için önyargılı olabilir. Bu durumların tespiti ve kalıntıya özgü moleküller arası ve moleküller arası etkileşimlerin ve dinamiklerin tanımlanması, protein fonksiyonunun ve kompleks oluşumunun altında yatan yapısal mekanizmaları belirlemek için önemlidir.
IDP/IDR aracılı biyomoleküler komplekslerin oluşumu için önemli olan geçici, düşük nüfuslu durumları araştırmak için paramanyetik gevşeme geliştirme (PRE) NMR'yi kullanmak için bir protokol açıklanmaktadır13. Bu yaklaşım, α-sinüklein 14,15'ten amiloid fibrillerin montajını veya FUS16'nın kendi kendine birleşmesini destekleyenler gibi geçici protein-protein etkileşimlerini incelemek ve ayrıca sinyal proteinleri 17 arasındaki gibi spesifik protein-protein etkileşimlerini karakterize etmek için kullanışlıdır. Spesifik moleküller arası ve moleküller arası etkileşimlerin tercihli olarak sıkıştırılmış durumların yanı sıra kendi kendine birleşmeyi yönlendiren bölgeye özgü etkileşimlerle sonuçlandığı, kendi kendini ilişkilendiren bir IDP örneği sunulmaktadır.
PRE, bir çekirdeğin, genellikle bir nitroksit grubu üzerinde eşleşmemiş bir elektron şeklinde veya bir paramanyetik metal atomu18 olarak sağlanan izotropik bir g-tensörü ile bir paramanyetik merkeze manyetik dipolar etkileşiminden kaynaklanır (Şekil 1). Anizotropik g-tensörlü atomlar da bir PRE etkisi üretirken, bu sistemlerin analizi, yalancı temas kaymaları (PCS) veya artık dipolar eşleşmenin (RDC) katkıda bulunduğu karıştırıcı etkiler nedeniyle daha zordur13,19. Bir çekirdek ile paramanyetik merkez arasındaki etkileşimin gücü, ikisi arasındaki <r-6> mesafesine bağlıdır. Bu etkileşim, nükleer gevşeme oranlarında bir artışa neden olur, bu da uzun menzilli etkileşimler (~ 10-35 Å) için bile tespit edilebilir çizgi genişlemesine neden olur, çünkü eşleşmemiş elektronun manyetik momenti çok güçlüdür20,21. PRE ile geçici durumların tespiti, aşağıdaki iki koşulun karşılanması durumunda mümkündür; (1) geçici etkileşim, NMR zaman ölçeğinde hızlı bir değişim içindedir (gözlemlenen kimyasal kayma, değiş tokuş durumlarının nüfus ağırlıklı ortalamasıdır); ve (2) çekirdeklerin paramanyetik merkez mesafesi, geçici nüfuslu durumda ana durum11'den daha kısadır. Enine PRE, Γ2 ile gösterilir ve pratik amaçlar için, bir paramanyetik merkez içeren bir numune ile bir diyamanyetik kontrol arasındaki 1H enine gevşeme oranlarındaki farktan hesaplanır. Hızlı ve yavaş değişim rejimlerinde PRE teorisinin ve ilgili sözde temas kaymalarının derinlemesine bir tedavisi için, okuyucu Clore ve çalışma arkadaşları13,22 tarafından yapılan kapsamlı incelemelere yönlendirilir. Burada sadece 1H N-Γ2'nin hızlı değişim rejiminde olduğu durum dikkate alınır, burada PRE'nin r-6 bağımlılığı nedeniyle, gözlenen gevşeme oranı hem paramanyetik merkezin çekirdeğe yaklaştığı mesafe hem de bu konformasyonda geçirdiği süre ile ilgilidir. Bu nedenle, yakın bir yaklaşım içermeyen geçici konformasyonlar küçük bir PRE üretirken, daha yakın etkileşimler, kısa ömürlü olsa bile, daha büyük bir PRE üretecektir.
IDP'ler için PRE, tek bir molekül içinde (molekül içi) ve ayrı moleküller (termoleküler) arasında meydana gelen etkileşimleri ölçmek ve ayırt etmek için kullanılır. Bir NMR görünür (örneğin, 15N-etiketli) veya NMR görünmez (örneğin, doğal bolluk 14N) proteinine bir paramanyetik merkez ekleyerek, PRE'nin kaynağı (moleküller arası veya moleküller arası) belirlenebilir (Şekil 2). Bir sistein kalıntısı ekleyen bölgeye yönelik mutajenez, bir proteine bir paramanyetik merkez (spin-label) eklemek için uygun bir yaklaşımdır23. Metal şelatlama (EDTA bazlı) ve serbest radikal (nitroksit bazlı) dahil olmak üzere spin etiketleri olarak kullanılmak üzere çeşitli molekül türleri önerilmiştir24. Çeşitli nitroksit spin etiketleri tanımlanmıştır ve methanetiosülfonat, maleimid ve iyodoasetamid25,26 gibi farklı sistein reaktif kimyaları ile mevcuttur (Şekil 1). Etiketin veya bağlayıcının doğal esnekliği belirli analizler için sorunlu olabilir ve bu durumlarda, etiketin hareketini sınırlamak için hacimli kimyasal gruplar eklemek veya etiketi proteine sabitlemek için ikinci bir bağlayıcının kullanılması gibi farklı stratejiler önerilmiştir (iki bölge eki)27, 28. Ek olarak, ticari olarak temin edilebilen etiketler diastereomerik proteinler içerebilir, ancak genellikle bu, gözlemlenen PRE29'a katkıda bulunmayacaktır. Maleimid kimyası yoluyla serbest bir sisteine bağlanan 3-Maleimido-PROXYL'in kullanımı, kolayca temin edilebildiği, uygun maliyetli, geri dönüşümsüz olduğu ve indirgeyici ajan tris (2-karboksietil) fosfin (TCEP) etiketleme reaksiyonu boyunca çözelti içinde tutulabildiği için açıklanmaktadır. 3-Maleimido-PROXYL izotropik bir g-tensöre sahip olduğundan, hiçbir PCS veya RDC indüklenmez ve aynı kimyasal kayma atamaları hem paramanyetik hem de diyamanyetik numuneleriçin kullanılabilir 13.
1H N-T2, daha önce 8 ila 12 zaman noktasından oluşan tam bir evrim serisini toplamak kadar doğru olduğu gösterilen iki zaman noktası stratejisi (T a, Tb) kullanılarak ölçülür30. İlk zaman noktası (T a) pratik olarak sıfıra yakın olarak ayarlanır ve ikinci zaman noktasının optimum uzunluğu, belirli bir numune için beklenen en büyük PRE'nin büyüklüğüne bağlıdır ve şu şekilde tahmin edilebilir: Tb ~ 1.15/(R 2,dia + Γ 2) burada R2,dia, diyamanyetik numunenin R2'sini temsil eder13. En büyük PRE'lerin büyüklüğü bilinmiyorsa, Tb'yi proteinin 1 H T2'sinin ~bir katına ayarlamak iyi bir başlangıç tahminidir ve sinyali gürültüye iyileştirmek için T2'yi ayarlayarak daha da optimize edilir. Bu iki noktalı ölçüm stratejisi, PRE'leri ölçmek için gereken deneysel süreyi önemli ölçüde azaltır ve özellikle moleküller arasındaki spesifik olmayan temasların etkilerini en aza indirmek için nispeten seyreltik numuneler kullanıldığından, daha fazla sinyal ortalaması için zaman sağlar. 1H N-T2'yi ölçmek için HSQC tabanlı bir darbe dizisi kullanılır ve başka bir yerdeayrıntılı olarak açıklanmıştır 30. Daha iyi hassasiyet için, ileri ve geri BECERIKLİ transferlerin sert darbeleri şekilli darbelerle değiştirilebilir; alternatif olarak, dizi kolayca TROSY tabanlı bir okuma31'e dönüştürülür. IDP'ler tipik olarak, benzer büyüklükteki küresel proteinlerden daha dar çizgi genişliklerine (doğal bozukluk nedeniyle) neden olan çok daha uzun enine gevşeme oranlarına sahip olduklarından, spektral çözünürlüğü iyileştirmek ve IDP'lerin doğasında bulunan kimyasal kayma dağılım sınırlamasını hafifletmek için dolaylı boyutta uzun alım süreleri kullanılabilir.
PRE, protein-protein ve protein-nükleik asit etkileşimlerini, özellikle geçici veya düşük nüfuslu etkileşimleri incelemek için yararlı bir araçtır. Protein saflaştırma, sahaya yönelik spin etiketleme, nabız programının ayarlanması ve kalibre edilmesi, NMR verilerinin işlenmesi ve yorumlanması dahil olmak üzere PRE'leri ölçmek için uygun bir NMR numunesinin hazırlanması için ayrıntılı bir protokol sağlanır. Numune konsantrasyonu, spin etiketinin seçimi ve paramanyetik bileşenlerin çıkarılması dahil olmak üzere veri kalitesini ve deneysel sonucu etkileyebilecek önemli deneysel hususlar not edilmiştir.

<table><tbody><tr><td>0.45 ve mikro; m ve 0.22 &mikro; m şırınga filtreleri</td><td>Millipore Sigma</td><td>SLHVM33RS SLGVR33RS</td><td>İlk saflaştırma adımından önce ve boyut dışlama kromatografisinden önce lizatı filtreleyin.</td></tr><tr><td>100 mm Petri Kabı</td><td>Fisher</td><td>FB0875713</td><td>bakteri dönüşümü için Agar plakaları.</td></tr><tr><td>14N Amonyum klorür</td><td>Sigma Aldrich</td><td>576794</td><td>M9 ortamında 15N kullanımı bir NMR görünür proteini üretecektir, 14N bir NMR görünmez proteini üretecektir</td></tr><tr><td>15N Amonyum klorür</td><td>Sigma Aldrich</td><td>299251</td><td>M9 ortamında 15N kullanımı NMR görünür bir protein üretecektir, 14N bir NMR görünmez protein üretecektir</td></tr><tr><td>3 L Fernbach şaşkın şişe</td><td>Corning</td><td>431523</td><td>Bakteriyel ekspresyon kültürü</td></tr><tr><td>3-Maleimido-Proxyl</td><td>Sigma Aldrich</td><td>253375</td><td>Nitroksit spin etiketi</td></tr><tr><td>50 mL konik santrifüj tüpleri</td><td>Thermo Fisher</td><td>14-432-22</td><td>Çözelti/protein depolama</td></tr><tr><td>Amicon santrifüj filtre</td><td>Millipore Sigma</td><td>UFC900308</td><td>Protein konsantrasyonu</td></tr><tr><td>Ampicillan</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A5354</td><td>Seçici bir belirteç için antibiyotik, kesin seçim ifade yapısına bağlıdır plazmit</td></tr><tr><td>Analitik terazi</td><td>Oahus</td><td>30061978</td><td>Explorer Pro, reaktifleri tartmak için</td></tr><tr><td>Askorbik asit</td><td>Sigma Aldrich</td><td>AX1775</td><td>Nitroksit spin etiketini azaltır</td></tr><tr><td>Otoklav</td><td></td><td></td><td>Cam eşyaları ve kültür ortamını sterilize edin</td></tr><tr><td>Kalsiyum klorür</td><td>Sigma Aldrich</td><td>C4901</td><td>M9 ortam bileşeni</td></tr><tr><td>Santrifüj şişeleri</td><td>Thermo Fisher</td><td>010-1459</td><td>Rekombinant protein ekspresyonundan sonra E. coli hücrelerini hasat</td></tr> edin <tr><td>Santrifüj, el krank</td><td>Thomas Scientific</td><td>0241C68</td><td>NMR tüplerini barındırabilen 15 mL'lik kovalara sahip Boekel el tahrikli, düşük hızlı santrifüj</td></tr><tr><td>Chelex 100</td><td>Sigma Aldrich</td><td>C7901</td><td>Kirletici paramanyetik bileşikleri tampon çözeltilerinden çıkarın</td></tr><tr><td>NMR</td><td>veri işleme ve analiz yazılımı paketleri ile uyumlu bilgisayar</td>iş istasyonu <td></td><td></td> Linux veya Mac OS, NMRPipe ve Sparky</tr><tr><td>Deuterium oksit</td> gibi yazılım paketleri <td>Sigma Aldrich</td><td>151882</td><td>NMR kilit sinyali için gereklidir</td></tr><tr><td>Dekstroz</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D9434</td><td>M9 medya bileşeni</td></tr><tr><td>Dibazik Sodyum Fosfat</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S5136</td><td>M9 medya bileşeni</td></tr><tr><td>Ellman reaktifi (5,5-dithio-bis-(2-nitrobenzoik asit)</td><td>Thermo Fisher</td><td>22582</td><td>Serbest sistyen kalıntılarının miktar tayini</td></tr><tr><td>Yüksek hızlı santrifüj tüpleri</td><td>Thermo Fisher</td><td>3114-0050</td><td>Bakteri lizatını temizlemek için kullanılır.</td></tr><tr><td>Yüksek alanlı NMR cihazı (600 - 800 MHz)</td><td>Bruker</td><td></td><td>Çok kanallı kriyojenik prob ve sıcaklık kontrolü</td></tr><tr><td>IMAC sütunu ile donatılmış HisTrap FF</td><td>Cytvia</td><td>17528601</td><td>Ham bakteriyel lizat</td></tr><tr><td>İzopropil BD-tiyogalaktozitin (IPTG)</td> ilk fraksiyonasyonu <td>Sigma Aldrich</td><td>I6758</td> Lak operatörü LB agar <td>Thermo'nun kontrolü altındaki genler için protein ekspresyonunu indükler</td></tr><tr><td></td><td> Fisher</td><td>22700025</td><td>Maddeleri, E. coli'yi ilgilenilen proteini ifade edecek şekilde dönüştürmek için kullanılır, bu öğelerden herhangi biri için benzer ürünlerle ikame edilebilir.</td></tr><tr><td>LB suyu</td><td>Thermo Fisher</td><td>12780052</td><td></td></tr><tr><td>Düşük basınçlı kromatografi sistemi</td><td>Bio-Rad</td><td>7318300</td><td>BioRad BioLogic, IMAC sütunlarını çalıştırmak gibi düşük basınçlı chomatograph için kullanılır</td></tr><tr><td>Magnezyum sülfat</td><td>Sigma Aldrich</td><td>M7506</td><td>M9 medya bileşeni</td></tr><tr><td>Orta basınçlı kromatografi sistemi</td><td>Bio-Rad</td><td>7880007</td><td>Çok dalga boylu bir dedektör, pH ve iletkenlik monitörleri ve otomatik fraksiyon toplayıcı ile donatılmış BioRad NGC</td></tr><tr><td>MEM vitamin çözeltisi</td><td>Sigma Aldrich</td><td>M6895</td><td>M9 medya bileşeni</td></tr><tr><td>Mikroakışkanlaştırıcı</td><td>Avestin</td><td>EmulsiFlex-C3</td><td>Hızlı ve verimli bakteri hücresi lizisi sağlar</td></tr><tr><td>Mikropipetler</td><td>Termo Balıkçı</td><td></td><td>Uygun şekilde oturan tek kullanımlık uçlara sahip kalibre edilmiş mikropippetter seti (örneğin Eppendorf gibi birden fazla üreticiden temin edilebilir)</td></tr><tr><td>Monobazik potasyum fosfat</td><td>Sigma Aldrich</td><td>1551139</td><td>M9 ortam bileşeni</td></tr><tr><td>NMR pipetleri</td><td>Sigma Aldrich</td><td>255688</td><td>Numuneyi NMR tüpünden çıkarmak için</td></tr><tr><td>NMR numune tüpü</td><td>NewEra</td><td>NE-SL5</td><td>Yüksek alanlı NMR spektrometreleri</td></tr> <tr><td>için uygundurHazırlayıcı Santrifüj</td><td>Beckman Coulter</td><td>Avanti J-HC</td><td>Rekombinant protein ekspresyonundan sonra E. coli hücrelerini hasat</td></tr> edin <tr><td>Yuvarlak tabanlı polistiren santrifüj tüpleri</td><td>Corning</td><td>352057</td><td>Berrak bakteri lizatı</td></tr><tr><td>Çalkalama inkübatörü</td><td>Eppendorf</td><td>S44I200005</td><td>E. coli starter ve ekspresyon kültürlerinin sıcaklık kontrollü büyümesi</td></tr><tr><td>Sodyum klorür</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S5886</td><td>M9 medya bileşeni</td></tr><tr><td>Sonikasyon su banyosu ve vakum kaynağı</td><td>Thomas Scientific</td><td></td><td>Tampon çözeltilerinin gazını gidermek için kullanılır</td></tr><tr><td>Sonicator</td><td>Thermo Fisher</td><td>FB505110</td><td>Bakteriyel hücre lizisi veya bakteriyel DNA'nın kesilmesi için kullanılır</td></tr><tr><td>Spektrofotometre</td><td>Implen</td><td>OD600 Dilufotometre</td><td>E.coli protein ekspresyon kültürlerinin büyümesini izleyin</td></tr><tr><td>Superdex 200 16/600 boyut eksizyonu sütun</td><td>Cytvia</td><td>28989333</td><td>Son protein saflaştırma adımı</td></tr><tr><td>Topspin yazılımı, sürüm 3.2 veya üstü</td><td>Bruker</td><td></td><td>NMR cihazı için işletim yazılımı</td></tr><tr><td>Dönüşüm yetkin E. coli hücreleri</td><td>Thermo Fisher</td><td>C600003</td><td>Tek Atış BL21 Yıldız (DE3) kimyasal olarak yetkin E. coli, diğer suşlar uyumlu olabilir</td></tr><tr><td>Tris (2-karboksietil) fosfin (TCEP)</td> <td>ThermoFisher</td><td>20490</td><td>Bazı sülfhidril-reaktif konjugasyonlarla uyumlu indirgeyici ajan</td></tr><tr><td>UV-Vis spektrofotometresi</td><td>Implen</td><td>NP80</td><td>Protein konsantrasyonunu ölçün.</td></tr><tr><td>Su banyosu, sıcaklık kontrollü</td><td>ThermoFisher</td><td>FSGPD25</td><td>Bakteri dönüşümünün ısı şoku basamağı için</td></tr><tr><td>Maya özü</td><td>Sigma Aldrich</td><td>Y1625</td><td>Gerekirse M9 ortamını desteklemek için</td></tr></tbody></table>

İçsel olarak düzensiz proteinlerin kendi kendine İlişkilerini tespit etmek ve karakterize etmek için paramanyetik gevşeme geliştirmesi

Paramagnetic Relaxation Enhancement for Detecting and Characterizing Self-Associations of Intrinsically Disordered Proteins

Proteinler içindeki doğal olarak düzensiz proteinler ve içsel olarak düzensiz bölgeler, insan proteomunun büyük ve işlevsel olarak önemli bir bölümünü oluşturur. Bu dizilerin oldukça esnek doğası, çeşitli biyomoleküler ortaklarla zayıf, uzun menzilli ve geçici etkileşimler oluşturmalarına izin verir. Spesifik ancak düşük afiniteli etkileşimler, rastgele bağlanmayı teşvik eder ve özünde düzensiz tek bir segmentin çok sayıda hedef bölgeyle etkileşime girmesini sağlar. Bu etkileşimlerin geçici doğası nedeniyle, tek ve baskın bir konformasyon oluşturmak için proteinlere dayanan yapısal biyoloji yöntemleriyle karakterize edilmeleri zor olabilir. Paramanyetik gevşeme geliştirme NMR, zayıf ve geçici etkileşimlerin yapısal temelini tanımlamak ve tanımlamak için yararlı bir araçtır. Doğası gereği düzensiz proteinler ile bunların proteini, nükleik asidi veya diğer biyomoleküler ortakları arasında oluşan düşük nüfuslu karşılaşma komplekslerini karakterize etmek için paramanyetik gevşeme geliştirmesini kullanmak için ayrıntılı bir protokol açıklanmaktadır.

Molekül içi 1HN-Γ 2 PRE'ler, RNA bağlayıcı protein EWSR142'nin düşük karmaşıklık alanından türetilen, kendi kendine birleşen, içsel olarak düzensiz bir fragman (kalıntılar 171-264) üzerine kaydedildi (Şekil 3). Spin-etiket bağlantı noktasına yakın sıralı kalıntıların (örneğin, Şekil 3'teki kalıntı 178 veya 260) önemli ölçüde genişlemesi beklenir ve spektrumda tespit edilemez. Bağlantı noktasından ...

Doğası gereği düzensiz proteinlerde zayıf ve geçici moleküller arası ve moleküller arası etkileşimleri tespit etmek için paramanyetik gevşeme geliştirme NMR spektroskopisinin uygulanması için bir protokol sunulmaktadır.

İçsel Olarak Düzensiz Proteinlerin Kendi Kendine İlişkilerini Tespit Etmek ve Karakterize Etmek için Paramanyetik Gevşeme Geliştirmesi

Intrinsically disordered proteins and intrinsically disordered regions within proteins make up a large and functionally significant part of the human ...

Paramanyetik gevşeme geliştirme tekniği, moleküller arası mesafeleri karakterize etmek ve ölçmek ve geçici ve/veya düşük nüfuslu biyomoleküler etkileşimleri ölçmek için kullanılabilir. Burada, protein yoğunlaşmasından önceki etkileşimleri yakalamak için bu tekniği uyguladık. PRE'lerin hassasiyeti, diğer NMR teknikleri tarafından görünmez ve erişilemez kalan dinamik durumun atomik çözünürlüğün tanımlanmasını, algılanmasını ve ölçülmesini sağlar.Bu protokoldeki temel adımlar, konjuge olmayan nitroksit spin etiketinin çıkarılmasını ve tepe yüksekliğini doğru bir şekilde ölçmek için spektrumların dikkatlice analiz edilmesini içerir. Ek olarak, NMR deney kurulumu ve darbe kalibrasyonu sırasında dikkatli olunmalıdır. Başlamak için, ilgilenilen 15N izotopik olarak etiketlenmiş proteinin 20 katı molar fazlalığında bir stok çözeltisinden 3-maleimido-PROXYL ekleyin.Gece boyunca oda sıcaklığında veya dört santigrat derecede, ışıktan ve oksijenden korunarak ve hafif sallanma veya nütasyon ile inkübe edin. Ertesi gün, protein örneğinin kapsamlı diyalizini veya jel filtrasyonunu kullanarak spesifik olmayan çözücü PRE'yi önlemek için reaksiyona girmemiş serbest sıkma etiketini çıkarın. Ardından,

paramagnetic-relaxation-enhancement-for-detecting-characterizing-self

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Biyokimya

Bu deneyin amacı, belirlemek ve su içerisinde kendi kendine monte diskotik amfifiler büyüklüğü, şekli ve stabilite kontrol etmektir. Su bazlı supramoleküler polimerler için bu kontrol seviyesi çok zordur. Biz itici ve çekici etkileşimleri hem kullanarak bir strateji uygulamak. Bu sistem karakterize etmek için uygulanan deney yöntemleri genel olarak uygulanabilir.

Su Supramoleküler Polimerlerin Boyut, Şekil ve Stabilite Kontrolü

Bu makale, Elektron Paramanyetik Rezonans çalışmaları için pentamerik ligand kapılı kanalların bölgeye yönelik spin etiketleme ve yeniden yapılandırma yöntemlerini açıklar. Bu protokol herhangi bir zar proteini için uyarlanabilir. Burada açıklanan sulandırma yöntemi, tanımlanmış bir lipit sistemindeki makroskopik ve tek kanallı akımların yama-kelepçe ölçümleri için de kullanılabilir.

Site Yönetmen Spin Etiketleme ve pentameric ligand-kapılı iyon Kanallarının EPR Spektroskopik Çalışmaları

Burada, Tau proteinini bir vaka çalışması olarak kullanarak, Nükleer Manyetik Rezonans Spektroskopisi (NMR) ile içsel olarak düzensiz bir proteinin çoklu fosforilasyonlarını tanımlamak için bir yöntem açıklıyoruz. Rekombinant Tau, veri toplama ve analizinden önce bir kinaz ile in vitro olarak izotopik olarak zenginleştirilir ve modifiye edilir.

Özünde Düzensiz Proteinlerin Çoklu fosforilasyon Saptanma Nükleer Manyetik Rezonans Spektroskopisi

Supramolecular protein derlemeler atomik çözünürlükte yüksek alaka nedeniyle çok önemli rolleri biyolojik olayları çeşitli yapılardır. Burada, biz bir protokol tarafından magic-açı katı hal Nükleer manyetik rezonans spektroskopisi (MAS SSNMR) iplik çözünmez ve kristal makromoleküllerin protein derlemeler üzerinde yüksek çözünürlüklü yapısal çalışmalar gerçekleştirmek için mevcut.

Atomik yapısal çalışmaların makromoleküllerin meclisleri tarafından katı hal Nükleer manyetik rezonans spektroskopisi

Hızlı alan döngüsü netometrisi kullanarak, dinamik nükleer polarizasyon yoluyla hiperpolarize edilmiş 13C'lik zenginleştirilmiş bileşiklerin spin-kafes gevşeme süresinin manyetik alan bağımlılığını ölçmek için bir protokol sayılmaktadır. Özellikle, bunu[1-13C] pirüuvat ile gösterdik, ancak protokol diğer hiperpolarize substratlara genişletilebilir.

Hiperpolarize Spin-Kafes Gevşeme manyetik alan bağımlılığının ölçülmesi [1-13C]pirüuvat

Burada 15 Ngevşeme dispersiyon profillerinin çözelti NMR spektroskopisi ile edinilmesi ve analizi için laboratuvarda uygulanan protokolün detaylı bir açıklaması sağlanmaktadır.

15 μs-ms Zaman Ölçeğinde Protein Konformasyonsal Dinamiklerinin Araştırılması için N CPMG Gevşeme Dağılımı

Burada, çözeltideki protein-glikan etkileşimlerini karakterize etmeyi amaçlayan bir dizi NMR deneyinin elde edilmesini, işlenmesini ve analizini detaylandıran bir protokol sunuyoruz. En yaygın ligand bazlı ve protein bazlı metodolojiler ana hatlarıyla belirtilmiştir ve bu da şüphesiz yapısal glikobiyoloji ve moleküler tanıma çalışmaları alanlarına katkıda bulunmaktadır.

Glikan-Protein Etkileşimlerinin Çözülmesi: Kurtarmaya Nükleer Manyetik Rezonans (NMR)

Nükleer manyetik rezonans (NMR) spektroskopisi, yapısal protein dinamiklerini kalıntıya özgü bir şekilde karakterize edebilir. NMR 15N R1 ve R2 gevşeme ve {1H}-15N heteronükleer Overhauser etkisi (hetNOE) deneylerini kaydetmek için pikosaniye ila nanosaniye zaman ölçeğine duyarlı uygulamalı bir protokol sunuyoruz.

NMR 15N Proteinlerin Pikosaniye ve Nanosaniye Yapısal Dinamiğinin İncelenmesi için Gevşeme Deneyleri

Elektron paramagnetic rezonans (EPR) spektroskopisi serbest radikallerin ölçmek için kesin bir yöntemdir. Farklı hücresel kompartmanlarda serbest radikallerin algılanması için seçici spin sonda kullanımı sağlar. Biz tedavi, depolama ve örnekleri EPR ölçümler için aktarma kolaylaştırmak biyolojik örnekler toplamak için pratik ve verimli bir yöntem mevcut.

Elektron Paramagnetic rezonans ortam sıcaklığı ve 77 K biyolojik örneklerde kullanımı

Burada, biz yeni bir floresan polyacrylamide jellerin toplam protein algılaması için teknik boyama özetleyen bir detaylı iletişim kuralı tanımlamak. Ag+algılar bir gümüş iyon özgü Floresans tahrik sonda protokol kullanır-protein kompleksleri ve geleneksel chromogenic gümüş lekeler belirli sınırlamaları ortadan kaldırır.

Floresan gümüş Polyacrylamide jeller proteinlerin boyama

Keşfedin, içsel olarak düzensiz proteinlerin kendi kendine ilişkilerini tespit etmek ve karakterize etmek için paramanyetik gevşeme geliştirmesini. Bu yöntem, geçici biyomoleküler etkileşimleri atomik çözünürlükte nicelendirmeye olanak tanır.

İçsel Olarak Düzensiz Proteinlerin Kendi Kendine İlişkilerini Tespit Etmek ve Karakterize Etmek için Paramanyetik Gevşeme Geliştirmesi (Video) | JoVE Journal

İçsel Olarak Düzensiz Proteinlerin Kendi Kendine İlişkilerini Tespit Etmek ve Karakterize Etmek için Paramanyetik Gevşeme Geliştirmesi

Daha fazla video keşfet