Hücre Dışı Vezikül Çalışmaları için Minimum Bilgiyi Karşılamak için Yeniden Üretilebilirliğin Geliştirilmesi 2018 Nanopartikül İzleme Analizinde Kılavuzlar

Bu protokol, NanoSight LM10'un acemi operatörleri için geliştirilmiştir. Adım adım talimatları izleyerek, doğru ve tekrarlanabilir sonuçlar elde edilebilir. Bu teknik, kullanıcının beceri düzeyinden bağımsız olarak birden fazla deneme çalıştırmasında tutarlı sonuçlar elde edilmesine yardımcı olur.

Nanopartikül karakterizasyonu, özellikle nicelleştirme, hücre dışı vezikül araştırma alanında bir zorluk olmaya devam etmektedir. Bu protokol, süspansiyondaki nanopartiküllerin tutarlı bir boyut ve konsantrasyon analizine izin verir. Lazer Modül'ün cam yüzeylerini kaliteli bir lens temizleyici ve lens kağıdı ile temizleyerek başlayın.

Modülün montajından önce, O-ring contasının akış hücresi kapağının oluğuna düzgün bir şekilde oturduğundan emin olun. Ardından, akış hücresi kapağını lazer modülünün üzerine yerleştirin ve elektrik kontaklarının doğru yönde olduğundan emin olun. Ardından, dört yaylı başparmak vidasını akış hücresi plakasından geçirin ve lazer modülünün dişlerini ayrı ayrı sıkmadan takın.

Akış hücresi kapağına eşit basınç uygularken, başparmak vidalarını sıkışana kadar alternatif çapraz bir şekilde düzgün bir şekilde sıkın. İki adet bir mililitrelik tüberkülin şırıngasını bir mililitre DPBS ile üç kez kayar kilit adaptörleriyle yıkayın. Şırıngayı boş bir seyreltici veya numune rezervuarı olarak hizmet etmek üzere kalan porta yerleştirmeden önce pistonu ilk tüberkülin şırıngasından çıkarın ve atın.

Ardından ikinci şırıngayı bir mililitre DPBS ile doldurun ve akış hücresi kapağının giriş portuna takın. DPBS lazer modülüne yavaşça enjekte edilirken havanın odadan temizlenmesini sağlamak için lazer modülünü çıkış şırınga portu yükseltilmiş olarak eğin önünde tutun. Giriş bağlantı noktasına bir mililitre hava enjekte ederek kalan DPBS'leri lazer modülden yıkayın.

Kızarma işlemini iki kez tekrarlayın. Son yıkamadan sonra, lazer modülünü mümkün olduğunca tamamen boşaltın ve odaklama ve konumlandırma için modülü yükleyin. Yazılımı açın.

Sol üst köşedeki kutudaki yakalama sekmesinin altında, kamerayı başlat'ı tıklatın. Kamera beş dakika sonra otomatik olarak kapanırsa, yeniden başlatmak için kamerayı başlat'ı tıklatın. Aynı sekmede, lazer çizgisini aydınlatmak ve parçacık tanımlamayı ve odaklamayı basitleştirmek için kamera seviyesini 14 ila 16 olarak ayarlayın.

Kafa parçasının sol tarafındaki üst kaydırıcıyı içeri veya dışarı hareket ettirerek, görüntüyü kameradan göz merceklerine yönlendirin. Görüş alanında, parmak izi ve merkez olarak adlandırılan artan yoğunluk alanını bulun ve parmak izini dikey olarak odaklayın. Görüş alanında, lazer çizgisini ortalayın, ardından ışığı bilgisayar ekranında gözlemlendiği gibi kameraya yönlendirmek için üst kaydırıcıyı hareket ettirin.

Bilgisayar ekranındaki görüntü, mikroskop göz merceklerindeki görünümden bir ayna görüntüsüdür. Netleme düğmesiyle ekrandaki tek tek hareket eden parçacıkların görüntüsünü keskinleştirmek için odağı ayarlayın. Numuneleri yüklemek için, numunenin bir mililitresini durulanmış bir mililitre tüberkülin şırıngasına çekin ve şırıngayı akış hücresi kapağının giriş portuna takın.

Çıkış portuna bağlı açık şırıngada sıvı belirginleşene kadar pistonu ilerletmeye devam edin. Modül, lazer modülünden havanın temizlenmesini sağlamak için eğilmelidir. Kamera görünümünde, odağı lazer çizgisinin sağında, eşit sayıda parçacıktan oluşan bir alana taşıyın.

Yatay ışık bantlarını ortalamak için dikey yönü ayarlayın ve en yüksek sayıda parçacık görünene kadar yeniden odaklanın. Sonraki tüm önlemler için odağın konumunu tutarlı tuttuğunuzdan emin olun. Kamera seviyesini, karanlık bilgi sembolünün kamera görünümünün sağ üst köşesinde aralıklı olarak yanıp söneceği şekilde ayarlayın.

Nanopartikül izleme analizi veya NTA için, süreyi 30 veya 60 saniyeye ve video sayısını beş olarak ayarlayın. Varolan temel dosya adını değiştirmek için, yeni bir dosya adıyla oluşturulan veriler için yeni bir depolama sitesinin sekmesini tıklatın. Ardından, istenen sıcaklığı girmek için hedef sıcaklık kutusunu işaretleyin ve standart ölçümü yeniden kullanmak için komut dosyası oluştur'a tıklayın.

Örnek yüklendikten ve deneme çalışmaya hazır olduğunda, komut dosyası oluştur ve çalıştır'ı tıklayın. Rapor ayrıntılarını ayarla açılır ekranında, alanları işleç, numune ve seyreltici hakkında gerekli bilgilerle doldurun. İstenen tüm alanlar doldurulduğunda, komut dosyasını başlatmak için ayarlar Tamam'ı tıklatın.

Her video çekiminden önce, pistonu manuel olarak ilerletmek için bir istem arayın. Numunenin yaklaşık 0.05 mililitresini lazer odasına enjekte edin. Parçacıklar dinlenmeye başladığında, Tamam'ı tıklatın. Beşinci video çekimini tamamladıktan sonra, işlem kutusuyla birlikte bir ayar onay kutusu görünecektir.

Kareler video ekranının altından manuel olarak ilerletildiğinden, ekranda parçacık oluşturan mavi haçların sayısına dikkat edin ve numunenin işlenmesi için algılama eşiğini ayarlayın. Tamamlandığına dair bir iletişim kutusu bildirimi görüntülenmeden önce videoların sonuçların histogramında otomatik olarak işlenmesini bekleyin, ardından Tamam'a basın. Dışa aktarma ayarları kutusu göründükten sonra, dışa aktar'ı tıklatarak sonuçları kaydedin. Geçerli denemede listelenen yakalama videolarının beşini de vurgulayın.

Ardından, seçilen dosyaları işle'yi tıklayın ve algılama eşiğini değiştirmek için işlem kutusunda ayar onay kutusunun yanıp sönmesini bekleyin, ardından algılama eşiğini istediğiniz düzeye ayarlayın ve ayara gidin ve Tamam'ı tıklayın. Videolar, sonuçların histogramında otomatik olarak işlenecek ve tamamlandığına dair bir iletişim kutusu bildirimi görüntülenecektir. Temsili analiz, lipozom örnekleri için nanoizleme analizinin sonuçları veya NTA ve temsili bir DPBS seyrelticisi OK.In tıklayın. Filtrelenmiş numunelerin ortalama parçacık çapı 108 nanometre ve mililitre başına sekizinci parçacıklara 7.4 kat 10 konsantrasyonu vardı.

Buna karşılık, filtrelenmemiş numunelerin ortalama parçacık çapı 159 nanometre ve mililitre başına sekizinci parçacıklara 7.6 çarpı 10 konsantrasyonu vardı. Birleşik kamera seviyelerinde, algılama eşiği ikiden beşe çıkarıldıkça, ortalama ve mod partikül boyutu, filtrelenmiş numunelerin partikül boyutlarında önemli bir düşüş gösterdi. Algılama eşiği artırıldıkça birleşik kamera seviyelerindeki parçacık konsantrasyonları azaltıldı.

Filtrelenmiş ve filtrelenmemiş numuneler arasında partikül konsantrasyonlarında anlamlı bir fark tespit edilmemiştir. Kombine algılama eşiklerinde, kamera seviyesi 12'den 14'e yükseldikçe, filtrelenmiş numunelerin ortalama ve mod parçacık boyutunda bir azalma kaydedildi. Kombine algılama eşiklerindeki parçacık konsantrasyonları, kamera seviyeleri 12'den 14'e yükseldikçe arttı.

Filtrelenmiş ve filtrelenmemiş örnekler arasında anlamlı bir fark gözlenmemiştir. Doğru görüntüleme alanını bulmak için 4.1 ile 5.2 arasındaki adımlar önemlidir. Birden fazla deneme çalıştırmasında tutarlı sonuçlar elde etmek, bu tekrarlanabilir beceriye bağlıdır.

Dinamik ışık saçılması genellikle nanopartikül izleme analizine eşlik etmek için öncelikle parçacıkların yüzey yükü olan zeta potansiyelini elde etmek için kullanılır. Nanopartikül analizi için NTA, hücre dışı vezikül araştırmaları için yararlı olan parçacıkların nicelleştirilmesinde çok değerli bir yöntem olmaya devam etmektedir.