Hücre Dışı Vezikül Çalışmaları için Minimum Bilgiyi Karşılamak için Yeniden Üretilebilirliğin Geliştirilmesi 2018 Nanopartikül İzleme Analizinde Kılavuzlar
November 17th, 2021
Nanopartikül izleme analizi (NTA), hücre dışı vezikülleri karakterize etmek için yaygın olarak kullanılan bir yöntemdir. Bu makale, NTA deneysel parametrelerini ve kontrollerini ve ayrıca MISEV2018 ve EV-TRACK tarafından laboratuvarlar arasında tekrarlanabilirlik için önerilen kılavuzları desteklemek için gerekli numunelerin ve seyrelticilerin tek tip bir analiz ve karakterizasyon yöntemini vurgulamaktadır.
Bu protokol, NanoSight LM10'un acemi operatörleri için geliştirilmiştir. Adım adım talimatları izleyerek, doğru ve tekrarlanabilir sonuçlar elde edilebilir. Bu teknik, kullanıcının beceri düzeyinden bağımsız olarak birden fazla deneme çalıştırmasında tutarlı sonuçlar elde edilmesine yardımcı olur.
Nanopartikül karakterizasyonu, özellikle nicelleştirme, hücre dışı vezikül araştırma alanında bir zorluk olmaya devam etmektedir. Bu protokol, süspansiyondaki nanopartiküllerin tutarlı bir boyut ve konsantrasyon analizine izin verir. Lazer Modül'ün cam yüzeylerini kaliteli bir lens temizleyici ve lens kağıdı ile temizleyerek başlayın.
Modülün montajından önce, O-ring contasının akış hücresi kapağının oluğuna düzgün bir şekilde oturduğundan emin olun. Ardından, akış hücresi kapağını lazer modülünün üzerine yerleştirin ve elektrik kontaklarının doğru yönde olduğundan emin olun. Ardından, dört yaylı başparmak vidasını akış hücresi plakasından geçirin ve lazer modülünün dişlerini ayrı ayrı sıkmadan takın.
Akış hücresi kapağına eşit basınç uygularken, başparmak vidalarını sıkışana kadar alternatif çapraz bir şekilde düzgün bir şekilde sıkın. İki adet bir mililitrelik tüberkülin şırıngasını bir mililitre DPBS ile üç kez kayar kilit adaptörleriyle yıkayın. Şırıngayı boş bir seyreltici veya numune rezervuarı olarak hizmet etmek üzere kalan porta yerleştirmeden önce pistonu ilk tüberkülin şırıngasından çıkarın ve atın.
Ardından ikinci şırıngayı bir mililitre DPBS ile doldurun ve akış hücresi kapağının giriş portuna takın. DPBS lazer modülüne yavaşça enjekte edilirken havanın odadan temizlenmesini sağlamak için lazer modülünü çıkış şırınga portu yükseltilmiş olarak eğin önünde tutun. Giriş bağlantı noktasına bir mililitre hava enjekte ederek kalan DPBS'leri lazer modülden yıkayın.
Kızarma işlemini iki kez tekrarlayın. Son yıkamadan sonra, lazer modülünü mümkün olduğunca tamamen boşaltın ve odaklama ve konumlandırma için modülü yükleyin. Yazılımı açın.
Sol üst köşedeki kutudaki yakalama sekmesinin altında, kamerayı başlat'ı tıklatın. Kamera beş dakika sonra otomatik olarak kapanırsa, yeniden başlatmak için kamerayı başlat'ı tıklatın. Aynı sekmede, lazer çizgisini aydınlatmak ve parçacık tanımlamayı ve odaklamayı basitleştirmek için kamera seviyesini 14 ila 16 olarak ayarlayın.
Kafa parçasının sol tarafındaki üst kaydırıcıyı içeri veya dışarı hareket ettirerek, görüntüyü kameradan göz merceklerine yönlendirin. Görüş alanında, parmak izi ve merkez olarak adlandırılan artan yoğunluk alanını bulun ve parmak izini dikey olarak odaklayın. Görüş alanında, lazer çizgisini ortalayın, ardından ışığı bilgisayar ekranında gözlemlendiği gibi kameraya yönlendirmek için üst kaydırıcıyı hareket ettirin.
Bilgisayar ekranındaki görüntü, mikroskop göz merceklerindeki görünümden bir ayna görüntüsüdür. Netleme düğmesiyle ekrandaki tek tek hareket eden parçacıkların görüntüsünü keskinleştirmek için odağı ayarlayın. Numuneleri yüklemek için, numunenin bir mililitresini durulanmış bir mililitre tüberkülin şırıngasına çekin ve şırıngayı akış hücresi kapağının giriş portuna takın.
Çıkış portuna bağlı açık şırıngada sıvı belirginleşene kadar pistonu ilerletmeye devam edin. Modül, lazer modülünden havanın temizlenmesini sağlamak için eğilmelidir. Kamera görünümünde, odağı lazer çizgisinin sağında, eşit sayıda parçacıktan oluşan bir alana taşıyın.
Yatay ışık bantlarını ortalamak için dikey yönü ayarlayın ve en yüksek sayıda parçacık görünene kadar yeniden odaklanın. Sonraki tüm önlemler için odağın konumunu tutarlı tuttuğunuzdan emin olun. Kamera seviyesini, karanlık bilgi sembolünün kamera görünümünün sağ üst köşesinde aralıklı olarak yanıp söneceği şekilde ayarlayın.
Nanopartikül izleme analizi veya NTA için, süreyi 30 veya 60 saniyeye ve video sayısını beş olarak ayarlayın. Varolan temel dosya adını değiştirmek için, yeni bir dosya adıyla oluşturulan veriler için yeni bir depolama sitesinin sekmesini tıklatın. Ardından, istenen sıcaklığı girmek için hedef sıcaklık kutusunu işaretleyin ve standart ölçümü yeniden kullanmak için komut dosyası oluştur'a tıklayın.
Örnek yüklendikten ve deneme çalışmaya hazır olduğunda, komut dosyası oluştur ve çalıştır'ı tıklayın. Rapor ayrıntılarını ayarla açılır ekranında, alanları işleç, numune ve seyreltici hakkında gerekli bilgilerle doldurun. İstenen tüm alanlar doldurulduğunda, komut dosyasını başlatmak için ayarlar Tamam'ı tıklatın.
Her video çekiminden önce, pistonu manuel olarak ilerletmek için bir istem arayın. Numunenin yaklaşık 0.05 mililitresini lazer odasına enjekte edin. Parçacıklar dinlenmeye başladığında, Tamam'ı tıklatın. Beşinci video çekimini tamamladıktan sonra, işlem kutusuyla birlikte bir ayar onay kutusu görünecektir.
Kareler video ekranının altından manuel olarak ilerletildiğinden, ekranda parçacık oluşturan mavi haçların sayısına dikkat edin ve numunenin işlenmesi için algılama eşiğini ayarlayın. Tamamlandığına dair bir iletişim kutusu bildirimi görüntülenmeden önce videoların sonuçların histogramında otomatik olarak işlenmesini bekleyin, ardından Tamam'a basın. Dışa aktarma ayarları kutusu göründükten sonra, dışa aktar'ı tıklatarak sonuçları kaydedin. Geçerli denemede listelenen yakalama videolarının beşini de vurgulayın.
Ardından, seçilen dosyaları işle'yi tıklayın ve algılama eşiğini değiştirmek için işlem kutusunda ayar onay kutusunun yanıp sönmesini bekleyin, ardından algılama eşiğini istediğiniz düzeye ayarlayın ve ayara gidin ve Tamam'ı tıklayın. Videolar, sonuçların histogramında otomatik olarak işlenecek ve tamamlandığına dair bir iletişim kutusu bildirimi görüntülenecektir. Temsili analiz, lipozom örnekleri için nanoizleme analizinin sonuçları veya NTA ve temsili bir DPBS seyrelticisi OK.In tıklayın. Filtrelenmiş numunelerin ortalama parçacık çapı 108 nanometre ve mililitre başına sekizinci parçacıklara 7.4 kat 10 konsantrasyonu vardı.
Buna karşılık, filtrelenmemiş numunelerin ortalama parçacık çapı 159 nanometre ve mililitre başına sekizinci parçacıklara 7.6 çarpı 10 konsantrasyonu vardı. Birleşik kamera seviyelerinde, algılama eşiği ikiden beşe çıkarıldıkça, ortalama ve mod partikül boyutu, filtrelenmiş numunelerin partikül boyutlarında önemli bir düşüş gösterdi. Algılama eşiği artırıldıkça birleşik kamera seviyelerindeki parçacık konsantrasyonları azaltıldı.
Filtrelenmiş ve filtrelenmemiş numuneler arasında partikül konsantrasyonlarında anlamlı bir fark tespit edilmemiştir. Kombine algılama eşiklerinde, kamera seviyesi 12'den 14'e yükseldikçe, filtrelenmiş numunelerin ortalama ve mod parçacık boyutunda bir azalma kaydedildi. Kombine algılama eşiklerindeki parçacık konsantrasyonları, kamera seviyeleri 12'den 14'e yükseldikçe arttı.
Filtrelenmiş ve filtrelenmemiş örnekler arasında anlamlı bir fark gözlenmemiştir. Doğru görüntüleme alanını bulmak için 4.1 ile 5.2 arasındaki adımlar önemlidir. Birden fazla deneme çalıştırmasında tutarlı sonuçlar elde etmek, bu tekrarlanabilir beceriye bağlıdır.
Dinamik ışık saçılması genellikle nanopartikül izleme analizine eşlik etmek için öncelikle parçacıkların yüzey yükü olan zeta potansiyelini elde etmek için kullanılır. Nanopartikül analizi için NTA, hücre dışı vezikül araştırmaları için yararlı olan parçacıkların nicelleştirilmesinde çok değerli bir yöntem olmaya devam etmektedir.
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
Genel Bakış
Bu makale, hücre dışı vezikülleri karakterize etmeyi amaçlayan bir nanopartikül izleme analizi (NTA) protokolü sunmaktadır. Operatörün beceri seviyesine bakmaksızın doğru ve tekrarlanabilir sonuçlar elde etmek için adım adım talimatlar sağlamaktadır.
Çalışmanın Temel Bileşenleri
Bilim Alanı
- Sinirbilim
- Biyoloji
- Hücre Dışı Vezikül Araştırması
Arka Plan
- NTA, hücre dışı vezikülleri karakterize etmek için yaygın olarak kullanılan bir yöntemdir.
- Nanopartiküllerin niceliği alanı içinde hala bir zorluk oluşturmaktadır.
- Tutarlı sonuçlar, laboratuvarlar arasındaki tekrarlanabilirlik için çok önemlidir.
- Bu protokol, tek tip analiz yöntemlerine olan ihtiyacı karşılamaktadır.
Çalışmanın Amacı
- NanoSight LM10'u yeni başlayan operatörler için güvenilir bir protokol sağlamak.
- Hücre dışı vezikül araştırmalarında tekrarlanabilirliği artırmak.
- Nanopartikül karakterizasyonu için mevcut kılavuzları tamamlamak.
Kullanılan Yöntemler
- NanoSight LM10'u kullanma adım adım talimatları.
- Lazer modülü için temizleme prosedürleri.
- Örnek hazırlama ve analiz için kılavuzlar.
- Doğru sonuçlar için kontroller ve deneysel parametreler.
Ana Sonuçlar
- Nanopartiküllerin tutarlı boyut ve konsantrasyon analizi.
- Hücre dışı vezikülleri nicellemede gelişmiş doğruluk.
- Çoklu deneme çalışmaları boyunca tekrarlanabilir sonuçlar.
- NTA metodolojisi hakkında gelişmiş anlayış.
Sonuçlar
- Protokol, güvenilir nanopartikül karakterizasyonu sağlar.
- Hücre dışı vezikül araştırma alanındaki zorlukları ele alır.
- Protokolü takip etmek, kullanıcı beceri seviyesine bakmaksızın tutarlı sonuçlar sağlar.
Sıkça Sorulan Sorular
Executive Industry Relevance
Reproducible nanoparticle tracking analysis (NTA) is critical for robust extracellular vesicle (EV) characterization, directly impacting target validation and assay development in biopharma R&D. Adhering to MISEV2018 guidelines and transparent reporting standards reduces experimental ambiguity and supports confident decision-making at key discovery inflection points. Standardized NTA protocols enable reliable cross-study comparisons, strengthening portfolio-wide data integrity.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Supports rigorous hypothesis testing by enabling consistent EV quantification and sizing.
- Reduces biological variability, enhancing confidence in functional target validation.
- Facilitates mechanistic de-risking by controlling for sample and instrument variables.
Screening & Assay Development
- Prepares validated EV samples for downstream screening workflows.
- Enables assay standardization through detailed reporting of controls and instrument settings.
- Delivers quantitative outputs for reliable compound evaluation and platform reuse.
Translational & Preclinical Research
- Aligns EV characterization with translational biomarker requirements when reporting is comprehensive.
- Ensures continuity from discovery to preclinical validation by documenting critical experimental parameters.
- Supports risk-adjusted advancement decisions by minimizing uncontrolled technical variation.
Pipeline & Workflow Integration
NTA, when implemented with full reporting and controls, bridges early discovery and preclinical workflows by providing reproducible, quantitative EV data.
- Discovery Biology: Enables robust hypothesis testing and pathway clarification through standardized EV measurement.
- Screening: Provides reproducible, quantitative particle size and concentration data for assay readiness.
- Analytics: Generates statistical outputs that facilitate cross-condition and cross-study comparisons.
- Translational Research: Supports biomarker alignment and preclinical continuity when reporting meets MISEV2018 standards.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable protocol framework for consistent EV characterization across programs.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in EV studies.
- Operational Value: Promotes standardization, reproducibility, and scalability of NTA workflows.
- Strategic Value: Enables better go/no-go decisions and reduces late-stage biological risk through robust data.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization and advancement of EV-related assets.
Implementation Considerations
- Requires operator training in NTA instrumentation and protocol adherence.
- Needs access to calibrated NTA systems and validated analytical software.
- Demands rigorous documentation of controls, instrument settings, and environmental variables.
- Must adapt protocols for different sample types and diluents as specified by guidelines.
- Limited by the need for comprehensive reporting to ensure reproducibility across sites.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:04
Introduction
0:44
Cleaning and Assembly of the Laser Module
1:29
Flushing Procedure for the Laser Module Prior to and Between Samples
2:28
Focusing and Positioning of the Laser Module
3:34
Loading Standards/Samples/Diluent into the Laser Module for Nanoparticle Tracking Analysis (NTA)
4:28
Sample Nanoparticle Tracking Analysis (NTA)
6:06
Re-Analysis of the Current Sample at Different Detection Threshold
6:40
Results: Effects of Camera Level and Detection Threshold on Measured Particle Size and Concentration of Filtered and Unfiltered Samples
8:02
Conclusion
