Name: Yerinde Akut Ex Vivo Embriyonik Beyin Dilimi Kültürlerinde Akson Büyümesi ve Büyüme Koni Dinamiğinin Görselleştirilmesi (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-10-14T15:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 45 s
Description: Keşfedin fare embriyonik beyin dilimlerinde akson büyümesi ve büyüme koni dinamiğini yüksek çözünürlüklü görüntüleme ile. Bu yöntem, nörogelişim ve plastisite mekanizmalarını incelemek için güçlü bir çerçeve sunar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Maria Eugenia Bernis'e prosedürleri fotoğrafladığı için teşekkür ederiz. Ayrıca Emily Burnside, Emily Handley, Thorben Pietralla, Max Schelski ve Sina Stern'e el yazmasını okudukları ve tartıştıkları için teşekkür ederiz. Olağanüstü teknik asistanlarımız Jessica Gonyer, Blanca Randel ve Anh-Tuan Pham'a minnettarız. DZNE'nin ışık mikroskobu tesisinin ve hayvan tesisinin değerli desteğini kabul ediyoruz. Bu çalışma Deutsche Forschungsgesellschaft (DFG), Uluslararası Parapleji Araştırma Vakfı (IRP) ve Yaşam için Kanatlar (F.B) tarafından desteklenmiştir. F.B., ImmunoSensation2, SFB 1089 ve 1158 mükemmellik kümesinin bir üyesidir ve Roger De Spoelberch Ödülü'nün sahibidir.

<ol><li>Schelski, M., Bradke, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuronal+polarization%3A+From+spatiotemporal+signaling+to+cytoskeletal+dynamics%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+and+Cellular+Neurosciences%22%5BJournal%5D)">Neuronal polarization: From spatiotemporal signaling to cytoskeletal dynamics.</a> Molecular and Cellular Neurosciences. 84, 11-28 (2017).</li>
<li>Lowery, L. A., Van Vactor, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+trip+of+the+tip%3A+understanding+the+growth+cone+machinery%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews%3A+Molecular+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">The trip of the tip: understanding the growth cone machinery.</a> Nature Reviews: Molecular Cell Biology. 10 (5), 332-343 (2009).</li>
<li>Stoeckli, E. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Understanding+axon+guidance%3A+are+we+nearly+there+yet%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Understanding axon guidance: are we nearly there yet.</a> Development. 145 (10), (2018).</li>
<li>Bradke, F., Dotti, C. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+local+actin+instability+in+axon+formation%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">The role of local actin instability in axon formation.</a> Science. 283 (5409), 1931-1934 (1999).</li>
<li>Neukirchen, D., Bradke, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cytoplasmic+linker+proteins+regulate+neuronal+polarization+through+microtubule+and+growth+cone+dynamics%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Cytoplasmic linker proteins regulate neuronal polarization through microtubule and growth cone dynamics.</a> Journal of Neuroscience. 31 (4), 1528-1538 (2011).</li>
<li>Witte, H., Bradke, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+the+cytoskeleton+during+neuronal+polarization%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Neurobiology%22%5BJournal%5D)">The role of the cytoskeleton during neuronal polarization.</a> Current Opinion in Neurobiology. 18 (5), 479-487 (2008).</li>
<li>Witte, H., Neukirchen, D., Bradke, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microtubule+stabilization+specifies+initial+neuronal+polarization%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Microtubule stabilization specifies initial neuronal polarization.</a> Journal of Cell Biology. 180 (3), 619-632 (2008).</li>
<li>Nichol, R. H., Catlett, T. S., Onesto, M. M., Hollender, D., Gomez, T. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Environmental+elasticity+regulates+cell-type+specific+RHOA+signaling+and+neuritogenesis+of+human+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Environmental elasticity regulates cell-type specific RHOA signaling and neuritogenesis of human neurons.</a> Stem Cell Reports. 13 (6), 1006-1021 (2019).</li>
<li>Santos, T. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Axon+growth+of+CNS+neurons+in+three+dimensions+is+amoeboid+and+independent+of+adhesions%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Axon growth of CNS neurons in three dimensions is amoeboid and independent of adhesions.</a> Cell Reports. 32 (3), 107907(2020).</li>
<li>Mitchison, T., Kirschner, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cytoskeletal+dynamics+and+nerve+growth%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Cytoskeletal dynamics and nerve growth.</a> Neuron. 1 (9), 761-772 (1988).</li>
<li>Lin, C. H., Thompson, C. A., Forscher, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cytoskeletal+reorganization+underlying+growth+cone+motility%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Neurobiology%22%5BJournal%5D)">Cytoskeletal reorganization underlying growth cone motility.</a> Current Opinion in Neurobiology. 4 (5), 640-647 (1994).</li>
<li>Myers, J. P., Gomez, T. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Focal+adhesion+kinase+promotes+integrin+adhesion+dynamics+necessary+for+chemotropic+turning+of+nerve+growth+cones%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Focal adhesion kinase promotes integrin adhesion dynamics necessary for chemotropic turning of nerve growth cones.</a> Journal of Neuroscience. 31 (38), 13585-13595 (2011).</li>
<li>Turney, S. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nerve+growth+factor+stimulates+axon+outgrowth+through+negative+regulation+of+growth+cone+actomyosin+restraint+of+microtubule+advance%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Biology+of+the+Cell%22%5BJournal%5D)">Nerve growth factor stimulates axon outgrowth through negative regulation of growth cone actomyosin restraint of microtubule advance.</a> Molecular Biology of the Cell. 27 (3), 500-517 (2016).</li>
<li>Schindelin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fiji%3A+an+open-source+platform+for+biological-image+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Fiji: an open-source platform for biological-image analysis.</a> Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).</li>
<li>Noctor, S. C., Flint, A. C., Weissman, T. A., Dammerman, R. S., Kriegstein, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neurons+derived+from+radial+glial+cells+establish+radial+units+in+neocortex%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Neurons derived from radial glial cells establish radial units in neocortex.</a> Nature. 409 (6821), 714-720 (2001).</li>
<li>Noctor, S. C., Martinez-Cerdeno, V., Ivic, L., Kriegstein, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cortical+neurons+arise+in+symmetric+and+asymmetric+division+zones+and+migrate+through+specific+phases%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Cortical neurons arise in symmetric and asymmetric division zones and migrate through specific phases.</a> Nature Neuroscience. 7 (2), 136-144 (2004).</li>
<li>Ferent, J., Zaidi, D., Francis, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extracellular+control+of+radial+glia+proliferation+and+scaffolding+during+cortical+development+and+pathology%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Cell+and+Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Extracellular control of radial glia proliferation and scaffolding during cortical development and pathology.</a> Frontiers in Cell and Developmental Biology. 8, 578341(2020).</li>
<li>Dent, E. W., Gupton, S. L., Gertler, F. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+growth+cone+cytoskeleton+in+axon+outgrowth+and+guidance%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harbor+Perspectives+in+Biology%22%5BJournal%5D)">The growth cone cytoskeleton in axon outgrowth and guidance.</a> Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 3 (3), (2011).</li>
<li>Dupraz, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RhoA+controls+axon+extension+independent+of+specification+in+the+developing+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Biology%22%5BJournal%5D)">RhoA controls axon extension independent of specification in the developing brain.</a> Current Biology. 29 (22), 3874-3886 (2019).</li>
<li>Azzarelli, R., Oleari, R., Lettieri, A., Andre, V., Cariboni, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro%2C+ex+vivo+and+in+vivo+techniques+to+study+neuronal+migration+in+the+developing+cerebral+cortex%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Sciences%22%5BJournal%5D)">In vitro, ex vivo and in vivo techniques to study neuronal migration in the developing cerebral cortex.</a> Brain Sciences. 7 (5), (2017).</li>
<li>Humpel, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organotypic+brain+slice+cultures%3A+A+review%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Organotypic brain slice cultures: A review.</a> Neuroscience. 305, 86-98 (2015).</li>
<li>Namba, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pioneering+axons+regulate+neuronal+polarization+in+the+developing+cerebral+cortex%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Pioneering axons regulate neuronal polarization in the developing cerebral cortex.</a> Neuron. 81 (4), 814-829 (2014).</li>
<li>Shah, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rap1+GTPases+are+master+regulators+of+neural+cell+polarity+in+the+developing+neocortex%5BTitle%5D)+AND+%22Cerebral+Cortex%22%5BJournal%5D)">Rap1 GTPases are master regulators of neural cell polarity in the developing neocortex.</a> Cerebral Cortex. 27 (2), 1253-1269 (2017).</li>
<li>Wiegreffe, C., Feldmann, S., Gaessler, S., Britsch, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Time-lapse+confocal+imaging+of+migrating+neurons+in+organotypic+slice+culture+of+embryonic+mouse+brain+using+in+utero+electroporation%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">Time-lapse confocal imaging of migrating neurons in organotypic slice culture of embryonic mouse brain using in utero electroporation.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (125), (2017).</li>
<li>de Anda, F. C., Meletis, K., Ge, X., Rei, D., Tsai, L. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Centrosome+motility+is+essential+for+initial+axon+formation+in+the+neocortex%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Centrosome motility is essential for initial axon formation in the neocortex.</a> Journal of Neuroscience. 30 (31), 10391-10406 (2010).</li>
<li>Sakakibara, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamics+of+centrosome+translocation+and+microtubule+organization+in+neocortical+neurons+during+distinct+modes+of+polarization%5BTitle%5D)+AND+%22Cerebral+Cortex%22%5BJournal%5D)">Dynamics of centrosome translocation and microtubule organization in neocortical neurons during distinct modes of polarization.</a> Cerebral Cortex. 24 (5), 1301-1310 (2014).</li>
<li>Schatzle, P., Kapitein, L. C., Hoogenraad, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Live+imaging+of+microtubule+dynamics+in+organotypic+hippocampal+slice+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Live imaging of microtubule dynamics in organotypic hippocampal slice cultures.</a> Methods in Cell Biology. 131, 107-126 (2016).</li>
<li>Qu, X., Kumar, A., Bartolini, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Live+imaging+of+microtubule+dynamics+at+excitatory+presynaptic+boutons+in+primary+hippocampal+neurons+and+acute+hippocampal+slices%5BTitle%5D)+AND+%22STAR+Protocols%22%5BJournal%5D)">Live imaging of microtubule dynamics at excitatory presynaptic boutons in primary hippocampal neurons and acute hippocampal slices.</a> STAR Protocols. 2 (1), 100342(2021).</li>
<li>Tonnesen, J., Katona, G., Rozsa, B., Nagerl, U. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spine+neck+plasticity+regulates+compartmentalization+of+synapses%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Spine neck plasticity regulates compartmentalization of synapses.</a> Nature Neuroscience. 17 (5), 678-685 (2014).</li>
<li>Buchsbaum, I. Y., Cappello, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuronal+migration+in+the+CNS+during+development+and+disease%3A+insights+from+in+vivo+and+in+vitro+models%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Neuronal migration in the CNS during development and disease: insights from in vivo and in vitro models.</a> Development. 146 (1), (2019).</li>
<li>Rigby, M. J., Gomez, T. M., Puglielli, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glial+cell-axonal+growth+cone+interactions+in+neurodevelopment+and+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Glial cell-axonal growth cone interactions in neurodevelopment and regeneration.</a> Frontiers in Neuroscience. 14, 203(2020).</li>
<li>Barnes, A. P., Polleux, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Establishment+of+axon-dendrite+polarity+in+developing+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Establishment of axon-dendrite polarity in developing neurons.</a> Annual Review of Neuroscience. 32, 347-381 (2009).</li>
<li>Multiphoton Microscope Leica TCS SP8 MP. Microsystems. , Available from: 
 <a target="_blank" href="http://www.leica-microsystems.com/products/confocal-microscopes/p/leica-tcs-sp8-sted-one/">http://www.leica-microsystems.com/products/confocal-microscopes/p/leica-tcs-sp8-sted-one/</a> (2021).</li>
<li>ZEISS Lattice Lightsheet 7. Zeiss. , Available from: 
 <a target="_blank" href="http://www.zeiss.com/microscopy/int/products/imaging-systems/lattice-lightsheet-7.html">http://www.zeiss.com/microscopy/int/products/imaging-systems/lattice-lightsheet-7.html</a> (2021).</li>
</ol>

Yazarların açıklayacak hiçbir şeyleri yoktur.

Büyüme konilerinin eşzamanlı akson genişletme ve yönlendirmeyi koordine etmek için çevrelerini nasıl algıladıkları ve tepki verdikleri hala bir tartışma konusudur 3,18. 2D substratlardaki öncü çalışmalar, akson oluşumu, büyüme ve navigasyon 2,10,11,12,19 sırasında büyüme konisi dinamiklerini yönlendiren kuvvetleri üreten temel moleküler mekanizmalara bir bakış sağlamıştır. Daha yakın zamanlarda, 3D matrislerde yapılan çalışmalar, üçüncü bir boyutun büyüme konisinin davranışında ve dolayısıyla akson büyümesinde ne kadar etkisi olduğunu ortaya koymuştur 8,9. Bununla birlikte, in vivo büyüme konisi dinamiklerini öğreten karmaşık mekanizmalar iyice incelenmeye devam etmektedir.
İEÜ veya EUE beyinlerinden organotipik dilim kültürlerinin hazırlanması yaygın olarak kullanılmakta ve iyi belgelenmektedir. Bilim adamlarının canlı beyin dokusundaki nöronların gelişimi ve davranışları hakkında fikir edinmelerini sağlayan altın bir standart haline gelmiştir20,21. Gerçekten de, bu teknik, spesifik moleküler süreçleri ve morfolojik olayları in situ olarak görselleştirmek için çeşitli yüksek çözünürlüklü görüntüleme teknikleriyle kombinasyon halinde başarıyla kullanılmıştır. Bu tür çalışmalar, akson oluşumu ve uzantısı 19,22, kortikal nöronal migrasyon 19,22,23,24, sentrozom dinamikleri 25,26, mikrotübül dinamikleri27 ve ayrıca sinaptik öncesi ve sonrası bölmelerin fonksiyonel dinamikleri 28,29'u içerir, ancak bunlarla sınırlı değildir.
Bu protokol, deneysel nörobiyolojideki bir boşluğu ele alarak, in situ kortikal nöronların gelişiminin büyüme konisi dinamiklerini, in vivo akut beyin dilimi kültürlerini ve elde edilen verileri analiz etme araçlarını görselleştirmektedir.
Bu protokolü oluşturmak için akut beyin dilimi kültürleri kullanılmıştır, çünkü (1) bazı uygulamalarla üretilmesi kolaydır; (2) yarı-tamamen fizyolojik bir ortama gömülmüş, ancak yüksek çözünürlüklü canlı hücre görüntülemeye izin verecek kadar şeffaf olan büyüme konilerini incelemek için erişilebilir bir sistem sunmak; (3) sayısız transgenik fare çizgisi ile kullanımı için genişletilebilir; (4) İEÜ veya EUE ile birleştiğinde, floresan muhabirler ve sitoiskelet probları ile birlikte, fonksiyon kaybı / kazancı rejimleri altında büyüme konilerinin ve aksonlarının performansını in vivo olarak değerlendirmek için moleküler araçlar sunmak için neredeyse sınırsız potansiyel sağlar.
Bu metodoloji hem EUE hem de İEÜ bağlamında tanımlanmıştır. EUE, halen oldukça güvenilir bir yöntem olmasına rağmen, dağılmış bir RG ağı gösteren beyin dilimlerinin insidansı, bir dağıtım yöntemi olarak İEÜ ile elde edilenlere kıyasla artmıştır (Şekil 4C). RG dizisindeki bozukluklar nöronal göçü ve akson uzama paternini güçlü bir şekilde etkiler30,31. Bunlar, belirli bir zamanda analiz için aksonların nerede bulunacağını ve gezindikleri ortamın türünü tahmin eden temel parametrelerdir. Önemli ölçüde bozulmuş bir RG ağına sahip beyin dilimleri tipik olarak kortikal nöron tabakalaşmasını bozmuştur. Bu da, kaotik yörüngelere sahip aksonlar üretir. Bu nedenle, RG ağının yapısal bütünlüğünü kontrol etmeniz şiddetle tavsiye edilir. İlginçtir ki, zayıf yapısal bütünlük, embriyonik beynin artan yaşı ile ilişkilidir. Gerçekten de, genç E12.5-E13.5 embriyolarında bu tür etkiler tipik olarak gözlenmemiştir19.
Mevcut protokol kapsamlı ve basittir. Bununla birlikte, optimal sonuçlar elde etmek için özel dikkat ve dikkat gösterilmesi gereken birkaç kritik adım vardır. Bunlar protokolde açıkça belirtilmiştir ve (1) seyrek etiketleme elde etmek için elektroporasyonda kullanılan DNA miktarının ayarlanmasını; (2) beyinlerin çıkarılması sırasında hasardan kaçınmak; (3) beyin muhafazası sırasında agarozun sıcaklığını kontrol etmek; (4) belirli bir yaştaki beyinler için ideal agaroz yüzdesini gidermek; ve (5) deneyimi takip eden floroforların seçimi. Protokol optimizasyonu sırasında, canlı hücreli in situ görüntülemede birkaç floroforun performansı test edildi. Bu protokol için LifeAct ve Lyn etiketli plazmidlerin hazırlanması için monomerik GFP varyantları EGFP ve NeonGreen seçildi (Şekil 5A, B). Ek olarak, RFP varyantı mScarlet test edildi ve bu kurulum için oldukça uygun bulundu (veriler gösterilmedi). Multimerik tRFP (dimer) ve ZsGreen (tetramer) (Şekil 5C ve Ek Video 1, sağda) da test edildi. Bu hızlı katlanan süper parlak floroforlar, yöntem DNA dağıtımından sonra hızlı floresan sinyal üretimi gerektirdiğinde önerilir.
Dilim kültürlerini kullanmada yaygın bir uygulama, kontrol ve deneysel koşulları test etmek için farklı beyinlerden dilimler kullanmaktır. Bu, istenmeyen değişkenliğin doğal bir kaynağını temsil eder. Burada, komşu nöronların ve muhabirlerin kimlik tespiti için ifadelerinin bağımsız olarak değiştirilmesini sağlayan bir ifade sistemi kullanılmıştır. Bu gösterimde (Şekil 5C), floroforlardan herhangi birini ifade eden nöronlar arasında hiçbir fark olmadığını unutmayın. Bununla birlikte, örnek olarak, Cre'ye duyarlı bir geni barındıran transgenik bir fare çizgisi ile birleştirilen böyle bir plazmid karışımı, vahşi tip olarak kalan tRFP (Dre-duyarlı) nöronlarla etiketlenecektir. Buna karşılık, ZsGreen (aynı zamanda Cre-sensitif) rekombine nöronları etiketleyecektir. Bu nedenle, iki farklı genotipin büyüme konileri ve muhtemelen aynı zamanda fenotipler, aynı beyin diliminde aynı anda yan yana incelenebilir.
Aksonların ve büyüme konilerinin analiz için lokalizasyonu önemli bir husustur. Kortikal nöronlar, ventriküler bölgeden (VZ) kortikal plakaya (CP) doğru radyal olarak göç ederken polarize olurlar. Bu işlem sırasında, nöronlar öncü bir süreç (gelecekteki bir dendrit) ve akson haline gelecek bir takip süreci oluşturur, sonunda ara bölgedeki (IZ) öncü aksonlara katılarak akson yollarıoluşturur 32. Bu nedenle, aksonal büyüme konilerini yakalamak için, CP'den çıkan aksonlar ve zaten aksonal demetlerle ilişkili erken üretilen aksonlar da dahil olmak üzere IZ'deki aksonal lifler üzerinde görüntüleme yapıldı; veya nihayetinde, IZ'yi enine eden ve altına uzanan liflerde (Şekil 7).
Bu protokol, organotipik dilimler içindeki nöronların süper çözünürlüklü görüntülenmesini mümkün kılar. Tarihsel olarak, ışık saçılması, kalın örnekleri görüntülerken karşılaşılan önemli bir sorundu. Son yirmi yılda, optik teknolojilerdeki kapsamlı ilerlemeler, kalın örneklerin görüntülenmesini mümkün kılmıştır. Burada, büyüme konileri gibi daha küçük yapıları daha iyi görselleştirmek için uzun bir çalışma mesafesi hedefi kullanılmıştır. Kaçınılmaz olarak, bu protokol retrograd aktin akışı veya mikrotübül dinamikleri gibi daha ayrıntılı olayları yakalamaz. Daha düşük bir Sayısal Diyafram (NA) gerektiren uzun çalışma mesafesi hedefi, kalın dilimlerden gelen bilgileri korur. Bununla birlikte, bu protokolü daha kısa çalışma mesafesi hedefleriyle kullanmak için uyarlamak da mümkündü. Bu, yapısal bütünlüğü korumak için dilimlerin cam tabanlı bir kaba düzgün bir şekilde aktarılmasını gerektiriyordu. Bununla birlikte, bu yöntemin kullanılması, gaz değişimi kaybı nedeniyle daha kısa sağkalımla sonuçlandı - ~ 15 saat - (veriler gösterilmemiştir). 2B kültürlerin aksine, 3B'deki büyüme konileri daha büyük bir hacme sahiptir ve z ekseninde hareket-artefakt telafisi gerektirir. Ayrıntılı olayları görüntüleme yeteneğini artırmak için, modern konfokal teknoloji kullanılmalıdır. Bu nedenle, yüksek hassasiyetli konfokal mikroskoplarda bulunan z-Galvo gibi hızlı tarama yapan bir z-stack motorunun kullanılması önerilir33.
Not olarak, bu protokol üç ana sınırlama sunar. İlk olarak, herhangi bir plazmidin ekspresyon seviyelerini / eksprese eden hücrelerin sayısını in vivo olarak kontrol etmek genellikle zordur. Bu, aynı plazmid konsantrasyonunu korurken bile tüm dilimler arasında değişkenlik sağlar. Bu nedenle, kullanılan ifade vektörlerindeki düzenleyici unsurların seçimi dikkatle önceden belirlenmelidir. İkincisi, membran uçları kullanarak ayrıntılı olayların görüntülenmesi şu anda mümkün değildir. Bu ikinci sınırlama, önceki paragrafta önerilen metodolojik güncellemelerle aşılabilir. Son olarak, büyüme konileri ışığa duyarlıdır ve hızla fotobeyazlatılabilir. Bu nedenle, büyüme konilerinin sık sık görüntülenmesi, lazer tarama mikroskopları kullanılarak 5 dakika kadar kısa bir süre boyunca genellikle büyüme konilerini çökertebilir. Bu bağlamda, ışık tabakası mikroskobu ile üretilen cihazlardaki yeni ilerleme, beyin dilimlerinin uzun süreli görüntülenmesi için uyarlanabilir34.
Bunun gibi protokollerin, yeni araştırma yolları açması, bir büyüme konisinin karmaşık bir in vivo ortama doğru okuması ve tepki vermesi için ne gerektiğini daha iyi anlamasını ve daha da önemlisi, bu sofistike etkileşimin mekaniğini çözmesini sağlamak öngörülmektedir.

Nöronlar, sinir sistemindeki temel hesaplama birimini temsil eden oldukça polarize hücrelerdir. Giriş ve çıkış bölgelerinin bölümlere ayrılmasına dayanan bilgileri alırlar ve yayarlar: sırasıyla dendritler ve aksonlar1. Geliştirme sırasında, aksonlar hedeflerine ulaşmak için inanılmaz karmaşık bir ortamda gezinirken uzanır. Akson navigasyonu, gelişmekte olan aksonun ucunda bulunan duyusal bir yapı olan büyüme konisi tarafından yönlendirilir. Büyüme konisi, çevresel ipuçlarını tespit etmekten ve bunları sitoiskelet 2,3'ün dinamik mekansal yeniden düzenlenmesine çevirmekten sorumludur. Ortaya çıkan morfo-mekanik reaksiyonlar, büyüme konisine tetikleyici ipucundan uzamasını veya geri çekilmesini söyler ve bu da spesifik akson manevralarına yol açar.
Akson uzantısı ve büyüme konisi dinamiklerinin mevcut anlayışı, iki boyutlu (2D) substratlar 2,4,5,6,7 üzerinde akson büyümesini değerlendiren çalışmalardan kaynaklanmaktadır. Bu öncü çalışmalar, büyüme konileri ve büyüme substratları arasındaki sofistike etkileşimi tanımladı ve yapışkanlık ve sertlik gibi substrat özelliklerine bağlı çarpıcı farklılıklar ortaya koydu 8,9. Bu içgörülerin öncülüğünde, hücre dışı çevresel ipuçlarının akson büyümesini dikte ettiği varsayılmıştır, büyüme konisi sitoiskeletibu büyümeyi 2,10,11,12 gerçekleştirmiştir. Özellikle, nöronlar yapışkan olmayan substratlardaki aksonları uzatabilir (örneğin, poli-lizin, poli-ornitin)13. Ayrıca, substrat sertliği, hücre yapışkan komplekslerinden bağımsız olarak akson büyüme hızını etkileyebilir8. Bu nedenle, yalnızca 2B substratlardaki büyüme konisi dinamiklerini incelemek, aksonal büyüme konilerinin in vivo bulunanlar gibi fizyolojik olarak ilgili üç boyutlu (3B) ortamlarla etkileşiminden kaynaklanan kuvvetler dengesini doğru bir şekilde modelleyemez.
2D tahlillerin sınırlamalarının üstesinden gelmek için, akson büyümesi ve büyüme konisi dinamikleri 3D matrisler 8,9'da incelenmiştir. Bu matrisler daha fazla fizyolojik bağlam oluşturur, ancak akson büyümesinin hücre içi mekanizmalarının incelenmesine izin verir. Çeşitli koşullarda ve farmakolojik tedavilerde tek hücreli bir şekilde büyüme konisi muayenesine olanak sağlar9. Bu tür 3D ortamlarda, aksonlar farklı sitoiskelet dinamikleri sergiledi ve 2D kültürlü nöronlarda gözlemlenenlerden daha hızlı büyüdü9. Bu zarif çalışmalar, büyüme konisi sitoiskeletinin yeniden düzenlenmesi ve dolayısıyla davranışı üzerinde ekstra bir boyutun etkisini göstermiştir.
3D matrislerin 2D yüzeyler üzerinde yerli benzeri nöronal gelişimi ve akson büyümesini desteklemede sunduğu belirgin avantajlara rağmen, merkezi sinir sistemi (CNS) dokusunda gözlenen dinamiklerin karmaşıklığını yansıtamayan basitleştirilmiş sentetik bir iskele olmaya devam etmektedir. Burada, ex utero ve in utero elektroporasyon ile muhabir plazmidlerinin verilmesi, fizyolojik bir bağlamda büyüme konisi dinamiklerini analiz etmek için beyin organotipik dilim kültürü ve in situ canlı süper çözünürlüklü görüntüleme ile birleştirildi. Bu metodoloji, in vivo ortamların 3 boyutluluğunu ve fizikokimyasal bileşiminin karmaşıklığını deneyimlerken gelişmekte olan aksonların görselleştirilmesine izin verir. Son olarak, yaygın lisanslı ve halka açık yazılımlar kullanarak akson büyümesini ve büyüme konisi dinamiklerini ölçmek için kullanıcı dostu prosedürler açıklanmaktadır.

<table><tbody><tr><td>Adson Forseps</td><td>Güzel Bilim Araçları</td><td>11006-12</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488</td><td>Invitrogen</td><td>A21202</td><td>Keçi Anti-Fare</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 647</td><td>Invitrogen</td><td>A21236</td><td>Keçi Anti-Fare Anti-Vimentin</td></tr><tr><td>antikoru</td><td>sigma-Aldrich</td><td>V2258-.2ML</td><td>Monoklonal fare, klon LN-6, asit sıvısı</td></tr><tr><td>B27 takviyesi</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td></td><td></td>17504044</tr><tr><td>Betadine</td><td>B. Braun</td><td>3864154</td><td></td></tr><tr><td>Biozym Elek GP Agaroz</td><td>Biozyme</td><td>850080</td><td></td></tr><tr><td>Braunol, Spr&uuml; hflasche</td><td>B. Braun</td><td>3864073</td><td></td></tr><tr><td>Buprenorfin (Temgesic)</td><td>GEHE Pharma</td><td>345928</td><td></td></tr><tr><td>DAPI</td><td>sigma-Aldrich</td><td>D9542</td><td></td></tr><tr><td>DMZ unevirsal elektrot çektirmesi</td><td>Zeitz</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>Elektrikli tıraş makinesi</td><td>Andes</td><td>NA</td><td>ProClip UltraEdge Süper 2 Hızlı model</td></tr><tr><td>Enrofloksasin (Baytril)</td><td>Bayer</td><td>3543238</td><td>%2,5 (ağırlık/hacim)</td></tr><tr><td>Eppendorf mikro yükleyici pipet uçları</td><td>FischerScientific</td><td>10289651</td><td></td></tr><tr><td>Hızlı Yeşil FCF</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F7252-5G</td><td>Boya içeriği & ge; %85</td></tr> <tr><td>Fetal Sığır Serumu</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>10500064</td><td></td></tr><tr><td>Fiji 2.1.0</td><td>NIH</td><td>NA</td><td>https://imagej.net/software/fiji/downloads</td></tr><tr><td>İnce Makas</td><td>Güzel Bilim Araçları</td><td>14058-09</td><td>ToughCut/Düz/9cm</td></tr><tr><td>FluoroDish Hücre Kültürü Çanak</td><td>Dünyası Hassas Aletler</td><td>FD5040-100</td><td></td></tr><tr><td>Floromount Sulu Montaj Ortamı</td><td>sigma-Aldrich</td><td>F4680-25ML</td><td></td></tr><tr><td>Glikoz</td><td>MedPex</td><td></td><td>3705391 %5</td></tr> <tr><td>GlutaMAX Takviyesi</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>35050061</td><td></td></tr><tr><td>Glisin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G8898</td><td></td></tr><tr><td>HBSS</td><td>Yaşam Teknolojileri</td><td>14025092</td><td>kalsiyum, magnezyum, fenol içermez kırmızı</td></tr><tr><td>At serumu</td><td>Pan-Biotech</td><td>P30-0711</td><td></td></tr><tr><td>Imaris 9.7.2</td><td>Bitplane</td><td>NA</td><td>https://imaris.oxinst.com/products/imaris-for-neuroscientists</td></tr><tr><td>İzofluran</td><td>Virbac</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>İzotonik salin çözüm</td><td>B. Braun</td><td>8609261</td><td>%0,90</td></tr> <tr><td>Leica VT1200 S vibratom</td><td>Leica</td><td>14048142066</td><td></td></tr><tr><td>LSM 880 ile Airyscan</td><td>Zeiss</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>Metacam</td><td>Venusberg Apotheke</td><td>8890217</td><td>5 mg / ml</td></tr><tr><td>Fareler</td><td>Janvier Labs</td><td>NA</td><td>C57BL / 6JRj</td></tr><tr><td>Mikro Adson Forseps</td><td>Güzel Bilim Araçları</td><td>11018-12</td><td></td></tr><tr><td>Mikropipet Saklama Kavanozu</td><td>World Hassas Aletler</td><td>E210</td><td>&nbsp; 16.16.27</td></tr><tr><td>Microsoft Excel</td><td>Microsoft</td><td>NA</td><td>https://www.microsoft.com/en-us/microsoft-365/p/excel/cfq7ttc0k7dx?activetab=pivot:overviewtab</td></tr><tr><td>Milicell Hücre Kültürü Ekleme</td><td>EMD Millipore</td><td>PICM0RG50</td><td>30&nbsp; mm, hidrofilik PTFE, 0.4&nbsp; &mikro; m</td></tr><tr><td>Moria Delikli Kaşık</td><td>Güzel Bilim Araçları</td><td>10370-18</td><td></td></tr><tr><td>Moria Kaşık</td><td>Güzel Bilim Araçları</td><td>10321-08</td><td></td></tr><tr><td>Nörobazal Ortam, eksi fenol kırmızısı</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>12348017</td><td></td></tr><tr><td>Neuropan-2 takviyesi</td><td>Pan-Biotech</td><td>P07-11010</td><td></td></tr><tr><td>Normal keçi serumu</td><td>Abcam</td><td>ab138478</td><td></td></tr><tr><td>Olsen-Hegar Makaslı İğne Tutucu</td><td>Güzel Bilim Araçları</td><td>12002-12</td><td></td></tr><tr><td>p-Tub-alpha-1-Dre</td><td>Addgene</td><td>133925</td><td></td></tr><tr><td>p-Tub-alpha-1-iCre</td><td>Addgene</td><td>133924</td><td></td></tr><tr><td>p-Tub-alpha-1-LifeAct-GFP</td><td>Addgene</td><td>175437</td><td></td></tr><tr><td>Parafilm</td><td>VWR</td><td>52858-000</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehit</td><td>sigma-Aldrich</td><td>P6148</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P3813-10PAK</td><td></td></tr><tr><td>pCAG-lox-rox-STOP-rox-tRFP-lox-Lyn-ZsYeşil</td><td>Addgene</td><td>175438</td><td></td></tr><tr><td>pCAG-lox-STOP-lox-Lyn-mNeonGreen</td><td>Addgene</td><td>175257</td><td></td></tr><tr><td>Penisilin-Streptomisin</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>15140122</td><td></td></tr><tr><td>PicoNozzle Kiti v2</td><td>Dünya Hassas Aletleri</td><td>5430-ALL</td><td></td></tr><tr><td>Platin Cımbız</td><td>Harvard Aparatı</td><td>45-0487</td><td>1 mm / 3 mm</td></tr><tr><td>QIAGEN Maxi kiti</td><td>QIAGEN</td><td>12162</td><td></td></tr><tr><td>Refleks yara kapatma Klips</td><td>Dünyası Hassas Aletler</td><td>500344-10</td><td>7 mm</td></tr><tr><td>Sekundenkleber Pattex Mini</td><td>Trio Lyreco</td><td>4722659</td><td></td></tr><tr><td>Kare dalga elektroporasyon sistemi ECM830</td><td>Harvard Aparat</td><td>W3 45-0052</td><td></td></tr><tr><td>Steril gazlı bez</td><td>Braun Askina</td><td>9031216</td><td></td></tr><tr><td>Steril kayganlaştırıcı göz merhemi</td><td>Bayer Vital</td><td>PZN1578675</td><td></td></tr><tr><td>Steril cerrahi eldiven</td><td>Sempermed</td><td>14C0451</td><td></td></tr><tr><td>Sucrose</td><td>Roth</td><td>4621.2</td><td></td></tr><tr><td>Supramid 5-0 cerrahi ipek sütürler</td><td>B. Braun</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>İnce cidarlı cam kılcal damarlar</td><td>Dünya Hassas Aletler</td><td>TW100-4</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>X100</td><td></td></tr><tr><td>Vannas yaylı makas</td><td>Güzel Bilim Araçları</td><td>15000-03</td><td></td></tr><tr><td>&micro;-Slide 8 Kuyulu Cam Alt</td><td>Ibidi</td><td>80827</td><td></td></tr></tbody></table>

yerinde akut ex vivo embriyonik beyin dilimi kültürlerinde akson büyümesi ve büyüme koni dinamiğinin görselleştirilmesi

In Situ Visualization of Axon Growth and Growth Cone Dynamics in Acute Ex Vivo Embryonic Brain Slice Cultures

Nöronal gelişim sırasında, aksonlar nihai hedeflerine ulaşmak ve sinaptik bağlantılar kurmak için kortikal ortamda gezinirler. Büyüme konileri - gelişmekte olan aksonların distal uçlarında bulunan duyusal yapılar - bu süreci yürütür. Büyüme konisinin yapısını ve dinamiklerini incelemek, aksonal gelişimi ve sinir devreleri oluşturmasını sağlayan çevredeki merkezi sinir sistemi (CNS) ile etkileşimleri anlamak için çok önemlidir. Bu, temel araştırmalarda ve klinik öncesi bağlamlarda yaralanmayı takiben aksonları nöral devrelere yeniden entegre etmek için yöntemler tasarlarken esastır. Şimdiye kadar, büyüme konisi dinamiklerinin genel anlayışı öncelikle iki boyutta (2D) kültürlenmiş nöronların çalışmalarına dayanmaktadır. Kuşkusuz büyüme konisi yapısal dinamikleri ve uyaranlara verilen yanıt hakkındaki mevcut bilgi için temel olmasına rağmen, 2D çalışmalar, bozulmamış CNS dokusunda nöronal büyüme konilerinin karşılaştığı fizyolojik üç boyutlu (3D) ortamı yanlış temsil etmektedir. Daha yakın zamanlarda, bu sınırlamaların bazılarının üstesinden gelmek için kollajen jelleri kullanıldı ve 3D'de nöronal gelişimin araştırılmasını sağladı. Bununla birlikte, hem sentetik 2D hem de 3D ortamlar, CNS dokusu içinde, gelişmekte olan aksonların genişlemesini ve yol bulmasını yönlendiren sinyal ipuçlarından yoksundur. Bu protokol, gelişmekte olan aksonların fizyolojik olarak ilgili fiziksel ve kimyasal ipuçlarıyla karşılaştığı organotipik beyin dilimlerini kullanarak aksonları ve büyüme konilerini incelemek için bir yöntem sağlar. Süper çözünürlüklü mikroskopi ile birlikte floresan muhabirleri seyrek olarak sunmak için ince ayarlı in utero ve ex utero elektroporasyonu birleştirerek, bu protokol akson ve büyüme konisi dinamiklerinin in situ olarak görselleştirilmesi için metodolojik bir boru hattı sunar. Ayrıca, uzun vadeli ve canlı hücre görüntüleme verilerinin analizinin ayrıntılı bir araç seti açıklaması dahil edilmiştir.

Açıklanan yöntem iş akışıyla elde edilen temsili sonuçlar gösterilir. Bu gösterimde E15.5 fareleri kullanılmıştır, ancak bu protokol E11'den geç E17'ye kadar değişen hemen hemen tüm embriyonik yaşlara kolayca uyarlanabilir. Bu protokolde, ex utero elektroporasyon (EUE; Şekil 2A, 2C-I) veya in utero elektroporasyon (İEÜ; Şekil 2B, C ve 2J-Q), lateral ventrikülleri kaplayan progenitör nöronlara plazmidler vermek için kullanıldı. Bu progenitörler gelecekteki kortikal projeksiyon nöronlarının (CPN) kaynağıdır15,16. Plazmid karışımları, büyüme konilerindeki genel davranışı ve aktin dinamiklerini değerlendirmek için sırasıyla membran hedefli (Lyn)-mNeonGreen (Şekil 1A) veya LifeAct-enhanced (E) GFP'nin (Şekil 1B) seyrek nörona özgü ekspresyonunu sürmek için hazırlanmıştır. Ayrıca, bireysel nöronları turbo (t) -RFP veya zoanthus sp. (Zs) yeşil floresan proteini (ZsGreen) (Şekil 1C) ile etiketlemeyi amaçlayan bir plazmid karışımı dahil edilmiştir. Bu, bağımsız komşu nöronlardan büyüme konisi davranışının izlenmesini kolaylaştırır.
Elektroporated embriyolardan beyin diseksiyonu, doğal beyin yapısını koruyarak yüksek kaliteli dilimler elde etmek için dikkatlice yapılması gereken çok önemli bir adımdır. Diseksiyon aletleri ve vibratomlar önceden hazırlanmış ve dikkatli bir şekilde etanol sterilize edilmiştir (Şekil 3A,B). Daha sonra, elektroporate embriyoların kafaları dikkatlice diseke edildi ve beyinler çıkarıldı. Burada, EUE'ye tabi tutulan embriyolardan beyinlerin E15 (Şekil 3C-F) ve E12.5'te (Şekil 3G-J) temsili diseksiyonu gösterilmiştir. Beyinler hemen bir agaroz matrisi içine alınır, dilimlenir ve inkübasyon için alttan cam bir tabak içindeki PTFE membran eklerine yerleştirilir (Şekil 3K-M).
Beyin dilimlerinin sağlık durumu, güvenilir sonuçlar elde etmek için kontrol için önemli bir noktadır. Herhangi bir kontaminasyon için günlük olarak görsel bir inceleme yapıldı. Ek olarak, kültür tamamlandıktan sonra, beyin dilimleri sabitlenir ve immünohistokimyaya tabi tutulur. Burada, genel hücresel organizasyonu kontrol etmek için 4′,6-diamidino-2-fenilindol (DAPI) ve glial organizasyonu ortaya çıkarmak için vimentin boyama kullanıldı; özellikle, radyal glia (RG) iskelesi. Tipik olarak, İEÜ veya EUE'den türetilen başarılı kültürlenmiş beyin dilimleri, DAPI tarafından ortaya konduğu gibi normal hücresel dağılımı ve apikal yönelimli pial temas süreçleri17 ile biraz organize bir RG dizisi gösterir (sırasıyla Şekil 4A, B). Bazen, kültürlü beyin dilimlerindeki RG iskelesinde, özellikle EUE elektroporasyonundan türetilenlerde belirgin bozukluklar gözlenir (Şekil 4C). Son derece dağınık RG iskelesi olan beyin dilimleri, bozulmuş nöronal migrasyon ve kusurlu akson büyümesini gösterir (gösterilmemiştir). Bu nedenle, RG iskelesini kontrol etmek, güvenilir beyin dilimlerinden elde edilen verileri sıralamak için kolay bir kültür sonrası yöntemdir.
Lyn-mNeonGreen eksprese eden plazmid karışımı ile IUE veya EUE'den türetilen beyin dilimleri, benzer seyrek nöron etiketlemesine neden olur. Lyn-mNeonGreen'i ve büyüme konisinin dinamik davranışını ifade eden temsili bir piramidal CPN örnek olarak gösterilmiştir (Şekil 5A ve Ek Video 1, sol üstte). Ek olarak, nöronlar, aksonal büyüme konilerinin aktin dinamiklerini in situ olarak analiz etmek için bir aktin probu ifade eden bir plazmid kullanılarak etiketlendi (Şekil 5B ve Ek Video 1, sol altta). In situ deneyler ayrıca çift Cre / Dre florofor eksprese eden plazmid tasarımı ile gerçekleştirildi (Şekil 1C ve Ek Video 1, sağda). Bu plazmiddeki tRFP veya ZsGreen floroforları, komşu nöronlarda sırasıyla Dre veya Cre rekombinazları tarafından spesifik ve bireysel olarak aktive edilebilir (Şekil 5C). Bu deneysel diziliş, komşu modifiye nöronlarla kontrol nöronlarından (herhangi bir işlev kaybı veya kazancı) büyüme konilerinin yan yana analizine izin verir. Bu, kontrol ve deney koşullarını test etmek için farklı dilimlerin kullanılmasından kaynaklanan değişkenliği ortadan kaldırır.
Kaydedilen filmden üretilen kimograflar, zaman içinde çıkıntılı aktivite ve büyüme uzunluğu gibi dinamik büyüme parametrelerinin kolayca elde edilebileceği analiz edilmiştir (Şekil 6A). Hızlandırılmış çekimin zamansal çözünürlüğündeki basit bir ayarlamanın, 2 saat boyunca akson uzama hızının ölçülmesine izin verdiğini unutmayın (Şekil 6A). Ayrıca, büyüme konisi hacminin zaman içindeki değişimi - genel büyüme konisi dinamik aktivitesinin bir ölçüsü - bu durumda lisanslı yazılımlarla kolayca elde edilebilir (Şekil 6B ve Şekil 6E, F). Bu, aktin koşu bandının hızını ve büyüme konisi keşif aktivitesi sırasında filopodia / lamellipodia dengesini değerlendirmek için kullanılabilir.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63068/63068fig01.jpg"> Resim 1: Protokolde kullanılan plazmidlerin şemaları . (A) pCAG-lox-STOP-lox-Lyn-mNeonGreen. (B) p-Tub-alpha-1-LifeAct-GFP. (C) pCAG-lox-rox-STOP-rox-tRFP-pA-lox-ZsGreen-pA. Plazmid bileşenleri ve floroforun kökeni ile ilgili bilgiler kutularda bulunur. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63068/63068fig01large.jpg" target="_blank">Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63068/63068fig02.jpg"> Şekil 2: E15.5 farelerin ex utero ve in utero elektroporasyonunun iş akışı. (A) Ex utero elektroporasyon için ameliyat istasyonunun kurulması. (B) In utero elektroporasyon için ameliyat istasyonunun kurulması. (C) Anestezi uygulanan farenin karın boşluğunun dışına çekilen uterus boynuzları. (D) Rahim çuvalından embriyonun çıkarılması. (E) Diyagonal bir kesi yoluyla tam omurilik transeksiyonu ile embriyo kurban edilmesi; kafa kesmenin önlendiğini unutmayın. (F) Embriyonun tutucuya yerleştirilmesi ve sol lateral ventriküle DNA/Hızlı Yeşil karışımı enjekte edilmesi. (G,H) Embriyonun kafasını platin cımbız elektrotlar arasına katot (kırmızı ok) ile korteks üzerinde 60° açıyla yerleştirin. (I) İşlem sırasında embriyonun kaymasını önlemek için embriyonun kollarının (siyah oklar) tutucunun dışına yerleştirilmesi. (J) Kafayı açığa çıkarmak için embriyonun uterus çuvalı içinde dönmesi. (K,L) DNA/Hızlı Yeşil karışımının uterus duvarından embriyonun lateral ventriküllerine enjekte edilmesi. (M) Embriyonun kafasını platin cımbız elektrotlar arasında korteks üzerinde 60° açıyla bir katot (kırmızı ok) ile konumlandırın. (N) Koşu kilitleme dikişi ile dikişli kas kesisi. (O) Kesilen bir dikiş yoluyla dikişli cilt kesisi. (P) Cerrahi yara klipsleri kullanılarak yaranın sabitlenmesi ve betadin kullanılarak dezenfeksiyon. (Q) Farenin uzak kızılötesi ısınma ışığı ile kurtarma kafesine yerleştirilmesi. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63068/63068fig02large.jpg" target="_blank">Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63068/63068fig03.jpg"> Şekil 3: E15.5 ve E12.5 beyinlerinin çıkarılması ve organotipik dilim kültürü prosedürü. (A) Beyin ekstraksiyon prosedürü için kullanılan araçlar. (B) Organotipik kültür istasyonunun kurulması. (C-F) E15.5 beyninin çıkarılması. (G-J) E12.5 beyninin çıkarılması. Noktalı çizgiler insizyonların yerini vurgular. Kırmızı oklar forseps tarafından çekilme yönünü işaret ediyor. (K) Beyni %3 düşük erimiş agaroz içeren 3 cm'lik bir kaba gömerek beynin altında 1-2 mm'lik bir agaroz aralığı boşluğu bırakır. (L) 150 μm beyin diliminin toplanması. (M) Beyin dilimlerinin, parafin film (mavi ok) kullanılarak 35 mm'lik bir kapta hareketsiz hale getirilmiş PTFE membran eklerine yerleştirilmesi. Kırmızı yıldız işareti, vibratomdan (L) belirli bir beyin dilimi koleksiyonunu ve PTFE membranına (M) transferini gösterir. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63068/63068fig03large.jpg" target="_blank">Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63068/63068fig04.jpg"> Şekil 4: Sağlıklı organotipik dilimlerde korunmuş radyal glial hücre yapısı. E17.5 beyin dilimlerinin konfokal görüntüleri, İEÜ (A) ve EUE (B,C) sonrasında RG dizisini (vimentin; yeşil) ve genel hücre organizasyonunu (DAPI; macenta) ortaya koymaktadır. RG dizisinde zaman zaman EUE (C) 'den kaynaklanabilecek güçlü bozulmalara dikkat edin. Büyütmeler, ana şekildeki kırmızı noktalı çerçevelere karşılık gelir: ölçek çubukları, 10 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63068/63068fig04large.jpg" target="_blank">Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63068/63068fig05.jpg"> Şekil 5: Akut organotipik dilimlerde büyüme konisi dinamiklerinin yerinde görselleştirilmesi. (A,B) Nöronlar ve bunlara karşılık gelen büyüme konileri sırasıyla Lyn-mNeonGreen ve LifeAct-GFP ile etiketlenmiştir. Lyn-mNeonGreen'in büyüme konisini işaretleyen kırmızı yıldız, nöronu ifade eder. Nöronu ifade eden LifeAct-GFP'nin büyüme konisini gösteren mavi yıldız işareti. (C) tRFP (macenta) ve ZsGreen (yeşil) içeren çift plazmid sistemi ile etiketlenmiş komşu nöronlar ve bunlara karşılık gelen büyüme konileri. Görüntülenen büyüme konileri (sağda), yakalanan çerçevenin (solda) dışındaydı ve büyüme konisi zaman atlamalı olarak elde edildikten kısa bir süre sonra elde edildi; ölçek çubukları, 5 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63068/63068fig05large.jpg" target="_blank">Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63068/63068fig6v2.jpg"> Şekil 6: Akson büyüme hızının ve büyüme konisi hacminin analizi . (A) ImageJ kullanılarak oluşturulan Lyn-mNeonGreen'i (üstte) ve buna karşılık gelen kimografı (aşağıda) ifade eden bir nöron üzerinde akson izleme. (B) Görüntü analiz yazılımı (üstte) kullanılarak büyüme konisinin z-yığın videosunun ve yüzeyler ölçüm aracı (aşağıda) kullanılarak vurgulanan aynı büyüme konisinin yeniden yapılandırılması. (C) Birkaç akson için zaman içinde büyüme hızındaki değişiklikleri gösteren grafikler. (D) Aksonların ortalama büyüme hızı (C) cinsinden ölçülür. (E) Büyüme konisi hacmindeki zaman içindeki değişiklikleri gösteren grafik. (F) Büyüme konilerinin ortalama hacmi (E) cinsinden ölçülür; ölçek çubuğu, 5 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63068/63068fig6v2large.jpg" target="_blank">Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63068/63068fig07.jpg"> Şekil 7: Radyal migrasyon ve piramidal kortikal nöronların nöronal polarizasyonu. Germinal ventrikül bölgesinden (VZ) pia yüzeyine doğru radyal olarak göç eden piramidal kortikal nöronların (pembe) gelişimini gösteren diyagram. Radyal glia süreçleri (gri) tarafından yönlendirilen göç eden polarize nöronlar, ara bölgeye (IZ) doğru aşağı doğru uzanmaya devam eden öncü bir süreç, gelecekteki dendrit ve takip eden süreç, gelecekteki akson oluşturur. Kesikli kırmızı kutular, büyüme konilerinin görüntülendiği kortikal alanları temsil eder. Özellikle IZ, subventriküler bölge (SVZ) veya akson demetlerinin birleştirilmesinde (yeşil). Çizim, BioRender.com web tabanlı bir araçla oluşturulmuştur. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63068/63068fig07large.jpg" target="_blank">Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Plasmid</td>
			<td>Konsantrasyon (μg/μL)</td>
			<td>Kullanım amacı</td>
		</tr>
<tr>
<td>pCAG-lox-STOP-lox-Lyn-mNeonYeşil</td>
			<td>0.25</td>
			<td rowspan="3">Membran hedefli proteinin (Lyn) etiketlenmesi</td>
		</tr>
<tr>
<td>+</td>
			<td>+</td>
		</tr>
<tr>
<td>p-Küvet-alfa-1-iCre</td>
			<td>0.08</td>
		</tr>
<tr>
<td>p-Küvet-alfa-1-LifeAct-GFP</td>
			<td>0.125</td>
			<td>Büyüme konilerinde filamentli aktin (F-aktin) etiketleme</td>
		</tr>
<tr>
<td>pCAG-lox-rox-STOP-rox-tRFP-lox-Lyn-ZsYeşil</td>
			<td>1</td>
			<td rowspan="5">Komşu nöronların iki popülasyonunun bağımsız etiketlenmesi</td>
		</tr>
<tr>
<td>+</td>
			<td>+</td>
		</tr>
<tr>
<td>p-Küvet-alfa-1-iCre</td>
			<td>0.004</td>
		</tr>
<tr>
<td>+</td>
			<td>+</td>
		</tr>
<tr>
<td>p-Küvet-alfa-1-Dre</td>
			<td>0.2</td>
		</tr>
</tbody></table>Tablo 1: Protokolde kullanılan plazmidlerin listesi. Kullanılan her plazmidin adı, konsantrasyonu ve kullanım amacı.
Ek Video 1: Akut organotipik dilimlerde büyüme konisi dinamiklerinin yerinde görselleştirilmesi. Lyn-mNeonGreen (sol üstte) ve LifeAct-GFP (sol altta) ile etiketlenmiş büyüme konilerinin dinamikleri. Komşu büyüme konileri, tRFP (macenta; sağ üstte) ve ZsGreen (yeşil; sağ altta) içeren çift plazmid sistemi ile farklı şekilde etiketlenmiştir. Görüntüleme aralığı, 2,5 s. Ölçek çubukları, 5 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63068/Supplementary_Video_1.mp4" target="_blank">Bu Dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayın.</a>

Bu protokol, in situ akson büyümesi ve büyüme konisi dinamiklerini incelemek için basit ve sağlam bir yöntem göstermektedir. Fizyolojik olarak ilgili akut beyin dilimlerinin ex vivo olarak nasıl hazırlanacağını açıklar ve kullanıcı dostu bir analiz boru hattı sağlar.

Yerinde Akut Ex Vivo Embriyonik Beyin Dilimi Kültürlerinde Akson Büyümesi ve Büyüme Koni Dinamiğinin Görselleştirilmesi

During neuronal development, axons navigate the cortical environment to reach their final destinations and establish synaptic connections. Growth cones ...

Aksonların karmaşık merkezi sinir sistemi matrisinde nasıl gezindiği, nörobiyolojide temel bir sorudur. Bu protokol, yüksek çözünürlüklü görüntüleme ile fizyolojik ortamda akson büyümesi ve büyüme konisi dinamiklerinin incelenmesini sağlar. Bu protokol, fare embriyonik beyninde DNA'nın verilmesi için kullanıcı dostu uçtan uca bir boru hattını, yüksek kaliteli organotipik dilimler için hazırlıkları ve görüntü elde etme ve analiz için adım adım bir kılavuzu açıklamaktadır.Başlangıçta embriyonik merkezi sinir sistemindeki akson dinamiklerini incelemek için tasarlanmış olmasına rağmen, bu protokol organotipik kültüre ve travmatik veya patolojik durumlardan sonra akson plastisitesinin görselleştirilmesine izin verecek şekilde ayarlanabilir. Protokolün kendisi nispeten basittir. Bununla birlikte, ilk etiketlemesini ve beyin yapılarının korunmasını sağlamak kritik noktalardır.Bu nedenle, elektroporasyon, beyin diseksiyonu ve dilimleme adımları ekstra özen gerektirir. Prosedürün gösterilmesi yardımcı olacaktır ve doktora öğrencisi Bracket'ın laboratuvarındandır. Hamile bir kadın fareyi uyuşturduktan sonra, embriyolar arasındaki boşlukları dikkatlice yakalayarak, ılık salin veya forsepslere batırılmış bir pamuk tomurcuğu kullanarak her iki uterus boynuzunu da çıkarmak için bir kesi yapın.Sonra embriyoları ıslak gazlı bez üzerine yerleştirin. Rahim kesesini kestikten sonra açın, her embriyoyu çıkarın. Embriyoları, buz üzerinde glikoz ile desteklenmiş HBSS içeren 10 santimetrelik bir kaba yerleştirin.Ex utero elektroporasyon için, bir embriyo alın ve tutucuya yerleştirin. Daha sonra DNA hızlı yeşil karışımını içeren cam kılcal damarı embriyo kafatasından lateral ventriküle dikkatlice yerleştirin ve her ventriküle DNA plazmid karışımının iki ila üç mikrolitresini enjekte edin. Daha sonra, embriyonun kafasını platin cımbız elektrotları arasında, istenen beyin bölgesini hedeflemek için uygun açıda tutun, katot DNA transferinin amaçlandığı alana bakar.In utero elektroporasyon için, uterus boynuzlarını çıkardıktan ve embriyoları daha önce gösterildiği gibi ıslak bir gazlı bez üzerine yerleştirdikten sonra, lambdoidal ve saggital sütürler yerleştirilene kadar embriyoyu uterusun içinde yavaşça döndürmek için parmak uçlarını kullanın. Daha sonra, DNA hızlı yeşil karışımını içeren cam kılcal damarı uterus duvarından ve embriyo kafatasından lateral ventriküle dikkatlice yerleştirin ve DNA plazmid karışımının iki ila üç mikrolitresini, ventrikül başına maksimum iki mikrolitre ile istenildiği gibi bir veya iki ventriküle enjekte edin. Enjeksiyondan sonra, embriyonun kafasını platin cımbız elektrotları arasında uygun açıda tutun ve istenen beyin bölgesini hedef almak için katot DNA transferinin amaçlandığı alana bakar.Gerekli tüm embriyolar elektroporasyondan sonra, uterus boynuzlarını nazikçe karın boşluğunun içine yerleştirmek için tuzlu suyla ıslatılmış bir pamuk tomurcuğu kullanın. Kas ve cilt kesilerini 5-0 dikiş malzemesi kullanarak dikişleyin, ardından dikiş klipslerini kullanarak yarayı sabitleyin ve betadin püskürterek yarayı dezenfekte edin. Fareyi kurtarma kafesine geri yerleştirin ve işlem sonrası en az 20 dakika boyunca uzak bir kızılötesi ısıtma ışığı kullanarak sıcaklığı koruyun.Embriyonun kafasını diseksiyon mikroskobu altında sabitleyin. Daha sonra kafatasındaki deriyi, başın tabanından başlayarak buruna doğru orta hat boyunca keserek çıkarın. Kafatasındaki cildi yanal olarak soyun, beynin eksize edilmesi için yeterince büyük bir boşluk bırakın.Daha sonra, beyni çıkarmak için, koku alma ampulünün altından başlayıp beyin sapına doğru hareket eden steril diseksiyon makaslarının kapalı ucunu yerleştirin. Sonra beyin sapını kesin ve beynin etrafındaki birçok gevşek meninks parçasını kesin. Delikli bir kaşık kullanarak beyni alın ve kaşığın altını kuru mendil kağıdına batırarak fazla sıvıyı çıkarın.Sonra beyni buz üzerinde bir agaroz kabına yerleştirin. Daha sonra, daha küçük bir kaşık kullanarak agarozu soğutmak için 10 saniye boyunca karıştırın, ardından beyni sırt tarafı yukarı doğru yatay olarak yerleştirerek ve her yönden tamamen agarozla kaplanmasını sağlayarak kabın ortasına doğru manevra yapın. Agaroz bloğunu Vibratome iş istasyonundan yavaşça alın ve kağıt mendile vurarak tabanı kurulayın.Daha sonra bloğu numune tutucunun yapıştırılmış alanına, beynin rostral tarafı yukarı bakacak şekilde yerleştirin ve numune tutucuyu buzun üzerine koyun. Tutkalın bir dakika kurumasını bekleyin. Beyni koronal dilimler halinde 15 derecelik bir açıyla kesin.Daha sonra temiz spatulalar kullanarak, beyin dilimlerini toplayın ve Parrafin kullanarak 35 milimetrelik bir cam alt kapta hareketsiz hale getirilmiş bir PTFE membranına yerleştirin. Membran başına beş adede kadar beyin dilimi toplayın. Daha sonra, 200 mikrolitrelik bir pipet kullanarak, fazla HBSS glikoz çözeltisini membran üzerindeki dilimlerin etrafından çıkarın ve dilimleri yarı kuru bırakın, ardından 500 mikrolitre önceden ısıtılmış dilim ortamını doğrudan membranın altındaki boşluğa ekleyin ve dilimleri% 5 karbondioksit ile 35 santigrat derecede inkübe edin.Akson büyümesini görüntülemek için, düşük ila orta hücre yoğunluğuna sahip bir korteks bölgesi bulun. Büyüme konisi dinamiklerini görüntülemek için, korteksin hemen bölgesinde veya subventriküler bölgesinde bir büyüme konisi bulun. Ardından bir Z yığını boyutu tanımlayın.Büyük bir Z yığınında akson büyümesi için, iki mikrometrelik bir adım boyutu ayarlayın ve daha küçük bir Z yığınındaki büyüme konileri için bir mikrometrelik bir adım boyutu ayarlayın. Veri analizi için, dosya'yı tıklatıp açıp görüntüyü seçerek görüntü dosyasını Fiji'de açın. Görüntüye tıklayarak zaman atlamasının maksimum yoğunluk projeksiyonunu, ardından yığınlar, Z projeksiyonu ve maksimum yoğunluk projeksiyonunu elde edin.Zaman atlamalı yoldan geçin ve büyüyen bir akson bulun. Yerleştirildikten sonra, ilk karedeki aksonun ucundan başlayarak ve aksonu tüm zaman atlaması boyunca takip ederek büyüyen akson boyunca bir çizgi çizin. Ardından, eklenti kymo re-slice genişliğinde şarkı söyleyin.Görüntüye, ardından özelliklere giderek kimografın ölçeğini ayarlayın. Mesafeyi mikrometre ve piksel genişliğini ve saniye veya dakika cinsinden süreyi ve piksel yüksekliğini ayarladıktan sonra analiz etmeye gidin ve ölçüye tıklayın. Büyüme konisinin hacmini ölçmek için, dosyayı tıklatıp açıp ilgilendiğiniz dosyayı seçerek görüntü dosyasını görüntü analiz yazılımında açın.Ardından, birinci adımda yeni yüzeyler ekleme sihirbazını seçin, algoritma ayarları altında yalnızca ilgilenilen bir bölgeyi segmentlere ayır'ı seçin ve ikinci adımda, çerçeveyi tüm çerçevelerdeki tüm büyüme konisine sığacak şekilde kırpın. Üçüncü adımda, eşiği mutlak yoğunluğa tutun ve dördüncü adımda, tüm büyüme konisi bölgesinin eşik olduğundan emin olun. Daha sonra beşinci adımda, filtre türü altında LMG voksel sayısını bire seçin.Tüm oluşturma adımlarını gerçekleştirmek ve yeni yüzeyler ekleme sihirbazını sonlandırmak için yürüt düğmesini seçin. Son olarak, sihirbaz penceresinin üst kısmındaki istatistikler sekmesinde, ayrıntılı sekmenin altındaki belirli değerleri ve hacmi seçin. Tipik olarak, in utero veya ex utero elektroporasyondan türetilen başarılı bir şekilde kültürlenmiş beyin dilimleri, normal hücresel dağılımı ve apikal yönelimli pilo ile temas eden süreçlere sahip organize bir radyal glia dizisini gösterir.Bazen radyal glial iskelede ex utero elektroporasyon belirgin bozukluklar gözlenir ve kültürlenmiş beyin dilimleri bu kontrol boyamasını tavsiye eder. Lyn-mNeonGreen'i ve büyüme konisinin dinamik davranışını ifade eden temsili bir piramidal kortikal projeksiyon nöronu burada gösterilmiştir. Ek olarak, nöronlar, aksonal büyüme konilerinin in situ aktin dinamiklerini analiz etmek için aktin probu eksprese eden bir plazmid kullanılarak etiketlendi.In situ deneyler ayrıca, tRFP veya ZsGreen floroforlarının, komşu nöronlarda sırasıyla dre veya cre rekombinazları tarafından spesifik ve bireysel olarak aktive edilebildiği plazmid tasarımını ifade eden bir çift cre dre florophore ile gerçekleştirildi. Kimografilerden, birkaç akson için büyüme hızı ve zaman içindeki büyüme konisi hacmi gibi dinamik büyüme parametreleri kolayca elde edilir. Bu, aktin koşu bandının hızını ve büyüme konisi keşif aktivitesi sırasında filopodia ve lamellapodia arasındaki dengeyi değerlendirmek için kullanılabilir.Seyrek etiketleme elde etmek için beyin yapısını korumak ve plazmid konsantrasyonlarına ince ayar yapmak önemlidir. Bu, korteksteki aksonların ve büyüme konilerinin doğru bir şekilde görselleştirilmesi için çok önemlidir. Seçilen plazmalara ve genetik arka plana bağlı olarak, bu protokol kullanıcıların nöronları veya içinde büyüdükleri ortamı değiştirmelerine izin vererek çok çeşitli çalışmalara izin verir.Bu teknik, in situ nöronlara yüksek çözünürlüklü erişim sağlayarak, sinirbilimcilerin büyüme konileri ile merkezi sinir sistemi metrikleri arasındaki dinamik etkileşimi hem morfolojik hem de moleküler seviyelerde sorgulamalarını sağlar.

in-situ-visualization-axon-growth-growth-cone-dynamics-acute-ex-vivo

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Sinirbilim

Biz periferik sinir akıbet ekimi ve zaman atlamalı görüntüleme için gebeliğin orta fare embriyo Organotipik dilim hazırlamak için bir yöntem mevcut.

Organotipik Dilim Kültür GFP-Periferik Sinir akıbet Gerçek zamanlı Görüntüleme Fare Embriyolar ifade

Bu protokol, postnatal beyin ve rostral göçmen akışı neuroblast göç yüksek çözünürlüklü zaman atlamalı görüntüleme için optimize edilmiş bir Organotipik dilim tahlil açıklamaktadır.

Doğum Sonrası Beyin Nöronal Göç Yüksek Çözünürlüklü Zaman Aşımı Görüntüleme için bir Organotipik Dilim Testi

Bu video, transgenik fare embriyolarından alınan okülomotor dilimlerin ex vivo kültürünü ve görüntülemesini göstermektedir. Embriyolar izole edilir ve agaroza gömülür. Bir vibratom kullanılarak, okülomotor çekirdekleri ve gözleri içeren dilimler elde edilir. Dilimler kültürde tutulur ve bir floresan mikroskobu kullanılarak görüntülenir.

Transgenik Fare Embriyolarından Okülomotor Kesitlerin Ex Vivo Kültürü ve Görüntülenmesi

Kaynak: Wiegreffe, C., et. al.,  {{}}In Utero Elektroporasyon. J. Vis. Uzm. {{TAG_ 44}} (2017) Bu video, transdüksiyonlu fare embriyonik beyin dilimlerinde radyal glial iskeleler yoluyla subventriküler bölgeden kortikal plakaya kortikal nöron radyal göçünü gözlemlemek için hızlandırılmış konfokal mikroskopiyi göstermektedir.

Transdüksiyonlu Fare Embriyonik Beyin Dilimlerinde Kortikal Nöron Radyal Migrasyonunun Hızlandırılmış Görüntülenmesi

Neuroblast göç postnatal nörojenezindeki temel bir olaydır. Biz akut beyin dilimleri zaman atlamalı görüntüleme kullanarak in vivo doğum sonrası elektroporasyon ve onların göç sonraki görselleştirme tarafından neuroblasts verimli etiketleme için bir protokol açıklar. Biz video izleme tarafından neuroblast dinamiklerinin kantitatif analiz için bir açıklama içerir.

Fare Akut Beyin Dilimleri Neuroblast Göç vivo Doğum Sonrası Elektroporasyonla ve Time-lapse Görüntüleme

Nöral progenitör mitoz nöron kritik bir parametredir. Nöral progenitör mitoz anlayışımızın çok sabit doku analizine dayanmaktadır. Embriyonik beyin dilimleri Canlı görüntüleme, kontrollü bir ortamda, yüksek zamansal ve mekansal çözünürlük ile mitoz değerlendirmek için çok yönlü bir tekniktir.

Gelişmekte Fare Embriyonik Cortex mitoz Canlı Görüntüleme

Işık mikroskobu teknikleri, biyokimyasal tahlillerle birleştiğinde, netrin bağımlı akson dallanmasında SNARE aracılı ekzositozun katılımını aydınlatmaktadır. Bu tekniklerin kombinasyonu, akson dallanmasını ve hücre şekli değişikliğini kontrol eden moleküler mekanizmaların tanımlanmasına izin verir.

Kombine Metodolojileri kullanan Akson Dallanman ve Nöronal Morfogenez sırasında Plazma Membran Teslimat Rolü tanımlayın

Bu protokol, radyal olarak göç eden kortikal nöronların doğrudan gözlenmesi için talimatlar sağlar. N utero elektroporasyonda, organotipik dilim kültürü ve zaman atlamalı konfokal görüntüleme, göç eden nöronlardaki ilgi genlerinin aşırı ekspresyonunun veya downregülasyonunun etkilerini doğrudan ve dinamik olarak incelemek ve gelişme sırasındaki farklılaşmalarını analiz etmek için birleştirilir.

Embriyonik Fare Beyni Organotipik Dilim Kültüründe Nöronların Geçiş Sürekli Konfokal Görüntüleme Kullanımı<em&gt; Utero&#39;da</em&gt; Elektroporasyon

Burada, electroporated beyin organotypic dilim kültürler fare embriyo confocal mikroskobu ve canlı görüntüleme teknikleri için uygun oluşturmak için düşük maliyetli ve güvenilir bir yöntem sağlamak.

Eski Utero Elektroporasyon ve embriyonik fare beyni canlı görüntüleme, GABAergic Interneurons geçiş için Organotypic dilim kültürleri

Burada, motor nöron projeksiyon ve transgenik Hb9::GFP fare embriyo axon arborization görüntülenmesi için bir protokol açıklayın. Motor nöronlar için immunostaining sonra hafif levha Floresans mikroskobu Image embriyolar için sonraki kantitatif analiz için kullanılan. Bu iletişim kuralı diğer nöron gezinti süreçlerinde merkezi sinir sistemi için geçerlidir.

Görselleştirme Motor Axon navigasyon ve hafif levha Floresans mikroskobu kullanarak fare embriyo Axon Arborization miktar

Bir ex vivo dilim tahlil gerçek zamanlı olarak görüntülenmiş olmak okülomotor sinir büyüme sağlar. Dilim E 10.5 ISLMN katıştırarak oluşturulur: agarose 'de Gfp embriyolar, bir vibratom üzerinde dilimleme, ve bir aşama-üst kuluçç büyüyen. Axon rehberlik yollarının rolü, kültür ortamına inhibitörler ekleyerek değerlendirilir.

Olomotor sinir gelişimi için zaman aşımı görüntüleme için embriyonik GFP-Ifade fareler dan ex vivo okülomotor dilim kültürü

Keşfedin fare embriyonik beyin dilimlerinde akson büyümesi ve büyüme koni dinamiğini yüksek çözünürlüklü görüntüleme ile. Bu yöntem, nörogelişim ve plastisite mekanizmalarını incelemek için güçlü bir çerçeve sunar.

Yerinde Akut Ex Vivo Embriyonik Beyin Dilimi Kültürlerinde Akson Büyümesi ve Büyüme Koni Dinamiğinin Görselleştirilmesi

Daha fazla video keşfet