PCR-Plate Deep Well Microplate Cihazları Kullanılarak Daha Büyük Bakteriyel Biyofilm Biyokütlesinin Oluşturulması
April 22nd, 2022
Bu protokol, yüksek verimli 96 kuyulu sabitlenmiş kapak statik biyofilm taraması için kendinden montajlı derin kuyu PCR plakalı cihazları kullanarak biyofilm büyümesi ve biyokütle ölçümleri yapmak için metodoloji sunar.
Bu prosedürün amacı, standart mandal kapağı biyofilm cihazını, kristal menekşe boyama ve antimikrobiyal duyarlılık testi yoluyla bir polipropilen derin kuyu biyofilm cihazıyla karşılaştırmaktır. Standart bir mandal kapaklı biyofilm cihazı 96 mandala sahiptir ve yüksek verimli biyofilm deneylerine izin veren standart 96 delikli mikrotitre plakasının üzerine sığar. Mandal kapağı, biyofilm büyümesi için bir yüzey sağlar ve mandallar üzerinde yetiştirilen biyofilmler, aşağı akış deneylerinde daha fazla analiz edilebilir.
Bununla birlikte, plakalar maksimum 200 mikrolitre hacim kullanır, bu da daha fazla miktarda biyofilm gerektiren deneyler kullanarak biyofilm oluşumunu ve biyokütleyi incelemeyi zorlaştırır. Burada, statik biyofilm yetiştirmek için derin kuyu biyofilm cihazını tanımlıyoruz. Derin kuyu biyofilm cihazı, mandal kapağı olarak yarı etekli 96 kuyucuklu bir PCR plakası ile donatılmış 96 kuyu derinliğinde bir mikrotitre plakası kullanır.
Bu yöntem, maksimum 750 mikrolitre plaka hacmine izin verir, biyofilm büyümesi için daha fazla mandal yüzey alanı sağlar ve standart biyofilm cihazına kıyasla daha düşük maliyetlidir. Biyofilm biyokütlesini belirlemek için biyofilmlerin kristal menekşe boyama protokollerini ve MBEC olarak da bilinen minimum biyofilm eradikasyon konsantrasyonunun belirlenmesini açıklayacağız ve karşılaştıracağız. Gösterilen, açıklanacak denemeye şematik bir genel bakıştır.
Kriyokorunmuş bir stoktan istenen bakteri suşlarını doğrudan bir besin agar plakasına doğru çizgileyin. Agar plakalarını optimum gerinim koşullarıyla gece boyunca inkübe edin. Ertesi gün, beş mililitre büyüme ortamında tek bir koloni aşılayın ve bir gecede bir inkübatörde kültürleri büyütün.
Biyofilm plakaları gösterildiği gibi doldurulacaktır. Dış kuyucukları 750 mikrolitre steril su ve negatif kontrol kuyularını 750 mikrolitre steril büyüme ortamı ile doldurun. Kalan kuyucukları 675 mikrolitre steril büyüme ortamı ile doldurun.
Gece kültürlerini 600 nanometre 1.0'da optik yoğunluğa standartlaştırın. 10 ila eksi üç seyreltmeye ulaşılana kadar on kat seyreltme serisi oluşturun. Medya kuyularını 10 ila eksi üç seyreltilmiş kültürle aşılayın ve 10'dan eksi dörde kadar nihai bir bakteri seyreltmesi ve 750 mikrolitrelik nihai toplam kuyu içi hacim için.
Mandal kapağını biyofilm plakasına dikkatlice yerleştirin. Plakaları optimum gerinim koşullarında 24 saat boyunca maksimum 160 RPM sallama ile inkübe edin. Mandal kapağını biyofilm büyüme plakasından dikkatlice çıkarın ve biyofilmleri kuyu başına 800 mikrolitre steril PBS ile doldurulmuş yeni bir derin kuyucuk plakasında durulayın.
Mandal kapaklarını, hacim kristal menekşe çapında% 0.1 ağırlıkta kuyucuk başına 800 mikrolitre içeren yeni bir derin kuyu plakasına aktarın ve beş dakika boyunca lekelenmeye bırakın. Fazla lekeyi çıkarmak için kapakları PBS ile doldurulmuş taze derin bir kuyucuk plakasında tekrar durulayın. Kapakların bir biyogüvenlik kabininde 10 dakika kurumasına izin verdikten sonra, mandalları beş dakika boyunca kuyu başına 800 mikrolitre% 30 münzevi asit ile doldurulmuş derin bir kuyucuk plakasında destain yapın.
Mandal kapağını çıkarın ve lekeyi eşit şekilde dağıtmak için iyice karıştırın. Derin kuyu biyofilm cihazından 200 mikrolitreyi standart bir 96 delikli mikrotitre plakasına aktarın ve optik yoğunluğu 550 nanometrede okuyun. Antimikrobiyal meydan okuma plakaları gösterildiği gibi hazırlanacaktır.
Dış kuyucukları 750 mikrolitre steril suyla, pozitif ve negatif kontrol kuyularını ise 750 mikrolitre büyüme ortamı ile doldurun. Kalan kuyucukları istenen antimikrobiyal seyreltme serisinden 750 mikrolitre ile doldurun. Mandal kapağını cihazdan dikkatlice çıkarın ve PBS kuyusu başına 800 mikrolitre içeren steril bir derin kuyucuk plakasında durulayın.
Mandal kapağını antimikrobiyal meydan okuma plakasına aktarın ve istenen maruz kalma süresi için inkübe edin. Antimikrobiyal maruz kalma plakasından mandal kapaklarını aseptik olarak çıkarın ve steril derin kuyucuklu PBS dolu bir plakada durulayın. Mandal kapağını PBS'den çıkarın ve kuyu başına 750 mikrolitre geri kazanım ortamı içeren yeni bir derin kuyu plakasına aktarın.
Plakayı 30 dakika boyunca sonik bir su banyosunda sonikleştirin. Mandal kapağını çıkarın ve kontaminasyonu önlemek için standart sabitlenmemiş düz üst mikrotitre plaka kapağı ile değiştirin. Gece boyunca optimum gerinim koşullarında inkübe edin.
Ertesi gün, derin kuyucuk plakasından standart bir mikrotitre plakasına 200 mikrolitre aktarın ve optik yoğunluğu 600 nanometrede okuyun. Kristal menekşe boyama, bakteriyel biyofilmlerin biyokütlesine yaklaşmak için etkili ve yaygın olarak kullanılan bir yöntemdir. Standart ve derin kuyu cihazlarının kristal menekşe boyaması, her iki bakteri türünün de standart biyofilm cihazına kıyasla 2.1 kat daha fazla biyokütle oluşturan Escherichia coli ve 4.1 kat daha fazla biyokütle oluşturan Pseudomonas aeruginosa ile standart cihaza kıyasla derin kuyu cihazında önemli ölçüde daha fazla biyokütle büyüdüğünü göstermiştir.
Bu sonuçlar, derin kuyu biyofilm cihazının artan yüzey alanının artan biyokütle birikimine izin vereceği hipotezimizle tutarlıydı. Derin kuyu cihazında büyüyen her iki suş için teknik replikasyon CV boyalı değerlerdeki daha fazla değişkenliğe rağmen, çift yönlü iki yönlü ANOVA veya öğrencinin P değerleri 0.05'ten büyük olan T-testi kullanılarak her iki türün biyolojik replikasyonları için istatistiksel olarak anlamlı bir fark kaydedilmemiştir. Bu bulgu, derin kuyu cihazlarının biyofilm oluşumunun, standart cihazlara benzer şekilde tekrarlanabilir biyofilmler oluşturduğunu göstermektedir.
Standart ve derin kuyu cihazları arasındaki hacim ve mandal yüzey alanı için biyofilm biyokütlesini standartlaştırdıktan sonra elde ettiğimiz sonuçlar, test edilen iki bakteri türü arasında hafif ama önemli bir malzeme tercihine işaret etmiştir. Polipropilen derin kuyu cihazında, Pseudomonas aeruginosa biyokütle oluşumunda 1.4 kat göreceli bir artış gösterdi ve Escherichia coli, polistiren standart cihaz üzerinde gözlenen ters etki ile biyokütle oluşumunda 1.52 kat göreceli bir azalma gösterdi. Biyofilm cihazı mandal materyali için bakteri türü tercihindeki bu fark, sonuçların biyofilm cihazları arasında çapraz karşılaştırılamayacağını göstermektedir.
24 saatlik biyofilmlerin antimikrobiyal zorluğu, bakteriyel biyofilm oluşumunun etkili bir inhibitörü olduğu bilinen, ancak biyofilm eradikasyonu için daha az etkili bir antimikrobiyal olan kuaterner amonyum bileşiği benzalkonyum klorür kullanılarak test edilmiştir. Sonuçlarımız, derin kuyu biyofilm cihazından elde edilen BZK BMEC değerlerinin, standart biyofilm cihazındaki büyümeye kıyasla Escherichia coli için ortalama altı kat ve Pseudomonas aeruginosa için sekiz kat arttığını göstermiştir. BZK MBEC sonuçları, biyofilm eradikasyonu için daha az etkili bir antimikrobiyal olduğu için beklendiği gibi daha değişkendi ve daha yüksek konsantrasyonlarda hayatta kalan birkaç aykırı biyofilm mandalı nedeniyle her iki cihazda da Escherichia coli MBEC değerleri için bir aralıkla sonuçlandı.
Ayrıca, bakteriyel biyofilm eradikasyonu için çok etkili bir antimikrobiyal olduğu bilinen dezenfektan ağartıcıyı da karşılaştırdık. Ağartıcı, standart cihazda test edildiğinde, her iki tür için de derin kuyu cihazına kıyasla biraz daha yüksek bir MBEC değeri gösterdi ve sırasıyla Escherichia coli'de dört kat artışa ve Pseudomonas aeruginosa'da iki kat artışa yol açtı. Bununla birlikte, bu farklılıklar cihazlar arasında tekrarlanabilir hata aralığındaydı ve BZK'dan çok daha az değişkenlik gösterdi ve ağartıcının biyofilm eradikasyonu için daha etkili bir antimikrobiyal olduğunu doğruladı.
Her bir biyofilm cihazının önemli bir sınırlaması, mandalların farklı plastik bileşimi ve farklı bakteri türlerinin bu yüzeylere yapışması ve biyokütle oluşumunda ortaya çıkan değişkenlik olacaktır. Ek olarak, açıklanan protokol uygulanmadan önce farklı antimikrobiyaller ve plastik mandal malzemesi arasındaki kimyasal etkileşimler ve uyumluluklar dikkate alınmalıdır. Sonuç olarak, bu protokol ve derin kuyu ve standart biyofilm cihazları üzerindeki biyokütle karşılaştırmalarımızdan elde edilen bulgular, her ikisinin de sağlam Escherichia coli ve Pseudomonas aeruginosa biyofilmlerini yetiştirebildiğini, derin kuyu cihazı ile mandal yüzey alanı başına standart cihazdan önemli ölçüde daha fazla biyokütle sağladığını göstermektedir.
Derin kuyu biyofilm cihazı, aşağı akış analizi için daha fazla miktarda biyofilm gerektiren statik, yüksek verimli biyofilm ekimi ve eleme çalışmaları için uygulanabilir, uygun fiyatlı bir alternatif sunar. Her cihaz arasındaki plastik malzeme bileşimlerindeki farklılıklar nedeniyle, CV boyalı biyofilm biyokütlesi ve MBEC değerleri cihazlar arasında doğrudan karşılaştırılamaz. Bununla birlikte, deneyler aynı cihazda tutarlı bir şekilde yürütülürse, izolatlar ve antimikrobiyaller arasında elde edilen sonuçlar karşılaştırılabilir.
Derin kuyu biyofilm cihazı, biyofilmleri düşük maliyetli malzemeler kullanarak yüksek verimli analizlerde incelemek isteyen laboratuvarlar için önerilir.
Overview
This protocol describes a methodology for biofilm growth and biomass measurement using a self-assembled deep well PCR-plate device. This device enables high-throughput static biofilm screening in a 96-well format.
Key Study Components
Area of Science
- Microbiology
- Biofilm research
- Antimicrobial susceptibility testing
Background
- Standard peg lid biofilm devices have limitations in volume capacity.
- Deep well biofilm devices allow for greater biofilm growth and analysis.
- Crystal violet staining is a common method for quantifying biofilm biomass.
- Comparative analysis of different biofilm devices can enhance understanding of bacterial growth.
Purpose of Study
- To compare standard peg lid and deep well biofilm devices.
- To evaluate biofilm biomass using crystal violet staining.
- To assess antimicrobial susceptibility through minimum biofilm eradication concentration (MBEC) testing.
Methods Used
- Inoculation of bacterial strains onto nutrient agar plates.
- Preparation of deep well biofilm plates with varying media volumes.
- Crystal violet staining and optical density measurement for biomass quantification.
- Antimicrobial challenge testing with subsequent recovery and analysis.
Main Results
- Pseudomonas aeruginosa showed 4.1-fold more biomass on the deep well device.
- Escherichia coli demonstrated 2.1-fold more biomass on the deep well device.
- Statistical analysis indicated no significant differences in biological replicates.
- Material preference for biofilm formation varied between bacterial species.
Conclusions
- The deep well biofilm device supports greater biomass accumulation.
- Both devices produced reproducible biofilms.
- Differences in biomass formation highlight the importance of device selection.
Frequently Asked Questions
Chapters in this video
0:15
Introduction
1:41
Days 0-2: Aseptic Culture Preparation for Biofilm Group
2:05
Day 2: Preparation and Inoculation of Deep Well Biofilm Plates
3:08
Day 3, Part 1: Biofilm Biomass Determination from Device Using CV Staining
4:10
Day 3, Part 2: Challenging Biofilms with Antimicrobial to Calculate Their 24 Hour Antimicrobial MBEC Value
4:54
Day 4: Recovery of Biofilm Biomass from Pegged Lids and Day 5: Determination of Device MBEC Values
5:44
Representative Results
9:07
Conclusion
