Poliglutamin aracılı nörotoksisiteye karşı biyoaktif bileşiklerin keşfedilmesi için bir model sistem olarak Caenorhabditis elegans

Burada, Caenorhabditis elegans'taki test bileşiklerinin poliglutamin agregasyonu, nöronal ölüm ve kemoavoidans davranışı dahil olmak üzere nöroprotektif aktivitelerini ve çoklu fenotiplerin örnek bir entegrasyonunu değerlendirmek için bir protokol sunuyoruz.

Nörodejeneratif ve davranışsal çalışmalarda güçlü bir hayvan modeli olarak C.elegans, Huntington'un hastalık benzeri modellerini kullanarak poliglutamin nörotoksisitesine karşı toksik bileşikleri etkili bir şekilde taramak ve değerlendirmek için kullanılabilir. Bu tekniğin temel avantajı, farklı C.elegans modellerinde çoklu fenotiplerin profillenmesi ve entegrasyonudur. Ayrıca aslında C.elegans gibi modeller de bu yöntemde kullanılmaktadır.

Diğer nörodejeneratif gecikmeler ve aslında diğer gecikmeler için terapötik adayların taranması ve araştırılması için boyut sağlar. Lütfen C.elegans büyümesinde kullanılan sıcaklıklara dikkat edin ve testi namal gelişimin doğru aşamalarında gerçekleştirin. Prosedürü gösterecek olan Jiang Yiyi, Xioa Yue ve Wang Qiangqiang, üç yüksek lisans öğrencisi olacak.

300 ila 500 senkronize L1 AM141 nematodunun larvalarını, E.coli'nin OP50 suşu ve mililitre astragalan başına beş miligram içeren 500 mikrolitre S ortamı içeren 48 kuyucuklu bir plakanın her bir kuyucuğuna aktararak başlayın. Plakayı parafilm ile kapatın ve istenen zaman aralıkları için dakikada 20 santigrat derece ve 120 rotasyonda inkübe edin. Nematodları steril bir 1,5 mililitrelik mikrosantrifüj tüpüne aktarın ve kalan OP50 hücrelerini çıkarmak için santrifüjleme ile M9 tamponuyla üç kez yıkayın.

Ardından, AM141 nematodlarını M9 tamponunda yeniden askıya alın. Şimdi, 384 kuyu plakasındaki her bir kuyucuğa 10 ila 15 nematod aktarın, her işlem için 10 replika kuyusu ayarlayın ve nematodları dibe çökerterek felç etmek için her bir kuyucuğa 10 mikrolitre 200 milimolar sodyum azid ekleyin. Floresan görüntüler elde etmek için plakayı yüksek içerikli bir görüntüleme sistemine yerleştirin.

Görüntü alma yazılımını açın ve metin makalesinde belirtilen parametreleri ayarlayın. İnceleme plakası veri penceresini açıp görüntü analizi için test plakasını seçerek görüntü verilerini analiz edin. Görüntüsünü görüntülemek için bir test kuyusuna çift tıklayın.

Ardından analiz yöntemi olarak sayım çekirdeklerini seçin ve ayarları yapılandır düğmesine tıklayın. Kaynak görüntüyü FITC kanalından tanımlayın ve standart algoritmayı seçin. Görüntü analizi parametrelerini metin makalesinde açıklandığı gibi ayarlayın ve analiz yöntemini optimize etmek için bunları test edin.

Ayarları kaydedin ve analizi tüm kuyucuklarda çalıştırın. Toplam çekirdeği, her bir kuyucuktaki toplam Q40:YFP agregası sayısı olarak dışa aktarın. Her kuyucuktaki nematod sayısını sayın ve her gruptaki nematod başına ortalama Q40: YFP agregası sayısını hesaplayın.

Ardından, inhibisyon indeksini hesaplayın. PoliQ nörotoksisite testi için nematodlar hazırlamak için, 300 ila 500 senkronize L1 larvası HA759 nematodlarını, E.coli'nin OP50 suşu ve mililitre astragalan başına beş miligram içeren 500 mikrolitre S ortamı içeren 48 kuyucuklu bir plakanın her bir kuyucuğuna aktarın. Plakaları kapattıktan sonra, daha önce gösterildiği gibi nematodları M9 tamponunda inkübe edin, hasat edin ve yeniden askıya alın.

Şimdi, 100 mililitre M9 tamponuna iki gram agaroz ekleyerek agaroz pedinde hazırlayın ve çözeltiyi bir mikrodalgada kaynamaya yakın bir şekilde ısıtın. İki milimetre kalınlığında cam plakaların iki parçası arasına yerleştirilmiş bir milimetre kalınlığındaki mikroskopi cam slaytın ortasına, dikey olarak başka bir slaytla kaplanmış 0,5 mililitre eritilmiş agaroz dağıtın. Agaroz soğuduktan ve katılaştıktan sonra üst sürgüyü yavaşça çıkarın.

ASH nöronal sağkalım tahliline, agros pedine bir damla 20 milimolar sodyum azid ekleyerek ve daha sonra onları hareketsiz hale getirmek için damlaya 15 ila 20 HA759 nematod aktararak başlayın. Nematodların üzerine yavaşça bir kapak kayması yerleştirin. Şimdi, slaytı bir dijital kamera ile donatılmış bir floresan mikroskobun altında tutun.

Nematodların baş bölgesindeki GFP pozitif ASH nöronlarını tespit etmek için 40x objektif lens ve FITC filtresi seçin. Baş bölgelerinde GFP etiketli bilateral ASH nöronları olan nematodların sayısını saymak için her grupta rastgele 50'den fazla nematod seçin ve ardından ASH nöronlarının hayatta kalma oranını hesaplayın. Ozmotik kaçınma testi için, gıdasız bir NGM plakasını ortada sekiz molar gliserol hattı oluşturarak normal ve tuzak bölgelerine bölün.

Daha sonra, gliserol bariyerinden tuzak bölgesine geçen nematodları felç etmek için gliserol hattından yaklaşık bir santimetre uzakta 200 milimolar sodyum azid hattı yayın. Her biri yaklaşık 200 nematod, her grup için üç replika plakasının normal bölgesine aktarın. Daha sonra, nematodları çekmek için tuzak bölgesine% 1'lik bir bütandion damlası ekleyin.

Petri kabının kapağını hemen örtün ve 90 dakika boyunca 23 santigrat derecede kuluçkaya yatırın. Her iki bölgedeki nematod sayısını mikroskop altında puanlayın ve kaçınma indeksini hesaplayın. Transgenik poliQ suşu AM141, vücut duvarı kas hücrelerinde Q40: YFP füzyon proteinlerini güçlü bir şekilde ifade eder, bu otomatik görüntüleme ve analiz protokolü ile tanımlanır ve artan miktarı koruyucu potansiyelini gösteren astragalan tedavisi ile inhibe edilir.

Nematodların baş bölgelerinde GFP floresan ve bilateral ASH nöronlarının kaybı, ASH nöronal ölümünü gösterir. Bu ASH nöronal sağkalım testi, test bileşiklerinin Caenorhabditis zarafet nöronları üzerindeki nöroprotektif etkisini görsel olarak değerlendirmek için kullanılabilir. Kemosensoriyel kaçınma testi, poliQ agregasyonunun aracılık ettiği ASH nöronlarının fonksiyonel kaybı üzerindeki etkili test örneklerini incelemek için kullanıldı.

Astragalan ile üç gün boyunca 15 santigrat derecede tedavi edilen HA759 nematodlarının kaçınma indeksi 0.6'nın üzerine çıktı ve polisakkaritin davranışsal bozukluklara karşı nöroprotektif bir etkisini gösterdi. Test bileşiklerinin genel nöroprotektif kapasitesini değerlendirmek için, bireysel tahlillerden elde edilen veriler entegre edildi ve astragalan tedavi grubundaki üçgenin alanını, kontrol grubununkinden daha büyük gösteren ve polisakkaritin anti-poliQ etkilerini gösteren bir radar çizelgesi olarak sunuldu. Lütfen yiyecek, sıcaklık ve nemin C.elegans'ın davranışlarını etkileyebileceğini unutmayın.