Name: İn Vivo Yetenekli Motor Davranışın Kablosuz Optogenetik Kontrolü (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-11-22T14:30:00.000+00:00
Duration: 7 min 52 s
Description: Öğrenin kablosuz optogenetik ve yüksek hızlı video görüntüleme ile farelerde yetenekli motor davranışın sinir devrelerini nasıl analiz edeceğinizi. Bu yöntem, ince motor kontrolünün beyin mekanizmalarını anlamak için kullanılır.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Bu çalışma UNAM-PAPIIT projesi IA203520 tarafından desteklenmiştir. IFC hayvan tesisine, fare kolonilerinin bakımı konusundaki yardımları ve BT desteği için hesaplama birimine, özellikle Francisco Perez-Eugenio'ya teşekkür ederiz.

Hayvan kullanımını içeren prosedürler yerel ve ulusal kılavuzlara uygun olarak yürütülmüş ve ilgili Kurumsal Hayvan Bakımı ve Kullanımı Komitesi (Hücresel Fizyoloji Enstitüsü IACUC protokolü VLH151-19) tarafından onaylanmıştır. Mevcut protokolde 27, 35-40 gün postnatalC57BL/6 arka planlı Drd1-Cre transgenik erkek fareler kullanıldı. Fareler aşağıdaki koşullar altında tutuldu: sıcaklık 22±1 ° C; nem% 55; ışık programı 12/12 saat ışıklar akşam 7'de söndü ve doğum sonrası 21. günde sütten kesildi. Sütten kesilen yavrular 2-5 kişilik aynı cinsiyetten gruplara yerleştirildi. Hayvanlar, mikro bariyer üstleri olan statik konutlara yerleştirildi. Yataklar steril kavak talaşı oluşuyordu. Kemirgen peletleri ve RO-arıtılmış su, belirtilen durumlar dışında, ad libitum sağlandı.
1. Cerrahi işlemler
<ol><li>İlgilenilen yapının dorsoventral koordinatlarına göre istenen uzunlukta bir LED kanül hazırlayın (ideal olarak kafatasının kalınlığını hesaba katmak için 0,5 mm daha uzun, dorsolateral striatum 3,5 mm için) (Şekil 1).<ol>
<li>Cam elyafını istenen son boyuttan daha uzun bir uzunluğa kadar kesin, elyaf ucunu kaba zımpara kağıdı ile hedef uzunluğa kadar öğütün ve son olarak fiber ucu ince zımpara kağıdı ile cilalayın. NOT: LED kanül, kızılötesi alıcıya bağlı 250 μm çapında bir cam optik fiberdir (bkz.</li>
	</ol></li>
	<li>Nano enjektör için cam pipetleri (1,14 mm dış çap, 0,53 mm iç çap ve 3,5 uzunlukta) yatay bir çektirme ile çekin (bkz. Malzeme Tablosu) ve daha sonra saklamak için saklayın. Uzun kademeli eğimli konik (4-5 mm) ile 15-20 μm uç çapı elde etmek için çektirmeyi tek bir döngüde programlayın.</li>
	<li>Stereotaksik aparat, kaput, mikro enjektör ( bakınız Malzeme Tablosu) ve çevresindeki yüzeyleri% 70 etanol ile iyice dezenfekte ederek ameliyat alanını hazırlayın. NOT: Adeno İlişkili Virüsü (AAV'ler) hassas bir şekilde enjekte etmek ve LED kanülünü ilgilenilen bölgeye yerleştirmek için bir fare stereotaksik aparatı gereklidir.</li>
	<li>Temiz bir laboratuvar önlüğü veya tek kullanımlık cerrahi elbise, steril eldivenler, yüz maskesi ve tek kullanımlık kafa başlığı dahil olmak üzere prosedür için uygun kişisel koruyucu ekipmanı giyin.</li>
	<li>Steril cerrahi aletler, pamuklu uçlar, çözeltiler, mikropipet, pipet uçları, kılcal damarlar, mineral yağ ile mikro dolgu ve işaretleyici gibi gerekli ekipmanları ameliyat alanına yakın bir yere yerleştirin.</li>
	<li>Mikroenjeksiyonlar için bir pipeti mineral yağ ile doldurun ve mikro enjektöre yerleştirin. Bazı mineral yağları çıkararak mikro enjektörün doğru çalıştığından emin olun. NOT: Ameliyat sırasında kullanılan tüm aletler otoklavlanmış ve steril olmalıdır. Aseptik teknik kullanılmalıdır.</li>
	<li>Anesteziyi indüklemek için gaz halindeki izofluran ile hayvanları% 4-5 ve ameliyat boyunca% 1.2'sini 0.5-1 L / dak saf oksijen ile anestezi altına alın. Ameliyat ancak hayvan hafif bir tutam sonra pençe çekilmesinin olmaması ile değerlendirilen derin anestezi noktasına ulaştıktan sonra başlar.<ol>
<li>Hayvanın solunum hızını ve sıcaklığını sürekli izleyin. Vücut ısısını 34 ° C'ye ayarlanmış bir ısıtma yastığı ile koruyun.</li>
	</ol></li>
	<li>Bir oftalmik merhem uygulayın. Bir düzeltici ve epilasyon kremi ile saç derisinden saçları çıkarın. Kafa derisini% 8 povidon-iyot ( Malzeme Tablosuna bakınız) ve% 70 etanol içeren pamuklu çubuklarla silin.</li>
	<li>Fareyi stereotaksik aparata yerleştirin ve kafatasının mediolateral ve anterior-posterior eksenlerde düzleştirilmesini sağlayarak kafayı sabitleyin.</li>
	<li>Sagital eksen boyunca göz hizasında kafa derisinden bir neşter ile 1 cm'lik bir kesi yapın. Kafatasını açığa çıkarmak için cildi geri çekin ve periostu pamuklu çubuklarla temizleyin.</li>
	<li>Kafatası yüzeyini tuzlu su çözeltisi ve steril pamuklu çubuklarla temizleyin. Yüzeydeki kanamaları steril emici göz mızrakları (bakınız Malzeme Tablosu) veya benzeri steril emici malzemeler kullanarak çözün.</li>
	<li>Bir pamuklu çubukla % 2.5'lik bir hidrojen peroksit damlası uygulayın ve kafatası dikişlerini görünür kılmak ve daha iyi bir referansa sahip olmak için birkaç saniye boyunca hareket etmesine izin verin. Birkaç saniye sonra, temiz bir pamuklu çubukla iyice temizleyin.</li>
	<li>Cam pipetle (15 μm son uç çapı) kafatasının ön-arka eksende düzleştirilip düzleştirilmediğini kontrol etmek için bregma ve lambda'yı bulun. NOT: Cam pipetin ucunu görmek için stereoskopik mikroskop veya USB mikroskop kullanılması önerilir. İhtiyaç duyulması durumunda, kafatasını düzleştirmek için ağız tutucunun yüksekliğini ayarlayın.</li>
	<li>Kılcal damarı seçilen ön-posterior (AP) ve medial-lateral (ML) koordinatlara doğru hareket ettirin (dorsolateral striatum AP 1.2 mm, ML 2.28 mm). Seçilen koordinatların üzerindeki kafa derisindeki bir referans noktasını steril bir işaretleyici ile boyayın.</li>
	<li>Referans noktasında, steril bir döner aletle kafatasına hafif basınç uygulayan ~1 mm çapında bir kraniyotomi veya küçük yuvarlak bir diş matkabı ucu ile düşük ila orta hızda diş matkabı uygulayın (bkz.</li>
	<li>Kılcal damarı, Channelrhodopsin eksprese etmek için AAV1-dflox-hChR-2-mCherry gibi 300-400 nL Cre-bağımlı adeno-ilişkili virüs (AAV) veya ilgilenilen bölgede kontrol olarak yalnızca muhabir proteinini (örneğin, mCherry) eksprese etmek için bir AAV ile yükleyin (bkz. Ucun tıkanmadığını kontrol edin, ardından cam pipeti beyne istenen dorso-ventral (DV) koordinatlarda (dorsolateral striatum DV -3.35 mm) yerleştirin.<ol>
<li>Otomatik bir enjektör kullanarak 23 nL/s hızında 200 nL enjekte edin. Enjeksiyonu bitirdikten sonra 10 dakika bekleyin, dökülmeyi önlemek için cam pipeti yavaşça çekin. NOT: Uygun mikro enjektör ile enjekte etmek için 30 G'lık bir iğne kullanmak mümkündür.</li>
	</ol></li>
	<li>Kalıntıları pamuklu çubuklarla temizleyin ve kurutun.</li>
	<li>Steril cam LED kanülünü stereotaksik kola takın ve referans olarak bregma kullanarak koordinatları kalibre edin. Doku hasarını önlemek için kanülü çok yavaş (300 μm / dak) yerleştirin ve enjeksiyon bölgesinin 100 μm yukarısına yerleştirin.</li>
	<li>LED kanül yerleştirildikten sonra, kraniyotominin kenarına bir damla (100 μL) doku yapıştırıcısı ekleyin.</li>
	<li>Elyafı kafatasına sabitlemek için üreticinin talimatlarını izleyerek diş çimento karışımı hazırlayın ( Malzeme Tablosuna bakınız). NOT: Kısaca, çimento setlerinden önce daha fazla çalışma süresine sahip olmak için soğutulmuş bir porselen kalıp kullanın. Porselen kalıba 2 kepçe reçine berrak tozu ekleyin, 4 damla hızlı baz ve 1 damla katalizör ekleyin, sonra iyice karıştırın. Toz/sıvı oranı, daha ince veya daha kalın bir viskoziteye ihtiyaç duyulduğunda ayarlanabilir.</li>
	<li>Steril bir fırça kullanarak, diş çimento karışımını kanül konektörünün etrafına azar azar uygulayın, kafatası kaplanana ve konektör kafatasına güvenli bir şekilde tutturulana kadar katmanlar oluşturarak pimleri tamamen serbest bırakın. Farenin derisine diş çimentosu almaktan kaçının.</li>
	<li>Tamamen kurumaya bırakın.</li>
	<li>İmplant çevresindeki cildi doku yapıştırıcısı kullanarak kapatın (bkz.</li>
	<li>Fareyi 33 ° C'de bir ısıtma yastığı üzerinde bir kurtarma kafesine yerleştirin Aşağıdaki ağrı / rahatsızlık belirtilerinden bir veya daha fazlasının varlığını izleyin: 1) Kambur, motor aktivitesinin eksikliği veya azalması, 2) Bakımsız kirli bir paltoya yansıyan tımar edilmemesi, 3) Aşırı yalama veya çizilme, kesi yerinde kızarıklık, 4) agresif davranış, 5) anoreksiya veya dehidrasyon ve 6) Yuva oluşumu eksikliği. NOT: İmplantın ayrılmasını önlemek için fareyi tüm işlemler sırasında ayrı ayrı kafeste tutun. Kanülün ayrılması durumunda, 150 mg / kg sodyum pentobarbital enjekte ederek ötenazi uygulayın ve ardından derin anesteziye ulaşıldıktan sonra dekapitasyon yapın.</li>
	<li>Analjezi sağlamak için ameliyat sonrası üç gün boyunca günde bir kez deri altından (SC) meloksikam 1 mg / kg enjekte edin.</li>
	<li>Diğer işlemlerden önce tam iyileşme için en az 7 gün ve opsin ekspresyonu için 14 gün bekleyin. NOT: Üç gün boyunca her 12 saatte bir ameliyat sonrası takip yapın, ardından deneyin sonunda ötenazi gününe kadar her gün hayvanları kontrol edin.</li>
</ol>
2. Kavrama eğitimi
<ol><li>Ameliyat sonrası 7. günde, gıda yoksunluğu protokolü28'e başlayın. Ortalama ad libitum vücut ağırlıklarını belirlemek için fareleri art arda üç gün boyunca tartın. Daha sonra, hayvanların vücut ağırlığının yaklaşık% 90'ını ve en az% 85'ini korumak için yeterli besin alması için gıda kısıtlamaları planlayın. NOT: Bu, günlük 2,5-3 g yiyecek sağlayarak elde edilir. Hayvanların ağırlığını günlük olarak izleyin ve hayvanların davranışlarını ve görünümlerini, örneğin ceket ve göz görünümünü gözlemleyerek genel refah için puan alın. Referans29'daki vücut durumu puanlama sistemini kullanın.</li>
	<li>Ön eğitim, eğitim ve test dönemlerinde, her fareye standart gıda peletlerinin yanı sıra günde 20 pelet (20 mg tozsuz çikolata aromalı pelet ) (bkz.</li>
	<li>Alışkanlıktan üç gün önce, ev kafeslerine 0.4 g / hayvan / gün 20 mg tozsuz çikolata aromalı pelet saçarlar, böylece fareler kavrama görevi sırasında ödül görevi gören peletlerle tanışırlar.</li>
	<li>Fareleri, ön eğitimden bir gün önce test odasına 10 dakika yerleştirerek, oda tabanına dağılmış peletlerle alışkanlık haline getirin (Şekil 1A).</li>
	<li>Eğitim ve testten sonra günlük yiyeceklere izin verin. Her gün benzer bir program tutun.</li>
	<li>Ön eğitimin ilk gününde, fareleri kavrayışa kadar uzanma odasına yerleştirin ve önden gözlemleyin. Peletleri, odanın önüne, açıklığa yakın bir yere yerleştirin, böylece peletleri tüketmeye başlarlar. Bu aşamada, farelerin peletleri herhangi bir biçimde yakalamalarına izin verilir.</li>
	<li>Ön eğitimin ikinci gününde, peletleri girintiye (açıklıktan 1 cm) alana kadar açıklıktan daha uzağa ve daha uzağa yerleştirin, böylece fareler kavrama hareketlerini şekillendirebilirler (Şekil 1C).</li>
	<li>Fareleri kafesin arkasına koşmaları için eğitin ve denemeleri bireyselleştirmek için bir strateji olarak bir sonraki yiyecek peletini almak için kafes açıklığına geri dönün. NOT: Bu, her deneme için girintiye bir pelet yerleştirmeden önce farenin kafesin arkasına gelmesini bekleyerek elde edilebilir.</li>
	<li>Sağ veya sol pençeleri tarafından kavranacak peletleri yerleştirin. NOT: Fareler, aşağıdaki eğitim ve test günlerinde kullanılacak olan kavramak için tercihen bir pençe kullanmaya başlar.</li>
	<li>Hayvanları 6 gün boyunca 20 deneme süren günlük seanslarda veya en fazla 10 dakika geçene kadar eğitin. Eğitimin 2. gününden itibaren, sahte alıcıyı (boyutlar 12 x 18 x 7 mm, 1 g, bakınız Malzeme Tablosu) koyun, böylece fareler görevi yerine getirirken ağırlığa alışırlar (Şekil 1B). Her gün isabet ve kaçırılan denemelerin sayısını puanlayın.</li>
	<li>Normal bir kamera ile davranışı kaydedin ve odanın önünden 30-60 kare / s yakalayın. Ek olarak, hayvanların duruşunu izlemek için eğitim odasının altına 45° açıyla bir ayna yerleştirilebilir (Şekil 1D,E).</li>
	<li>Post-hoc kinematik analiz için (Şekil 2), kafesin yanından kayıt yapmak üzere 45°'lik bir açıyla yüksek hızlı bir kamera (bkz. Malzeme Tablosu) monte edin. 3D analiz gerekiyorsa, odanın önünden 35° açıyla kayıt yapmak için ikinci bir yüksek hızlı kamera yerleştirin; her iki kamera da hayvanların yanlılığına bağlı olarak kafesin sağ veya sol tarafına yerleştirilmeli ve aynı kare hızında çekim yapmalı ve senkronize edilmeli7 (Şekil 3D,E).</li>
	<li>Yüksek hızlı kameraları, mümkünse 376 x 252 piksel veya daha fazla çözünürlüğe sahip 100 kare / sn'ye ayarlayın. Arka planı azaltmak ve kontrastı artırmak için odanın yanlarına ve arkasına beyaz strafor duvarlar yerleştirin (Şekil 1E).</li>
	<li>Test gününde, kablosuz optogenetik stimülasyon için sahte üniteyi bir kızılötesi alıcı ile değiştirin (Şekil 1B, C).</li>
	<li>Fareler ulaşmaya başladığında, davranışın gerçekleştirildiği süre boyunca ve 2 saniyeden uzun süre sürekli bir uyarım olması için LED kanülü uzaktan kumandayla manuel olarak çevirin. Otomatik bir stimülasyon paradigmasının programlanması tercih edilir. Stimülasyon cihazı, 1,0 mW/mm2 ucunda yoğunlukta 470 nm'lik (mavi ışık) bir LED'i tetikler.</li>
	<li>Puanlama ve kinematik analiz dahil olmak üzere daha fazla inceleme için videoları toplayın.</li>
</ol>3. Post-hoc histolojik doğrulama
<ol><li>Bir deneyin tamamlanmasının ardından, viral ekspresyonu ve LED kanül yerleşimini onaylayın. Hayvanı 100 mg / kg ketamin ve 10 mg / kg ksilazin kokteyli ile uyuşturun. Fare derin anestezi belirtileri gösterdiğinde (adım 1.7), buz gibi soğuk fosfat tamponlu salin (PBS) ve ardından% 4 PFA ile perfüze edin.</li>
	<li>İmplante edilmiş kanülü, konektörü forseps ile sıkıca kavrayarak ve yavaşça yukarı çekerek dikkatlice çıkarın.</li>
	<li>Beyni% 4 PFA23'te 24 saat boyunca çıkarın ve sabitleyin.</li>
	<li>PBS ile 3-10 dakikalık yıkamalar yapın.</li>
	<li>Beyni bir mikrotom kullanarak 50 μm bölümler halinde kesin (bkz.</li>
	<li>Çekirdekleri boyamak ve slaytları örtmek için DAPI içeren sert ayarlı montaj ortamına sahip bölümleri slaytlara monte edin.</li>
	<li>Kuruduktan sonra, konfokal mikroskop altındaki bölümleri gözlemleyin ve herhangi bir floresan proteini ile kaynaşmış Ch2R'nin implante edilmiş kanül yerini ve ekspresyonunu doğrulayın.</li>
</ol>

<ol><li>Balbinot, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Post-stroke+kinematic+analysis+in+rats+reveals+similar+reaching+abnormalities+as+humans%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Report%22%5BJournal%5D)">Post-stroke kinematic analysis in rats reveals similar reaching abnormalities as humans.</a> Scientific Report. 8 (1), 8738(2018).</li>
<li>Klein, A., Sacrey, L. A., Whishaw, I. Q., Dunnett, S. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+use+of+rodent+skilled+reaching+as+a+translational+model+for+investigating+brain+damage+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience+%26+Biobehavioral+Reviews%22%5BJournal%5D)">The use of rodent skilled reaching as a translational model for investigating brain damage and disease.</a> Neuroscience & Biobehavioral Reviews. 36 (3), 1030-1042 (2012).</li>
<li>MacLellan, C. L., Gyawali, S., Colbourne, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Skilled+reaching+impairments+follow+intrastriatal+hemorrhagic+stroke+in+rats%5BTitle%5D)+AND+%22Behavioural+Brain+Research%22%5BJournal%5D)">Skilled reaching impairments follow intrastriatal hemorrhagic stroke in rats.</a> Behavioural Brain Research. 175 (1), 82-89 (2006).</li>
<li>Evenden, J. L., Robbins, T. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+unilateral+6-hydroxydopamine+lesions+of+the+caudate-putamen+on+skilled+forepaw+use+in+the+rat%5BTitle%5D)+AND+%22Behavioural+Brain+Research%22%5BJournal%5D)">Effects of unilateral 6-hydroxydopamine lesions of the caudate-putamen on skilled forepaw use in the rat.</a> Behavioural Brain Research. 14 (1), 61-68 (1984).</li>
<li>Rodgers, R. A., Travers, B. G., Mason, A. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bimanual+reach+to+grasp+movements+in+youth+with+and+without+autism+spectrum+disorder%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Psychology%22%5BJournal%5D)">Bimanual reach to grasp movements in youth with and without autism spectrum disorder.</a> Frontiers in Psychology. 9, 2720(2019).</li>
<li>Sacrey, L. A. -O., Zwaigenbaum, L., Bryson, S., Brian, J., Smith, I. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+reach-to-grasp+movement+in+infants+later+diagnosed+with+autism+spectrum+disorder%3A+a+high-risk+sibling+cohort+study%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neurodevelopmental+Disorders%22%5BJournal%5D)">The reach-to-grasp movement in infants later diagnosed with autism spectrum disorder: a high-risk sibling cohort study.</a> Journal of Neurodevelopmental Disorders. 10 (1), 41(2018).</li>
<li>Azim, E., Jiang, J., Alstermark, B., Jessell, T. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Skilled+reaching+relies+on+a+V2a+propriospinal+internal+copy+circuit%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Skilled reaching relies on a V2a propriospinal internal copy circuit.</a> Nature. 508 (7496), 357-363 (2014).</li>
<li>Marques, J. M., Olsson, I. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Performance+of+juvenile+mice+in+a+reach-to-grasp+task%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience+Methods%22%5BJournal%5D)">Performance of juvenile mice in a reach-to-grasp task.</a> Journal of Neuroscience Methods. 193 (1), 82-85 (2010).</li>
<li>Miklyaeva, E. I., Castaneda, E., Whishaw, I. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Skilled+reaching+deficits+in+unilateral+dopamine-depleted+rats%3A+Impairments+in+movement+and+posture+and+compensatory+adjustments%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Skilled reaching deficits in unilateral dopamine-depleted rats: Impairments in movement and posture and compensatory adjustments.</a> The Journal of Neuroscience. 14 (11), Pt 2 7148-7158 (1994).</li>
<li>Vaidya, M., Kording, K., Saleh, M., Takahashi, K., Hatsopoulos, N. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neural+coordination+during+reach-to-grasp%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neurophysiology%22%5BJournal%5D)">Neural coordination during reach-to-grasp.</a> Journal of Neurophysiology. 114 (3), 1827-1836 (2015).</li>
<li>Wang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Deconstruction+of+corticospinal+circuits+for+goal-directed+motor+skills%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Deconstruction of corticospinal circuits for goal-directed motor skills.</a> Cell. 171 (2), 440-455 (2017).</li>
<li>Xu, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+formation+and+selective+stabilization+of+synapses+for+enduring+motor+memories%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Rapid formation and selective stabilization of synapses for enduring motor memories.</a> Nature. 462 (7275), 915-919 (2009).</li>
<li>Ian, Q. W., Sergio, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+structure+of+skilled+forelimb+reaching+in+the+rat%3A+A+proximally+driven+movement+with+a+single+distal+rotatory+component%5BTitle%5D)+AND+%22Behavioural+Brain+Research%22%5BJournal%5D)">The structure of skilled forelimb reaching in the rat: A proximally driven movement with a single distal rotatory component.</a> Behavioural Brain Research. 41 (1), 49-59 (1990).</li>
<li>Proske, U., Gandevia, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+proprioceptive+senses%3A+their+roles+in+signaling+body+shape%2C+body+position+and+movement%2C+and+muscle+force%5BTitle%5D)+AND+%22Physiological+Reviews%22%5BJournal%5D)">The proprioceptive senses: their roles in signaling body shape, body position and movement, and muscle force.</a> Physiological Reviews. 92 (4), 1651-1697 (2012).</li>
<li>Yttri, E. A., Dudman, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Opponent+and+bidirectional+control+of+movement+velocity+in+the+basal+ganglia%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Opponent and bidirectional control of movement velocity in the basal ganglia.</a> Nature. 533 (7603), 402-406 (2016).</li>
<li>Donchin, O., Gribova, A., Steinberg, O., Bergman, H., Vaadia, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Primary+motor+cortex+is+involved+in+bimanual+coordination%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Primary motor cortex is involved in bimanual coordination.</a> Nature. 395 (6699), 274-278 (1998).</li>
<li>Brus-Ramer, M., Carmel, J. B., Martin, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Motor+cortex+bilateral+motor+representation+depends+on+subcortical+and+interhemispheric+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Motor cortex bilateral motor representation depends on subcortical and interhemispheric interactions.</a> The Journal of Neuroscience. 29 (19), 6196-6206 (2009).</li>
<li>d'Avella, A., Saltiel, P., Bizzi, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Combinations+of+muscle+synergies+in+the+construction+of+a+natural+motor+behavior%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Combinations of muscle synergies in the construction of a natural motor behavior.</a> Nature Neuroscience. 6 (3), 300-308 (2003).</li>
<li>Fattori, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hand+orientation+during+reach-to-grasp+movements+modulates+neuronal+activity+in+the+medial+posterior+parietal+area+V6A%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Hand orientation during reach-to-grasp movements modulates neuronal activity in the medial posterior parietal area V6A.</a> The Journal of Neuroscience. 29 (6), 1928-1936 (2009).</li>
<li>vanden Berg, F. E., Swinnen, S. P., Wenderoth, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Excitability+of+the+motor+cortex+ipsilateral+to+the+moving+body+side+depends+on+spatio-temporal+task+complexity+and+hemispheric+specialization%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Excitability of the motor cortex ipsilateral to the moving body side depends on spatio-temporal task complexity and hemispheric specialization.</a> PLoS One. 6 (3), 17742(2011).</li>
<li>vanden Berg, F. E., Swinnen, S. P., Wenderoth, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Involvement+of+the+primary+motor+cortex+in+controlling+movements+executed+with+the+ipsilateral+hand+differs+between+left-+and+right-handers%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cognitive+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Involvement of the primary motor cortex in controlling movements executed with the ipsilateral hand differs between left- and right-handers.</a> Journal of Cognitive Neuroscience. 23 (11), 3456-3469 (2011).</li>
<li>Verstynen, T., Diedrichsen, J., Albert, N., Aparicio, P., Ivry, R. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ipsilateral+motor+cortex+activity+during+unimanual+hand+movements+relates+to+task+complexity%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neurophysiology%22%5BJournal%5D)">Ipsilateral motor cortex activity during unimanual hand movements relates to task complexity.</a> Journal of Neurophysiology. 93 (3), 1209-1222 (2005).</li>
<li>Lopez-Huerta, V. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Striatal+bilateral+control+of+skilled+forelimb+movement%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Striatal bilateral control of skilled forelimb movement.</a> Cell Reports. 34 (3), 108651(2021).</li>
<li>Lopez-Huerta, V. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+neostriatum%3A+two+entities%2C+one+structure%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Structure+and+Function%22%5BJournal%5D)">The neostriatum: two entities, one structure.</a> Brain Structure and Function. 221 (3), 1737-1749 (2016).</li>
<li>Becker, M. I., Calame, D. J., Wrobel, J., Person, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Online+control+of+reach+accuracy+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neurophysiology%22%5BJournal%5D)">Online control of reach accuracy in mice.</a> Journal of Neurophysiology. 124 (6), 1637-1655 (2020).</li>
<li>Jaidar, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synchronized+activation+of+striatal+direct+and+indirect+pathways+underlies+the+behavior+in+unilateral+dopamine-depleted+mice%5BTitle%5D)+AND+%22European+Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Synchronized activation of striatal direct and indirect pathways underlies the behavior in unilateral dopamine-depleted mice.</a> European Journal of Neuroscience. 49 (11), 1512-1528 (2019).</li>
<li>Gong, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeting+Cre+recombinase+to+specific+neuron+populations+with+bacterial+artificial+chromosome+constructs%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Targeting Cre recombinase to specific neuron populations with bacterial artificial chromosome constructs.</a> The Journal of Neuroscience. 27 (37), 9817-9823 (2007).</li>
<li>Rowland, N. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Food+or+fluid+restriction+in+common+laboratory+animals%3A+balancing+welfare+considerations+with+scientific+inquiry%5BTitle%5D)+AND+%22Comparative+Medicine%22%5BJournal%5D)">Food or fluid restriction in common laboratory animals: balancing welfare considerations with scientific inquiry.</a> Comparative Medicine. 57 (2), 149-160 (2007).</li>
<li>Ullman-Culleré, M. H., Foltz, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Body+condition+scoring%3A+a+rapid+and+accurate+method+for+assessing+health+status+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Laboratory+Animal+Science%22%5BJournal%5D)">Body condition scoring: a rapid and accurate method for assessing health status in mice.</a> Laboratory Animal Science. 49 (3), 319-323 (1999).</li>
<li>Chen, C. C., Gilmore, A., Zuo, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Study+motor+skill+learning+by+single-pellet+reaching+tasks+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Study motor skill learning by single-pellet reaching tasks in mice.</a> Journal of Visualized Experiments. (85), e51238(2014).</li>
<li>Fink, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Presynaptic+inhibition+of+spinal+sensory+feedback+ensures+smooth+movement%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Presynaptic inhibition of spinal sensory feedback ensures smooth movement.</a> Nature. 509 (7498), 43-48 (2014).</li>
<li>Li, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Refinement+of+learned+skilled+movement+representation+in+motor+cortex+deep+output+layer%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communication%22%5BJournal%5D)">Refinement of learned skilled movement representation in motor cortex deep output layer.</a> Nature Communication. 8, 15834(2017).</li>
<li>Overduin, S. A., d'Avella, A., Carmena, J. M., Bizzi, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microstimulation+activates+a+handful+of+muscle+synergies%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Microstimulation activates a handful of muscle synergies.</a> Neuron. 76 (6), 1071-1077 (2012).</li>
<li>Miyazaki, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Large+Timescale+interrogation+of+neuronal+function+by+fiberless+optogenetics+using+lanthanide+micro-particles%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Large Timescale interrogation of neuronal function by fiberless optogenetics using lanthanide micro-particles.</a> Cell Reports. 26 (4), 1033-1043 (2019).</li>
<li>Yang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Wireless+multilateral+devices+for+optogenetic+studies+of+individual+and+social+behaviors%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Wireless multilateral devices for optogenetic studies of individual and social behaviors.</a> Nature Neuroscience. 24 (7), 1035-1045 (2021).</li>
<li>Kampasi, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fiberless+multicolor+neural+optoelectrode+for+in+vivo+circuit+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Fiberless multicolor neural optoelectrode for in vivo circuit analysis.</a> Scientific Reports. 6, 30961(2016).</li>
<li>Allen, B. D., Singer, A. C., Boyden, E. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Principles+of+designing+interpretable+optogenetic+behavior+experiments%5BTitle%5D)+AND+%22Learning+%26+Memory%22%5BJournal%5D)">Principles of designing interpretable optogenetic behavior experiments.</a> Learning & Memory. 22 (4), 232-238 (2015).</li>
<li>Packer, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aPacker%2C+AM+%22Nature+Methods%22">Nature Methods</a>. 9, 1202-1205 (2012).</li>
</ol>

Yazarlar herhangi bir açıklama beyan etmemektedir.

İyi tanımlanmış davranışsal paradigmalarda nöronal popülasyonların optogenetik manipülasyonunun kullanılması, motor kontrolün altında yatan mekanizmalar hakkındaki bilgilerimizi ilerletmektedir 7,23. Kablosuz yöntemler özellikle birden fazla hayvan üzerinde test veya serbest dolaşım gerektiren görevler için uygundur34,35. Bununla birlikte, teknikler ve cihazlar rafine edildiğinden, optogenetik<sup class="...

Motor yetenekli davranış, tarafımızdan gerçekleştirilen çoğu hareket sırasında mevcuttur ve çeşitli beyin bozukluklarında etkilendiği bilinmektedir 1,2,3,4,5,6. Yetenekli hareketlerin gelişimini, öğrenimini ve performansını incelemeye izin veren görevlerin uygulanması, özellikle beyin hasarı, nörodejeneratif ve nörogelişimsel bozukluklar modellerinde motor fonksiyonun nörobiyolojik temellerini anlamak için çok önemlidir 2,7,8,9,10,11,12,13 . Nesnelere ulaşmak ve onları geri almak, günlük yaşam eylemlerinde rutin olarak yapılır ve erken gelişim sırasında edinilen ve daha sonra 5,6 yılları boyunca rafine edilen ilk motor becerilerden biridir. Nesnenin özelliklerinin algılanması, hareket planlaması, eylem seçimi, hareket yürütme, vücut koordinasyonu ve hız modülasyonu7,14,15,16 gibi duyusal-motor süreçler gerektiren karmaşık bir davranışı içerir. Bu nedenle, tek manuel yüksek el becerisi görevleri, her iki yarımkürenin birçok beyin yapısının katılımını gerektirir 16,17,18,19,20,21,22. Farelerde, tek pelet kavrama ulaşma görevi, ayrı ayrı kontrol edilebilen ve analiz edilebilen birkaç aşama için karakterize edilir 7,13,23. Bu özellik, edinim ve davranış performansının farklı aşamalarında spesifik nöronal alt popülasyonların katkısını incelemeye izin verir ve motor sistemlerin ayrıntılı çalışmaları için bir platform sağlar13,23,24. Hareket birkaç saniye içinde gerçekleşir; Bu nedenle, yetenekli motor yörüngesi 7,25'in farklı aşamalarında kinematik analiz için yüksek hızlı videografi kullanılmalıdır. Videolardan vücut duruşu, yörünge, hız ve hata türü25 dahil olmak üzere çeşitli parametreler çıkarılabilir. Kinematik analiz, kablosuz optogenetik manipülasyon 7,23 sırasında ince değişiklikleri tespit etmek için kullanılabilir.
Kablosuz kafaya monte edilmiş bir sistem aracılığıyla ışık iletmek için minyatür ışık yayan diyotların (LED'ler) kullanılması, hayvan görevi yerine getirirken uzaktan optogenetik kontrole sahip olmayı mümkün kılar. Kablosuz optogenetik kontrolör, bir uyarıcıdan gelen tek darbeli veya sürekli tetikleme komutlarını kabul eder ve minyatür LED 23,26'ya bağlı bir alıcıya kızılötesi (IR) sinyaller gönderir. Mevcut protokol, bu kablosuz optogenetik yaklaşımı, ince motor davranışın performansı sırasında spesifik nöronal popülasyonların rolünü incelemek için bir el becerisi görevinin yüksek hızlı videografisi ile birleştirmektedir23. Tek manuel bir görev olduğundan, her iki yarımküredeki yapıların katılımını değerlendirmeye izin verir. Geleneksel olarak, beyin vücut hareketini oldukça asimetrik bir şekilde kontrol eder; Bununla birlikte, yüksek el becerisine sahip görevler, ipsilateral çekirdekler ve 10,20,21,22,23 çekirdekleri içindeki nöronal alt popülasyonların diferansiyel katkısı da dahil olmak üzere birçok beyin yapısından dikkatli koordinasyon ve kontrol gerektirir. Bu protokol, her iki yarımküreden subkortikal yapıların ön ayak23'ün yörüngesini kontrol ettiğini göstermektedir. Bu paradigma, diğer beyin bölgelerini ve beyin hastalığı modellerini incelemek için uygun olabilir.

<table><tbody><tr><td>Anestezi makinesi</td><td>RWD</td><td>R583S</td><td>İzofluran buharlaştırıcı</td></tr><tr><td>Anesket</td><td>PiSA</td><td></td><td>Ketamin</td></tr><tr><td>Breadboard</td><td>Thorlabs</td><td>MB3090/M</td><td>Katı alüminyum optik breadboard</td></tr><tr><td>Kamera lensi</td><td>Canon</td><td></td><td>50mmf/ 1.4 manuel odak lensleri (c-mount)</td></tr><tr><td>Kamera sistemi</td><td>BrainVision</td><td>MiCAM02</td><td>Kamera denetleyicisi ve senkronizatör</td></tr><tr><td>Pamuklu çubuklar</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>CS çözeltisi</td><td>PiSA</td><td></td><td>Sodyum klorür çözeltisi %9</td></tr> <tr><td>Özelleştirilmiş eğitim odası</td><td>Kurum</td><td></td><td></td>içi</tr><tr><td>Matkap ucu # 105</td><td>Dremel</td><td>2 615 010 5AE</td><td>Gravür kesici</td></tr><tr><td>Tozsuz hassas çikolata peletleri</td><td>Bio-Serv</td><td>F05301</td><td></td></tr><tr><td>Etil Alkol</td><td>J. T.&nbsp; Baker</td><td>9000-02</td><td>Etanol</td></tr><tr><td>Gözlü Kulaklar</td><td>Ultracell</td><td>40400-8</td><td>Emici PVA malzemeli göz kulakları</td></tr><tr><td>Fluriso</td><td>VetOne</td><td>V1 502017-250</td><td>İzofluran</td></tr><tr><td>Cam kılcal damarlar</td><td>NanoJect II Hidrojen</td><td></td> peroksit Farmacom Antiseptik Yüksek hızlı kamera için Drumond Scientific <td>3-000-203-G/X</td> Pipetleri</tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td>BrainVision</td><td>MiCAM02-CMOS</td><td>Tek renkli yüksek hızlı kameralar</td></tr><tr><td>Kızılötesi emmiter</td><td>Teleopto</td><td></td><td></td></tr><tr><td>İnsülin şırınga</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>LED kanül</td><td>Teleopto</td><td>TelC-c-l-d</td><td>LED kanül 250um 487nm hafif</td></tr><tr><td>Mikropipet 10 uL</td><td>Eppendorf</td><td>Z740436</td><td></td></tr><tr><td>Mikro pipet çektirme</td><td>Sutter</td><td>P-87</td><td>Yatay çektirme</td></tr><tr><td>Mikroskobu LSM780</td><td>Zeiss</td><td></td><td>Konfokal mikroskop</td></tr><tr><td>Mikrotom</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sahte alıcı</td><td>Teleopto</td><td></td><td></td></tr><tr><td>NanoJect II</td><td>Drumond Scientific</td><td>3-000-204</td><td>Mikro enjektör</td></tr><tr><td>Oksijen tankı</td><td>Kızılötesi</td><td>na</td><td></td></tr><tr><td>pAAV-EF1a-double.floxed-hChR2(H134R)-mCherry-WPRE- HGHpA</td><td>Addgene</td><td>20297</td><td>ChR-2 ekspresyonu için viral vektör</td></tr><tr><td>Parafilm</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehit</td><td>Sigma</td><td>P-6148</td><td></td></tr><tr><td>Fosfat salin tamponu</td><td>Sigma</td><td>P-4417</td><td>Fosfat salin tampon tabletleri</td></tr><tr><td>Pipet uçları 10 uL</td><td>ThermoFisher</td><td>AM12635</td><td>0,5-10 uL&nbsp; hacim</td></tr><tr><td>Pisabental PiSA</td><td></td><td></td><td>Sodyum pentobarbital</td></tr><tr><td>Pleksiglas</td><td>ticari</td><td></td><td>Akrilik levha</td></tr><tr><td>Povidon iyot</td><td>Farmacom</td><td></td><td>Antiseptik</td></tr><tr><td>Procin</td><td>PiSA</td><td></td><td>Xylacine</td></tr><tr><td>Puralube</td><td>Perrigo pharma</td><td>1228112</td><td>Göz yağlayıcı %15 mineral yağ/%85 vazelin</td></tr><tr><td>Döner alet</td><td>Kmoon</td><td>Mini öğütücü</td><td>Standart</td></tr><tr><td>Neşter</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Neşter bıçağı</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Stereotaksik aparat</td><td>Çalma</td><td>51730D</td><td>Dijital cihaz</td></tr><tr><td>Süper Bond C & B</td><td>Sun Medical</td><td></td><td>Diş çimentosu</td></tr><tr><td>Cerrahi tek kullanımlık kapak</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Teleopto uzaktan kumanda</td><td>Teleopto</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tg Drd1-Cre fare hattı</td><td>Gensat</td><td>036916-UCD</td><td>Transgen yerleştirme FK150Gsat</td></tr><tr><td>Doku yapıştırıcısı</td><td>3M Vetbond</td><td>1469SB</td><td></td></tr><tr><td>TPI Vibratom 1000 plus</td><td>Peico</td><td></td><td>DAPI</td></tr><tr><td>Vektör laboratuvarları</td><td>H-1200</td><td>ile</td>Microtome<td>Vectashield montaj</td> ortamı</tr><tr><td>Kablosuz alıcı</td><td>Teleopto</td><td>TELER-1-P</td><td></td></tr></tbody></table>

İn vivo yetenekli motor davranışın kablosuz optogenetik kontrolü

In Vivo Wireless Optogenetic Control of Skilled Motor Behavior

İnce motor becerileri günlük yaşamda esastır ve çeşitli sinir sistemi bozukluklarında tehlikeye girebilir. Bu görevlerin kazanılması ve yerine getirilmesi duyusal-motor entegrasyonu gerektirir ve iki taraflı beyin devrelerinin hassas kontrolünü içerir. Hayvan modellerinde tek elle yapılan davranışsal paradigmaların uygulanması, striatum gibi beyin yapılarının, görevin yerine getirilmesi sırasında kontrol koşullarında ve hastalıkta belirli çekirdeklerin sinirsel aktivitesinin manipülasyonuna ve kaydedilmesine izin verdiği için karmaşık motor davranışa katkısının anlaşılmasını geliştirecektir. 
Kuruluşundan bu yana, optogenetik, nöronal popülasyonların seçici ve hedefli aktivasyonunu veya inhibisyonunu sağlayarak beyni sorgulamak için baskın bir araç olmuştur. Optogenetiğin davranışsal tahlillerle kombinasyonu, spesifik beyin fonksiyonlarının altında yatan mekanizmalara ışık tutmaktadır. Minyatür ışık yayan diyotlara (LED'ler) sahip kablosuz başa monte sistemler, tamamen serbest hareket eden bir hayvanda uzaktan optogenetik kontrole izin verir. Bu, kablolu bir sistemin sınırlamalarının, ışık emisyon verimliliğinden ödün vermeden hayvanların davranışları için daha az kısıtlayıcı olmasını önler. Mevcut protokol, belirli nöronal popülasyonların ince motor davranışa katkısını incelemek için kablosuz optogenetik yaklaşımı yüksek hızlı videografi ile tek manuel bir el becerisi görevinde birleştirmektedir.

Kavrama yeteneği görevi, farklı deneysel manipülasyonlar altında ince beceri hareketinin şekillendirme, öğrenme, performans ve kinematiğini incelemek için yaygın olarak kullanılan bir paradigmadır. Fareler görevi birkaç gün içinde yerine getirmeyi öğrenir ve 5 günlük eğitimden sonra bir platoya ulaşan% 55'ten fazla doğruluk elde eder (Şekil 2A, B). Daha önce bildirilenlere benzer şekilde, hayvanların bir yüzdesi görevi uygun şekilde yerine getirmemektedir (% 29.62) ve bunlar...

Mevcut protokol, serbest hareket eden farelerde yetenekli motor davranışın performansında yer alan nöral devreleri karakterize etmek için tek bir pelet ulaşma-kavrama görevinde yüksek hızlı videografi ile birleştirilmiş kablosuz optogenetiğin nasıl kullanılacağını açıklamaktadır.

İn Vivo Yetenekli Motor Davranışın Kablosuz Optogenetik Kontrolü

Fine motor skills are essential in everyday life and can be compromised in several nervous system disorders. The acquisition and performance of these ...

Mevcut protokol, yetenekli motor davranışın altında yatan beyin mekanizmalarının incelenmesine katkıda bulunmaktadır. Kablosuz optogenetik, denekler serbest dolaşımda bir görevi yerine getirirken belirli nöronların manipülasyonuna izin verir. Yüksek hızlı videografi ile birlikte, ince motor davranışının ayrıntılı bir analizini yapmak mümkündür.Yöntem, nörogelişimsel ve nörodejeneratif bozukluklardaki motor problemlerin anlaşılmasına yardımcı olabilir. Bu teknikler, diğer davranışsal paradigmalarda da beyin fonksiyonlarını incelemek için kullanılabilir. Laboratuvarımdan bir lisans öğrencisi olan Diana Rodriguez-Munoz, deneye yardımcı olacak.Cerrahi prosedürler için, ilgilenilen yapının dorso-ventral koordinatlarına göre istenen uzunlukta bir LED kanül hazırlayarak başlayın. Bunu yapmak için, cam elyafını istenen son boyuttan daha uzun bir uzunluğa kadar kesin ve elyaf ucunu kaba zımpara kağıdı ile hedef uzunluğa kadar öğütün. Ardından, fiber ucu ince zımpara kağıdı ile cilalayın.Mikroenjeksiyonlar için, bir pipeti mineral yağ ile doldurun ve pipeti mikroenjektöre yerleştirin. Bazı mineral yağları enjekte ederek mikroenjektörün doğru çalıştığından emin olun. Daha sonra, anestezi uygulanan fareyi oftalmik bir merhem uygulayarak ve saç derisinden bir düzeltici ve epilasyon kremi ile saç çıkararak ameliyat için hazırlayın.Daha sonra, kafa derisini% 8 povidon iyot ve% 70 etanol içeren pamuklu çubuklarla silin. Sanitizasyondan sonra, fareyi stereotaksik aparata yerleştirin ve kafatasının medial-lateral ve anterior-posterior eksenlerde düzleştirilmesini sağlayarak kafayı sabitleyin. Sagital eksen boyunca göz hizasında kafa derisinden bir santimetrelik bir kesi yapmak için bir neşter kullanın.Ardından, kafatasını açığa çıkarmak için cildi geri çekin ve periostu pamuklu çubuklarla temizleyin. Kafatası yüzeyini tuzlu su çözeltisi ve pamuklu çubuklarla temizleyin ve steril emici göz mızrakları kullanarak yüzeydeki kanamaları çözün. Daha sonra, pamuklu çubukla %2,5'lik bir damla hidrojen peroksit uygulayın ve kafatası dikişlerini görünür kılmak ve daha iyi bir referansa sahip olmak için birkaç saniye boyunca hareket etmesine izin verin.Birkaç saniye sonra, bölgeyi temiz bir pamuklu çubukla iyice temizleyin. 15 mikron nihai uç çapına sahip bir cam pipetle, kafatasının ön-arka eksende düzleştirilip düzleştirilmediğini kontrol etmek için bregma ve lambda'yı bulun. Ardından, kafa derisindeki bir referans noktasını seçilen koordinatların üzerinde bir işaretleyici ile boyayın.Referans noktasında, küçük, yuvarlak bir dental matkap ucu ile düşük ila orta hızda döner bir aletle kafatasına hafif basınç uygulayan bir milimetre çapında bir kraniyotomi gerçekleştirin. İşiniz bittiğinde, kılcal damarı seçilen ön-posterior veya AP ve medial-lateral veya ML koordinatlarına doğru hareket ettirin. Kılcal damarı, CreE'ye bağımlı adeno ilişkili virüsün 300 ila 400 nanolitresi veya AAV1, D-flox channelrhodopsin mCherry gibi AAV ile yükleyerek ilgilenilen bölgedeki channelrhodopsin eksprese edin.Bir AAV, muhabir proteinini eksprese etmek için bir kontrol olarak kullanılabilir. Ucun tıkanmadığından emin olduktan sonra, cam pipeti beyinde dorso-ventral eksi 3.35 milimetre koordinatlarında dorsal-lateral striatumda tanıtın ve saniyede 23 nanolitre hızında otomatik bir enjektör kullanarak virüsün 200 nanolitresini enjekte edin. Dökülmeyi önlemek için cam pipeti yavaşça çekmeden önce enjeksiyondan sonra 10 dakika bekleyin.Ardından, kalıntıları pamuklu çubuklarla temizleyin ve kurutun. Ardından, cam LED kanülü stereotaksik kola takın ve referans olarak bregma kullanarak koordinatları kalibre edin. Ardından, doku hasarını önlemek için kanülü yavaşça yerleştirin ve enjeksiyon bölgesinin 100 mikrometre yukarısına yerleştirin.LED kanül yerleştirildikten sonra, kraniyotominin kenarına 100 mikrolitre doku yapıştırıcısı damlası ekleyin. Kanül konektörünün etrafına azar azar taze hazırlanmış bir diş çimento karışımı uygulamak için steril bir fırça kullanın, kafatası kaplanana ve konektör kafatasına güvenli bir şekilde tutturulana kadar katmanlar oluşturarak pimleri tamamen serbest bırakın. Çimento tamamen kuruduğunda, doku yapıştırıcısı kullanarak implantın etrafındaki cildi kapatın.Ardından, rahatsızlık veya ağrı belirtilerini izlerken fareyi 33 santigrat derecede bir ısıtma yastığı üzerinde bir kurtarma kafesine yerleştirin. Hayvanın davranışını normal bir kamerayla kaydedin ve odanın önünden saniyede 30 ila 60 kare yakalayın. Hayvanın duruşunu izlemek için eğitim odasının altına 45 derecelik bir açıyla bir ayna yerleştirilebilir.Fareler pelet üzerinde ulaşmaya başladığında, davranışın iki saniyeden fazla gerçekleştirilmemesi için sürekli bir stimülasyona sahip olmak için LED kanülü uzaktan kumanda ile manuel olarak çevirin. Stimülasyon cihazı, milimetre kare başına bir miliwatt'ın ucunda yoğunluğa sahip 470 nanometrelik bir LED'i tetikler. Optogenetik manipülasyonlar altındaki hayvanın ince motor davranışı, kavrama yeteneği ile incelenmiştir.Fareler görevi birkaç gün içinde yerine getirmeyi öğrendiler ve% 55'ten fazla doğruluk elde ederek beş günlük eğitimden sonra bir platoya ulaştılar. Hareketlerin yörüngesi, kinematiğin analiz edilmesini mümkün kılan yüksek hızlı videografi ile izlendi. Kat edilen mesafe, hız, ivmelenme, bitiş noktası ve yörünge gibi parametrelerin ölçülebilir değerlendirmesi yapıldı.Kaçırılan denemelerde, fareler kavrama hareketini peletten vuruş denemelerinden daha uzakta başlattılar. Ek olarak, hatalar, vuruş ve kaçırılan denemeler sırasında vücut açısındaki farklılıklarla gösterilen fare duruşuyla önemli ölçüde ilişkiliydi. Dikenli projeksiyon nöronlarını veya SPN'leri eksprese eden D1 dopaminin kontralateral aktivasyonu, kontrol koşullarına kıyasla kavrama başarısını azaltmıştır.Bir optogenetik stimülasyon sırasında, pençe yörüngesi seyahat mesafesinde artmış, bu da peleti hedefleyememeye ve ilk hata tipi birde bir artışa yol açmıştır. İlke bileşen analizi veya PCA, kontralateral D1 SPN'lerin aktivasyonu sırasındaki tüm deneme yörüngelerinin, kontrol kümesiyle neredeyse hiç örtüşmeyen bir kümede ayrıldığını ve bunun düşük bir benzerlik gösterdiğini göstermiştir. DSPN'lerin ipsilateral tarafta aktivasyonu, PCA analizi ile gösterilen yörünge dağılımında bir artışa yol açmıştır.Bu nedenle, ipsilateral D1 SPN'lerin aktivasyonu, davranışsal sonucu değiştirmeden ulaşma yörüngesini değiştirdi. Bu protokolü uygularken, kanülü doğru bir şekilde yerleştirmeye dikkat edin, böylece eğitim oturumları sırasında ayrılmaz. Bu yöntem, motor davranışı, duyusal işlemeyi, öğrenmeyi ve hafızayı incelemek için diğer davranışsal paradigmalarda kullanılabilir.Kablosuz optogenetik, gerçekten serbest hareket eden deneklerde natüralist davranışı ve nörobiyolojik temellerini incelemeye izin verecektir.

in-vivo-wireless-optogenetic-control-of-skilled-motor-behavior

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Sinirbilim

Kaynak: Kodani, S., et.al. Farelerde Uyku / Uyanıklık Durumlarının İzlenmesi Sırasında Nöral Devrelerin Optogenetik Manipülasyonu. J. Vis. Uzm. (2019)Bu video, farelerde uykudan uyanıklığa geçişte yer alan nöral devrelerin optogenetik manipülasyonunu göstermektedir. Prosedür, ışık stimülasyonunu ve elektrofizyolojik kaydı mümkün kılmak için beyne ve kaslara bir optik fiber ve elektrotların cerrahi olarak implante edilmesini içerir. Stria terminalisin (BNST) yatak çekirdeğindeki ışığa duyarlı...

Farelerde Uykudan Uutanlığa Geçiş için Nöral Devrelerin Optogenetik Manipülasyonu

Optogenetics gelişimi artık kesin tanımlı genetik nöronlar ve devreler uyarmak için araç, hem de...

Beyin Dokusu Kronik Optogenetic uyarılması için Fiber-optik İmplantasyon

Genetik ve optik birleştirmek nörobilim araçlarının son gelişmeler, mekansal ve zamansal çözünürlük görülmemiş bir düzeye ile nöral devre faaliyet üzerinde kontrol sağlayan, "optogenetics" olarak adlandırılır. Burada prefrontal korteks ve subicular piramidal nöronların genetik tanımlanmış alt kümelerinin optogenetic manipülasyon ile vivo kayıtta entegre etmek için bir protokol sağlar.

Bireysel piramidal nöronlar High Fidelity optogenetic Kontrolü için Bir Yöntem<em&gt; In vivo</em

Yarı sağlam motor çıkış değişiklikleri (kas kasılması) izlerken Burada motoneuronal faaliyet optogenetic manipülasyon için bir protokol...

Yarı sağlam Lazer Aydınlatma ile Sinir Faaliyet optogenetic Pertürbasyon<em&gt; Drosophila</emMotion&gt; Larva

Optogenetik, davranışsal sinirbilim deneylerinde kullanım için güçlü bir araç haline geldi. Bu protokol, lazer sistemlerinin tasarımı ve kurulumu için adım adım bir kılavuz sunar ve çoğu kemirgen davranışsal test paradigmasıyla uyumlu çoklu ve eşzamanlı in vivo optogenetik stimülasyonların gerçekleştirilmesi için tam bir protokol sağlar.

Kemirgen Santral Sinir Sistemi vivo optogenetic Stimülasyon içinde

Bir kablosuz fareler serbestçe davranışlar içinde stimülasyon ve çok kanallı sinirsel kayıtları için çift yönlü sistemi tanıttı. Hafif ve küçük, böylece animal´s davranış repertuar üzerinde en az etkiye sistemidir. Ayrıca, bu çift yönlü sistem beyin harekete geçirmek desen ve davranışı arasındaki nedensel ilişkileri değerlendirmek için gelişmiş bir araç sağlar.

Kablosuz, Vivo içinde kayıt ve fareler serbestçe davranışlar içinde sinirsel aktivite uyarılması için çift yönlü arayüzü

Burada, biz farelerde uyku/uyanıklık devletlerin izlenmesi sırasında nöronların belirli türlerinin optogenetik manipülasyon yöntemlerini açıklamak, bir örnek olarak stria terminalis yatak çekirdeği üzerinde son çalışma sunma.

Farelerde uyku/uyanıklık durumları Izleme sırasında nöral devrelerin optogenetik manipülasyon

Burada, viral ifade vektörel çizimler ipek fibroin Filmler kullanarak beynine teslim etmek için bir yöntem mevcut. Bu yöntem ifade vektörel çizimler ipek/AAV kaplamalı optik lifler, konik optik lifler ve kafatası windows kullanarak hedeflenen teslimini sağlar.

Vivo Optogenetic proteinlerin ipek/AAV filmleri kullanarak hedeflenen ifade

Belirli nöronal popülasyonların veya beyin bölgelerinin optogenetik manipülasyonu ile, davranış serbestçe hareket eden hayvanlarda yüksek zamansal ve mekansal çözünürlük ile değiştirilebilir. Kronik implante optik lifler ile birlikte farklı optogenetik araçlar kullanılarak, nöronal modülasyonlar ve davranışsal testler çeşitli yapılabilir.

SerbestÇe Hareket Eden Farelerde Davranışı Modüle Etmek Için Nöronal Aktivitenin Optogenetik Manipülasyonu

Burada, akut kemirgen beyin dilimlerinde sinapsa özgü elektrofizyolojik karakterizasyona izin vermek için optogenetik yapılara sahip ayrık beyin bölgelerinin viral transdüksiyonunu tanımlayan bir protokol sunuyoruz.

Eski Vivo Medial Prefrontal Korteksten Lateral Entorinal Kortekse Uzun Menzilli Sinaptik İletim ve Plastisitenin Optogenetik Sorgulanması

Elektrot üretimi için basitleştirilmiş ve uygun maliyetli bir yaklaşım geliştirdik ve serbestçe hareket eden farelerde birden fazla bölgede sinyallerin kayıtlarını gerçekleştirdik. Çok bölgeli elektrofizyoloji ve kalsiyum sinyal kaydının yanı sıra optogenetiğin kullanılması, nöbet tutuşturma modelinde bölgeler arasında nöronal aktivitelerin ortaya çıkarılmasını sağladı.

Çok Bölgeli İn Vivo Kayıt için Esnek ve Kullanışlı Elektrofizyolojik Seçenekler Hazırlamak için Entegre Bir Yöntem

Öğrenin kablosuz optogenetik ve yüksek hızlı video görüntüleme ile farelerde yetenekli motor davranışın sinir devrelerini nasıl analiz edeceğinizi. Bu yöntem, ince motor kontrolünün beyin mekanizmalarını anlamak için kullanılır.

İn Vivo Yetenekli Motor Davranışın Kablosuz Optogenetik Kontrolü

Daha fazla video keşfet