İnfaz Floresan in situ Multipl Miyelomun Kemik İliği Yaymalarının Hibridizasyonu

Multipl miyelomda genetik risk tabakalaşmasına FISH adı verilen Floresan In Situ Hibridizasyonun uygulanması esastır. FISH raporlarının kritik kısmı, tüm çekirdekli hücreler değil, anti-CD138 manyetik boncuklarla sıralanarak veya sitoplazmik kappa veya cIg FISH adı verilen FISH testi ile Lambda hafif zincirli immünoglobulin ile işaretlenerek spesifik olarak saflaştırılmış veya tanımlanmış klonal plazma hücreleridir. Plazma hücresi sıralamasından sonra interfaze FISH veya cIg FISH, kemik iliğindeki plazma hücrelerinin nispeten daha düşük oranı nedeniyle multipl miyelom tanısında önemli olduğu ortaya çıkmaktadır.

Bununla birlikte, bu yöntemlerin karmaşık süreçler, yüksek numune talepleri ve yüksek deney maliyetleri gibi bazı eksiklikleri vardır. Plazma hücreleri hızlı bir şekilde kemik iliği yaymasına yerleştirilebilir. Buna dayanarak, multipl miyelom hücrelerinin tespiti için kemik iliği yayma FISH kullanıyoruz.

Bu çalışma, Helsinki Deklarasyonu'nun ilkelerine göre yürütülmüş ve Wuhan Üniversitesi Zhongnan Hastanesi Etik Komitesi tarafından onaylanmıştır. Örnekler, Çin Wuhan Üniversitesi Zhongnan Hastanesi Hematoloji Bölümü'ndeki multipl miyelom hastasından toplandı. İlk 0.2 mililitre kemik iliği solüsyonunu temiz bir tek kullanımlık cam kızağa yerleştirin, kemik iliğini hızlı bir şekilde çıkararak kemik iliği lekelerini eşit kalınlığa ve keskin kuyruklara yayın, ardından doğal olarak kurutun.

Kemik iliği filmlerini oda sıcaklığında yaklaşık 10 saniye boyunca bir mililitre Wright-Giemsa çözeltisi ile örtün. Slaytlara bir mililitre fosfat tamponu ekleyin, boya çözeltisinin kurumasını veya slaytlardan akmasını önlemek için özen gösterildi. Boya çözeltisini nazikçe karıştırın ve oda sıcaklığında 15 dakika bekletin.

Slaytları temiz suyla durulayın ve oda sıcaklığında havada kurulayın. Kötü huylu plazma hücrelerini tespit etmek için ileri ışık mikroskobu kullanın, plazma hücreleri iyi dağılmış olmalıdır. Şimdi sahada gördüğümüz şey, oldukça dağılmış plazma hücreleridir.

Bu tipik bir Binükleer nükleer plazma hücresidir. Plazma hücrelerinin rengini değiştirmek ve sabitlemek için hibridize alanı 10 dakika boyunca fiksatif çözelti ile örtün. Slaytı deiyonize suyla durulayın ve oda sıcaklığında havada kurutun.

İki kez SSC tamponu içeren bir kavanozu bir su banyosunda 56 santigrat dereceye kadar önceden ısıtın. Hazırlanan kemik iliği yaymasını önceden ısıtılmış iki kez SSC tamponunda 10 dakika boyunca yıkayın, ardından oda sıcaklığında deiyonize suya batırın. Yaymayı bir dakika boyunca her biri% 70% 85 ve% 100 etanol gradyanında dehidre edin.

Bulaşmayı 10 dakika boyunca havada kurutun. İlk önce hibridizasyon alanına kromozom 17 prob karışımının sentromerine TP53 ekleyin ve alttan hava kabarcıklarını gidermek için ince sivri cımbızlara hafifçe bastıran bir kapak kayması ile örtün. İyi bir sızdırmazlık sağlamak için kapak kaymasının her tarafını kauçuk çimento ile kapatın.

Kauçuk çimentonun katılaşmasından sonra, kızak otomatik bir FISH makinesine yerleştirildi ve beş dakika boyunca 78 santigrat derecede denatürasyon yapıldı ve ardından gece boyunca 37 santigrat derecede hibridizasyon yapıldı. Slaytı FISH makinesinden alın. Kauçuk çimentoyu nazikçe çıkarmak için ince sivri uçlu cımbız kullanın.

Kapak kaymasını yıkamak için slaytı oda sıcaklığında iki kez SSC'ye yaklaşık bir veya iki dakika batırın. Slaytı 68 santigrat derece ön ısıtma tamponunda iki dakika boyunca bir su banyosunda yıkayın. Slaytları iki kez SSC ile 37 santigrat derece su banyosunda bir dakika boyunca yıkayın.

Hibridize alana 10 mikrolitre DAPI'de 10 dakika boyunca iyice kuruması için karanlıkta ayarlayın, bir kapak kayması ile örtün. Bir floresan mikroskobunda uygun bir filtre seti kullanarak hibridize edilmiş slaytı görüntüleyin, hücre çekirdeğinin floresan yoğunluğunu gözlemlemek için tek renkli mavi florofor optik filtre kullanın. Hücre çekirdeği görüntülerini bir DAPI filtre kümesi altında alın.

CEP17 yeşil floresan ile etiketlendi. CEP17'nin yerini gözlemlemek için spektrum yeşil florofor optik filtre kullanın. CEP17 sinyal görüntüsünü yeşil filtre seti altında alın.

TP53 geni turuncu floresan ile etiketlendi. TP53'ü gözlemlemek için spektrum turuncu florofor optik filtresini kullanın, setin altındaki TP53 sinyal görüntüsünü alın, bu üç görüntüyü bir bütün halinde birleştirin ve sayısal anormallikleri inceleyin. Normal bir fazlar arası hücrede, bir çift normal kromozomu gösteren mavi floresanlı bir çekirdeğin içinde iki turuncu ve iki yeşil sinyal gözlenir 17.

Sonuçlar, multipl miyelom hastasında kemik iliğinin morfolojisini ve genetiğini gösterdi. Şekil A, kemik iliği yaymasındaki plazma hücrelerinin% 15'inin normalden daha büyük miktarda sitoplazma ile birlikte daha büyük, daha koyu ve nükleere sahip olduğunu göstermiştir. Şekil B, bir kemik iliği yaymasında çekirdekli bir plazma hücresi tarafından temsil edilen gri skala görüntüsünü göstermiştir.

Şekil C, plazma hücresinin bir interfaz çekirdeğinde dört turuncu ve dört yeşil sinyal gösterdi ve bu da kromozom 17'nin dört kopyasının bir çekirdekte lokalize olduğunu düşündürdü. Şekil D, bu hastanın anormal kromozom karyogramının bir çekirdekte iki çift kromozom 17'yi doğruladığını göstermiştir. Kemik iliği yaymalarının elde edilmesi, antikoagülan kemik iliği örneklerinden çok daha kolaydır, çünkü antikoagüle kemik iliği elde etmek, çekirdeği elde etmek için karmaşık prosedürler gerektirir.

Bu doğrultuda multipl miyelom hücrelerinin tespiti için kemik iliği yayma FISH için ikna edici bir yöntem oluşturduk.