Name: İnfaz Floresan in situ Multipl Miyelomun Kemik İliği Yaymalarının Hibridizasyonu (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-04-15T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 53 s
Description: Öğrenin multipl miyelom tanısında kemik iliği yaymaları üzerinde interfaz FISH protokolünü. Bu yöntem, klonal plazma hücrelerinin hızlı tespitini sağlayarak maliyetleri düşürür ve tanı doğruluğunu artırır.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Bu proje WNLO 2018WNLOKF023 İnovasyon Fonu tarafından desteklenmiştir.

Bu çalışma, Helsinki Deklarasyonu'nun ilkelerine göre yürütülmüş ve Wuhan Üniversitesi Zhongnan Hastanesi Etik Komitesi (No. 2019065) tarafından onaylanmıştır. Örnekler, Wuhan Üniversitesi Zhongnan Hastanesi (Çin) Hematoloji Bölümü'ndeki bir MM hastasından toplandı.
1. BM yaymalarının hazırlanması
<ol><li>İlk 0,2 mL BM çözeltisini temiz bir tek kullanımlık cam kızağa yerleştirin.</li>
	<li>BM'yi hızla çıkararak BM yaymalarını keskin kuyruklarla eşit kalınlığa yayın. Daha sonra doğal olarak kurulayın.</li>
	<li>BM filmlerini oda sıcaklığında yaklaşık 10 s boyunca 1 mL Wright-Giemsa çözeltisi ile örtün.</li>
	<li>Slaytlara 1 mL fosfat tamponu ekleyin. NOT: Boya çözeltisinin kurumasını veya slaytlardan akmasını önlemeye özen gösterin.</li>
	<li>Boya çözeltisini nazikçe karıştırın ve oda sıcaklığında 15 dakika boyunca saklayın.</li>
	<li>Slaytları temiz suyla durulayın ve oda sıcaklığında havada kurulayın.</li>
	<li>Kötü huylu bilgisayarları tespit etmek için ileri ışık mikroskobu kullanın. PC'ler iyi dağılmış olmalıdır.</li>
</ol>2. BM yaymalarının FISH ön işlemesi
<ol><li>PC'lerin rengini değiştirmek ve sabitlemek için hibridize edilmiş alanı 10 dakika boyunca fiksatif çözelti ile örtün.<ol>
<li>Taze fiksatif çözelti hazırlamak için, metanolü buzul asetik asit ile 3: 1 hacim oranında karıştırın.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Slaytı deiyonize suyla (dH2O) durulayın ve oda sıcaklığında havada kurutun.</li>
	<li>2x SSC tamponu içeren bir kavanozu su banyosunda 56 °C'ye önceden ısıtın. Kullanmadan önce tamponu 20x SSC'ye kadar taze olarak seyreltin.<ol>
<li>20x SSC hazırlamak için, 176 g sodyum klorür ve 88 g sodyum sitratı 800 mL dH2O ile iyice karıştırın. pH'ı ölçün ve pH 5.3 ± 0.2'ye ayarlayın. Ardından, son hacmi 1 L'ye getirmek için dH2O ekleyin.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Hazırlanan BM smearını önceden ısıtılmış 2x SSC tamponunda 10 dakika yıkayın, ardından oda sıcaklığında deiyonize suya batırın.</li>
	<li>Yaymayı bir etanol gradyanında (% 70,% 85 ve% 100 etanol, her biri 1 dakika boyunca) kurutun. Lekeyi 10 dakika boyunca hava ile kurulayın.</li>
</ol>3. BM smear BALIK ve yıkama
NOT: Tüm adımlar, floresan söndürmeyi önlemek için karanlık bir odada gerçekleştirilmiştir.
<ol><li>Kromozom 17 (CEP17) prob karışımının TP53 / sentromerini hibridizasyon alanına ekleyin ve bir kapak kayması ile örtün. Hava kabarcıklarını alttan çıkarmak için ince sivri cımbızla hafifçe bastırın.</li>
	<li>İyi bir sızdırmazlık sağlamak için kapak kaymasının her tarafını kauçuk çimento ile kapatın.</li>
	<li>Kauçuk çimentonun katılaşmasından sonra, sürgüyü otomatik bir FISH makinesine yerleştirin. 5 dakika boyunca 78 °C'de denatürasyon, ardından gece boyunca 37 °C'de hibridizasyon gerçekleştirin.</li>
	<li>Slaytı FISH makinesinden alın. Kauçuk çimentoyu nazikçe çıkarmak için ince sivri cımbız kullanın.</li>
	<li>Kapak kapağını yıkamak için kızağı oda sıcaklığında 2x SSC'ye yaklaşık 1 veya 2 dakika batırın.</li>
	<li>Kızağı 68 °C önceden ısıtılmış 0,4x SSC/%0,3 NP-40 tamponunda bir su banyosunda 2 dakika boyunca yıkayın.<ol>
<li>20 mL 20x SSC (pH 5.3) ile 950 mL dH2O karıştırarak 0,4x SSC / %0,3 NP-40 çözeltisi hazırlayın. Daha sonra, 3 mL NP-40 ekleyin ve tamamen çözünene kadar iyice karıştırın. OH'yi ölçün ve NaOH ile 7.0-7.5'e ayarlayın. Ardından, toplam çözeltinin son hacmini 1 L'ye getirmek için dH2O ekleyin.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Kızakları 2x SSC ile 37 °C su banyosunda 1 dakika boyunca yıkayın. 10 dakika boyunca iyice kuruması için karanlıkta dik ayarlayın.</li>
	<li>Hibridize alana 10 μL DAPI ekleyin ve bir kapak kayışı ile örtün.</li>
</ol>4. FISH analizi ve görüntüleme
<ol><li>Floresan mikroskopta uygun bir filtre seti kullanarak hibridize slaytı görüntüleyin.</li>
	<li>Hücre çekirdeğinin floresan yoğunluğunu gözlemlemek için tek renkli mavi florofor optik filtre kullanın. Hücre çekirdeği görüntülerini bir DAPI filtre kümesi altında alın.</li>
	<li>Bir hücrenin kaç kromozom içerdiğini göstermek için bir kromozom sentromer probu kullanın. CEP17'yi yeşil floresan ile etiketleyin. CEP17'nin yerini gözlemlemek için spektrum yeşili florofor optik filtre kullanın. Yeşil filtre setinin altında bir CEP17 sinyal görüntüsü alın.</li>
	<li>TP53 genini turuncu floresan ile etiketleyin. TP53'ü gözlemlemek için spektrumlu turuncu florofor optik filtre kullanın. Bu setin altında bir TP53 sinyal görüntüsü alın.</li>
	<li>Bu üç görüntüyü birleştirin ve sayısal anormallikler için inceleyin. NOT: Normal bir fazlar arası hücrede, mavi floresanlı bir çekirdeğin içinde iki turuncu ve iki yeşil sinyal gözlenir ve bu da bir çift normal kromozom 17'yi gösterir (Şekil 1).</li>
</ol>

<ol><li>Sonneveld, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Treatment+of+multiple+myeloma+with+high-risk+cytogenetics%3A+a+consensus+of+the+International+Myeloma+Working+Group%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Treatment of multiple myeloma with high-risk cytogenetics: a consensus of the International Myeloma Working Group.</a> Blood. 127, 2955-2962 (2016).</li>
<li>Radbruch, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Competence+and+competition%3A+the+challenge+of+becoming+a+long-lived+plasma+cell%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Immunology%22%5BJournal%5D)">Competence and competition: the challenge of becoming a long-lived plasma cell.</a> Nature Reviews Immunology. 6, 741-750 (2006).</li>
<li>Lai, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improved+cytogenetics+in+multiple+myeloma%3A+a+study+of+151+patients+including+117+patients+at+diagnosis%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Improved cytogenetics in multiple myeloma: a study of 151 patients including 117 patients at diagnosis.</a> Blood. 85 (9), 2490-2497 (1995).</li>
<li>Hallek, M., Bergsagel, P. L., Anderson, K. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiple+myeloma%3A+increasing+evidence+for+a+multistep+transformation+process%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Multiple myeloma: increasing evidence for a multistep transformation process.</a> Blood. 91, 3-21 (1998).</li>
<li>Munsh, N. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Consensus+recommendations+for+risk+stratification+in+multiple+myeloma%3A+report+of+the+International+Myeloma+Workshop+Consensus+Panel+2%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Consensus recommendations for risk stratification in multiple myeloma: report of the International Myeloma Workshop Consensus Panel 2.</a> Blood. 117, 4696-4700 (2011).</li>
<li>Gole, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((cIg-FISH+On+Patients+with+Multiple+Myeloma+-+A+Modified+and+Simple+Technique+Easily+Incorporated+Into+Routine+Clinical+Service%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">cIg-FISH On Patients with Multiple Myeloma - A Modified and Simple Technique Easily Incorporated Into Routine Clinical Service.</a> Blood. 120, 4792-4792 (2012).</li>
<li>Lee, S. H., Erber, W., Porwit, A., Tomonaga, M., Peterson, L. I. C. S. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hematology%2C+ICSH+guidelines+for+the+standardization+of+bone+marrow+specimens+and+reports%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Laboratory+Hematology%22%5BJournal%5D)">Hematology, ICSH guidelines for the standardization of bone marrow specimens and reports.</a> International Journal of Laboratory Hematology. 30, 349-364 (2008).</li>
<li>Štifter, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Combined+evaluation+of+bone+marrow+aspirate+and+biopsy+is+superior+in+the+prognosis+of+multiple+myeloma%5BTitle%5D)+AND+%22Diagnostic+Pathology%22%5BJournal%5D)">Combined evaluation of bone marrow aspirate and biopsy is superior in the prognosis of multiple myeloma.</a> Diagnostic Pathology. 5, 30(2010).</li>
<li>Huegel, A., Coyle, L., McNeil, R., Smith, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+interphase+fluorescence+in+situ+hybridization+on+direct+hematological+bone+marrow+smears%5BTitle%5D)+AND+%22Pathology%22%5BJournal%5D)">Evaluation of interphase fluorescence in situ hybridization on direct hematological bone marrow smears.</a> Pathology. 27, 86-90 (1995).</li>
<li>Jacobsson, B., Bernell, P., Arvidsson, I., Hast, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Classical+morphology%2C+esterase+cytochemistry%2C+and+interphase+cytogenetics+of+peripheral+blood+and+bone+marrow+smears%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Histochemistry+and+Cytochemistry%22%5BJournal%5D)">Classical morphology, esterase cytochemistry, and interphase cytogenetics of peripheral blood and bone marrow smears.</a> The Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 44, 1303-1309 (1996).</li>
<li>Dunning, K., Safo, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+ultimate+Wright-Giemsa+stain%3A+60+years+in+the+making%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnic+%26+Histochemistry%22%5BJournal%5D)">The ultimate Wright-Giemsa stain: 60 years in the making.</a> Biotechnic & Histochemistry. 86, 69-75 (2011).</li>
<li>Woronzoff-Dashkoff, K. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+wright-giemsa+stain.+Secrets+revealed%5BTitle%5D)+AND+%22Clinics+in+Laboratory+Medicine%22%5BJournal%5D)">The wright-giemsa stain. Secrets revealed.</a> Clinics in Laboratory Medicine. 22, 15-23 (2002).</li>
<li>McPherson, R. A., Pincus, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Henry%27s+Clinical+diagnosis+and+Management+by+Laboratory+Methods+E-book%5BTitle%5D)+AND+%22Elsevier+Health+Sciences%22%5BJournal%5D)">Henry's Clinical diagnosis and Management by Laboratory Methods E-book.</a> Elsevier Health Sciences. , (2017).</li>
<li>Ross, F. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Report+from+the+European+Myeloma+Network+on+interphase+FISH+in+multiple+myeloma+and+related+disorders%5BTitle%5D)+AND+%22Haematologica%22%5BJournal%5D)">Report from the European Myeloma Network on interphase FISH in multiple myeloma and related disorders.</a> Haematologica. 97, 1272-1277 (2012).</li>
</ol>

Yazarların açıklayacak hiçbir şeyleri yoktur.

MM'de genetik risk sınıflamasına FISH'in uygulanması esastır. FISH raporlarının kritik kısmı tüm çekirdekli hücreler değil, anti-CD138 manyetik boncuklarla sıralanarak veya sitoplazmik immünoglobulin hafif zincir κ veya λ ile işaretlenerek özel olarak saflaştırılan veya tanımlanan klonal PC'lerdir. PC sıralama veya cIg-FISH sonrası interfaze FISH, BM'deki PC'lerin nispeten daha düşük oranı nedeniyle MM tanısında anlamlı bulunmuştur. Bununla birlikte, bu yöntemlerin karmaşık süreçler, yüksek numune talepleri ve yüksek den...

Multipl miyelom (MM), güçlü biyolojik heterojeniteye ve klinik etkinliğinde büyük bireysel farklılıklara sahip, sağkalım süreleri aylardan on yıllara kadar değişen malign bir plazma hücresi (PC) hastalığıdır. Sitogenetik özellikler MM'nin önemli prognostik göstergeleridir. Risk sınıflandırma sistemi ve genetik özelliklere dayalı bireyselleştirilmiş tedaviler, MM1 ile ilgili klinik araştırmalarda yoğun ilgi gören konular haline gelmiştir. Kemik iliğinin (BM) floresan in situ hibridizasyon (FISH) panelinde test edilen PC'lerin anormallikleri arasında del 13q14 (RB1), del 17p13 (TP53), t (4;14) (IGH / FGFR3), t (11;14) (IGH / MYEOV), t (14; 16) (IGH / MAF), t (14: 20) (IGH / MAFB), 1q21 (CKS1B) kazanç / amplifikasyon ve 1p (CDKN2C) delesyonu bulunur.
MM hastalarının ilk değerlendirmesine standart metafaz sitogenetiği dahil edilmelidir. Geleneksel G bantlı karyotipleme, tüm kromozom analizinin faydasını sunsa da, bu yöntemin düşük verimi birçok yanlış negatif sonuca yol açar2. Geleneksel olarak, PC'ler B lenfosit farklılaşmasının son aşama ürünleri oldukları için büyük ölçüde bölünemez olarak görülmüştür. Bu, bölünmüş görüntüler elde etmeyi zorlaştırır. Uzun süreli kültürlerle (6 gün) MM'de geliştirilmiş sitogenetik analiz ve kültürlerin sitokinlerle uyarılması, yeni tanı konmuş MM hastalarında sitogenetik anormallikleri tanımlamak için umut verici bir yöntem olabilir3. Bununla birlikte, kültür süresi 6 güne uzatıldığında bile, MM hastalarının %30-%50'sinde sitogenetik anormallikler doğru bir şekilde bildirilmiştir4. Ayrıca, MM, prognostik heterojenliğini yansıtan karmaşık sitogenetik anormalliklerle karakterizedir. Bununla birlikte, geleneksel kromozom bantlama teknolojisinin çözünürlüğü düşüktür, bu da MM'de kromozomal anormalliklerin kolayca tespit edilmesine yol açabilir.
İnterfaz FISH, tercihen CD138-pozitif manyetik boncuk bazlı PC sıralama veya sitoplazmik immünoglobulin hafif zincir κ / λ ile işaretlemeden sonra, MM5,6 analizinde vazgeçilmezdir. CD138 pozitif seçilmiş bir örnek, tümör hücrelerinin optimize edilmiş verimi için şiddetle tavsiye edilir. Bununla birlikte, sitogenetik anormalliklerin doğru kantitasyonu, PC sıralaması için en az 4 mL antikoagüle BM gerektirir. Ek olarak, CD138 immünomanyetik boncuk ayıklama ile FISH veya FISH testi (cIg-FISH) ile sitoplazmik κ / λ hafif zincirli immünoglobulin kombinasyonları çok sayıda deneysel maliyeti arttırır ve zaman alıcıdır.
Genellikle PK oranı ilk olarak boyalı BM yaymalarının veya BM biyopsi kesitlerinin morfolojik incelemesinden değerlendirilir7,8. Morfolojik testler için en yüksek kalitede BM örnekleri (ilk kemik iliği aspirat örnekleri) kullanılırken, FISH veya başka bir tespit için gönderilenler genellikle periferik kanla yüksek oranda seyreltme oranına sahip ikincil aspirat örnekleridir.
1990'lı yılların başlarında, birçok çalışma, BM yaymalarının güvenilir ve tekrarlanabilir bir yöntem olduğu kanıtlanmış olan interstisyel FISH muayeneleri için doğrudan kullanılabileceğini göstermiştir9. Periferik kan ve BM yaymalarının FISH ile kombine edilmiş hücre morfolojisi ve esteraz sitokimyasına dayanan zarif bir çalışma, granülositik ve lenfositik lösemili hastalarda kromozomal anormallikleri aydınlatmak için büyük klinik önemini doğrulamıştır10.
Burada, MM hastalarında interfaz FISH tespitinin başarısını artırmak için yeni bir yöntem sunuyoruz.

<table><tbody><tr><td>otomatik BALIK makinesi</td><td>Leica&nbsp; Şirket</td><td>S500-24</td><td>FİNAL Takma Termobrite 240V</td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Abbott Moleküler A.Ş.</td><td>06J49-001</td><td>DAPI Counterstain</td></tr><tr><td>FISH Analiz Yazılımı</td><td>IMSTAR&nbsp; Şirket</td><td>: IMSTAR</td><td>FISH Analiz Yazılımı</td></tr>, <tr><td>FISH Probu,</td><td>Abbott Moleküler A.Ş.</td><td>05N56-020</td><td>Vysis Locus Özel Tanımlayıcı TP53 / CEP 17 BALIK Prob Kiti</td></tr><tr><td>Sabit hacimli pipet</td><td>Eppendorf China Ltd.</td><td>M33768H</td><td>10&nbsp; mikrolitre</td></tr><tr><td>Floresan Mikroskobu</td><td>Olympus Corporation</td><td>BX53</td><td>İleri Floresan Mikroskobu</td></tr><tr><td>Karyotip Analiz Yazılımı</td><td>IMSTAR&nbsp; Corporation</td><td>IMSTAR</td><td>Karyotip Analiz</td></tr><tr><td>Yazılımı Işık Mikroskobu</td><td>Olympus&nbsp; Corporation</td><td>BX41</td><td>İleri Işık Mikroskobu</td></tr><tr><td>NP-40</td><td>Abbott Moleküler A.Ş.</td><td>07J05-001</td><td>NP-40</td></tr><tr><td>Plastik boyama boyama rafı</td><td>Guangzhou Kaixiu Trading Co., Ltd.</td><td>RSJ-501</td> <td>ve nbsp; 24 slayt</td></tr><tr><td>Plastik boyama boyama tankı</td><td>Guangzhou Kaixiu Trading Co., Ltd.</td><td>RSJ-516</td><td>&nbsp; 24 kaydırak</td></tr><tr><td>Kauçuk Çimento</td><td>Marabu&nbsp; GmbH & ve Tic. A.Ş. KG</td><td>FixoGum&nbsp;</td><td>Kauçuk Çimento</td></tr><tr><td>SSC</td><td>Abbott Moleküler A.Ş.</td><td>02J10-032</td><td>20 kez; SSC</td></tr><tr><td>Su banyosu</td><td>Shanghai Boxun Medical Bio-Instrument Co., Ltd.</td><td>DK-8D</td><td>Çoklu Sıcaklık Su banyosu</td></tr></tbody></table>

İnfaz floresan in situ multipl miyelomun kemik İliği yaymalarının hibridizasyonu

Interphase Fluorescence in situ Hybridization of Bone Marrow Smears of Multiple Myeloma

Floresan in situ hibridizasyon (FISH) tespiti, en sık görülen hematolojik malignitelerden biri olan multipl miyelomda (MM) genetik risk sınıflamasında vazgeçilmez bir yöntemdir. MM'nin tanımlayıcı özelliği, kemik iliğinde biriken malign plazma hücreleridir. MM için FISH raporları, anti-CD138 manyetik boncuklarla sıralayarak veya sitoplazmik immünoglobulin hafif zincir κ veya λ ile işaretleyerek tüm çekirdekli hücrelerden ziyade saflaştırılmış veya tanımlanmış klonal plazma hücrelerine odaklanır. Kemik iliği interfaz çekirdekleri genellikle taze kemik iliği hücrelerinden elde edilir. Bununla birlikte, plazma hücresi örneklerinin tatmin edici bir şekilde zenginleştirilmesi, zor kemik iliği ekstraksiyonu veya kemik iliği kuru musluğu durumunda elde edilemeyen büyük miktarda taze heparin anti-pıhtılaşmış kemik iliği gerektirir. Bu yazıda, lekeli veya lekesiz kemik iliği yaymalarında FISH tespitinin başarısını artırmak için yeni bir yöntem oluşturduk. Kemik iliği yaymalarının elde edilmesi, antikoagüle kemik iliği örneklerinden daha kolaydır.

Yeni tanı konmuş bir MM hastasının ilk morfolojik değerlendirmesinde, BM yaymasındaki PC'lerin% 15'inin normal PC'lerden daha büyük miktarlarda sitoplazma ile birlikte daha büyük ve daha koyu çekirdeklere sahip olduğu bulunmuştur (Şekil 2A). İmmünofenotip tekniği ile tespit edilen ilk heparin anti-pıhtılaşmış BM tüpü, monoklonal anormal PC'lerin sadece% 2.3'ünü ortaya çıkardı. CD138 immünomanyetik boncuk sıralama, FISH veya cIg-FISH tekniği ile kombinasyon halinde doğru bir FISH sonucu elde ...

Burada, multipl miyelom hastalarından alınan kemik iliği yaymalarında interfaz floresan in situ hibridizasyon tespitinin başarısını artırmak için bir protokol sunuyoruz.

İnfaz Floresan in situ Multipl Miyelomun Kemik İliği Yaymalarının Hibridizasyonu

Fluorescence in situ hybridization (FISH) detection is an indispensable method in genetic risk stratification in multiple myeloma (MM), which is one of ...

Multipl miyelomda genetik risk tabakalaşmasına FISH adı verilen Floresan In Situ Hibridizasyonun uygulanması esastır. FISH raporlarının kritik kısmı, tüm çekirdekli hücreler değil, anti-CD138 manyetik boncuklarla sıralanarak veya sitoplazmik kappa veya cIg FISH adı verilen FISH testi ile Lambda hafif zincirli immünoglobulin ile işaretlenerek spesifik olarak saflaştırılmış veya tanımlanmış klonal plazma hücreleridir. Plazma hücresi sıralamasından sonra interfaze FISH veya cIg FISH, kemik iliğindeki plazma hücrelerinin nispeten daha düşük oranı nedeniyle multipl miyelom tanısında önemli olduğu ortaya çıkmaktadır.Bununla birlikte, bu yöntemlerin karmaşık süreçler, yüksek numune talepleri ve yüksek deney maliyetleri gibi bazı eksiklikleri vardır. Plazma hücreleri hızlı bir şekilde kemik iliği yaymasına yerleştirilebilir. Buna dayanarak, multipl miyelom hücrelerinin tespiti için kemik iliği yayma FISH kullanıyoruz.Bu çalışma, Helsinki Deklarasyonu'nun ilkelerine göre yürütülmüş ve Wuhan Üniversitesi Zhongnan Hastanesi Etik Komitesi tarafından onaylanmıştır. Örnekler, Çin Wuhan Üniversitesi Zhongnan Hastanesi Hematoloji Bölümü'ndeki multipl miyelom hastasından toplandı. İlk 0.2 mililitre kemik iliği solüsyonunu temiz bir tek kullanımlık cam kızağa yerleştirin, kemik iliğini hızlı bir şekilde çıkararak kemik iliği lekelerini eşit kalınlığa ve keskin kuyruklara yayın, ardından doğal olarak kurutun.Kemik iliği filmlerini oda sıcaklığında yaklaşık 10 saniye boyunca bir mililitre Wright-Giemsa çözeltisi ile örtün. Slaytlara bir mililitre fosfat tamponu ekleyin, boya çözeltisinin kurumasını veya slaytlardan akmasını önlemek için özen gösterildi. Boya çözeltisini nazikçe karıştırın ve oda sıcaklığında 15 dakika bekletin.Slaytları temiz suyla durulayın ve oda sıcaklığında havada kurulayın. Kötü huylu plazma hücrelerini tespit etmek için ileri ışık mikroskobu kullanın, plazma hücreleri iyi dağılmış olmalıdır. Şimdi sahada gördüğümüz şey, oldukça dağılmış plazma hücreleridir.Bu tipik bir Binükleer nükleer plazma hücresidir. Plazma hücrelerinin rengini değiştirmek ve sabitlemek için hibridize alanı 10 dakika boyunca fiksatif çözelti ile örtün. Slaytı deiyonize suyla durulayın ve oda sıcaklığında havada kurutun.İki kez SSC tamponu içeren bir kavanozu bir su banyosunda 56 santigrat dereceye kadar önceden ısıtın. Hazırlanan kemik iliği yaymasını önceden ısıtılmış iki kez SSC tamponunda 10 dakika boyunca yıkayın, ardından oda sıcaklığında deiyonize suya batırın. Yaymayı bir dakika boyunca her biri% 70% 85 ve% 100 etanol gradyanında dehidre edin.Bulaşmayı 10 dakika boyunca havada kurutun. İlk önce hibridizasyon alanına kromozom 17 prob karışımının sentromerine TP53 ekleyin ve alttan hava kabarcıklarını gidermek için ince sivri cımbızlara hafifçe bastıran bir kapak kayması ile örtün. İyi bir sızdırmazlık sağlamak için kapak kaymasının her tarafını kauçuk çimento ile kapatın.Kauçuk çimentonun katılaşmasından sonra, kızak otomatik bir FISH makinesine yerleştirildi ve beş dakika boyunca 78 santigrat derecede denatürasyon yapıldı ve ardından gece boyunca 37 santigrat derecede hibridizasyon yapıldı. Slaytı FISH makinesinden alın. Kauçuk çimentoyu nazikçe çıkarmak için ince sivri uçlu cımbız kullanın.Kapak kaymasını yıkamak için slaytı oda sıcaklığında iki kez SSC'ye yaklaşık bir veya iki dakika batırın. Slaytı 68 santigrat derece ön ısıtma tamponunda iki dakika boyunca bir su banyosunda yıkayın. Slaytları iki kez SSC ile 37 santigrat derece su banyosunda bir dakika boyunca yıkayın.Hibridize alana 10 mikrolitre DAPI'de 10 dakika boyunca iyice kuruması için karanlıkta ayarlayın, bir kapak kayması ile örtün. Bir floresan mikroskobunda uygun bir filtre seti kullanarak hibridize edilmiş slaytı görüntüleyin, hücre çekirdeğinin floresan yoğunluğunu gözlemlemek için tek renkli mavi florofor optik filtre kullanın. Hücre çekirdeği görüntülerini bir DAPI filtre kümesi altında alın.CEP17 yeşil floresan ile etiketlendi. CEP17'nin yerini gözlemlemek için spektrum yeşil florofor optik filtre kullanın. CEP17 sinyal görüntüsünü yeşil filtre seti altında alın.TP53 geni turuncu floresan ile etiketlendi. TP53'ü gözlemlemek için spektrum turuncu florofor optik filtresini kullanın, setin altındaki TP53 sinyal görüntüsünü alın, bu üç görüntüyü bir bütün halinde birleştirin ve sayısal anormallikleri inceleyin. Normal bir fazlar arası hücrede, bir çift normal kromozomu gösteren mavi floresanlı bir çekirdeğin içinde iki turuncu ve iki yeşil sinyal gözlenir 17.Sonuçlar, multipl miyelom hastasında kemik iliğinin morfolojisini ve genetiğini gösterdi. Şekil A, kemik iliği yaymasındaki plazma hücrelerinin% 15'inin normalden daha büyük miktarda sitoplazma ile birlikte daha büyük, daha koyu ve nükleere sahip olduğunu göstermiştir. Şekil B, bir kemik iliği yaymasında çekirdekli bir plazma hücresi tarafından temsil edilen gri skala görüntüsünü göstermiştir.Şekil C, plazma hücresinin bir interfaz çekirdeğinde dört turuncu ve dört yeşil sinyal gösterdi ve bu da kromozom 17'nin dört kopyasının bir çekirdekte lokalize olduğunu düşündürdü. Şekil D, bu hastanın anormal kromozom karyogramının bir çekirdekte iki çift kromozom 17'yi doğruladığını göstermiştir. Kemik iliği yaymalarının elde edilmesi, antikoagülan kemik iliği örneklerinden çok daha kolaydır, çünkü antikoagüle kemik iliği elde etmek, çekirdeği elde etmek için karmaşık prosedürler gerektirir.Bu doğrultuda multipl miyelom hücrelerinin tespiti için kemik iliği yayma FISH için ikna edici bir yöntem oluşturduk.

interphase-fluorescence-situ-hybridization-bone-marrow-smears

Research

JoVE Journal

Medicine

Tıp

Bu videoda, iliak omurgadan kemik iliği aspire etme tekniği ve biyopsi için smear hazırlığı anlatılmaktadır. Örnekte, akut miyeloid lösemi (AML) hastasından kemik iliği aspirasyonu gerçekleştiriyoruz ve önemli bir prognostik biyobelirteç olan ölçülebilir rezidüel hastalığı (MRD) kontrol etmek için hücreleri inceliyoruz.

Kemik İliği Aspirasyonu: Hücre Morfolojisini İncelemek İçin Kemik İliği Elde Etme Yöntemi

Kompleks doku kitleleri, organlardan tümörler, çeşitli hücresel elemanların oluşmaktadır. Bu hücre köken hem de protein ekspresyonu göre hücre özelliklerini deşifre spektral unmixing ardından çok parametreli immünofloresan boyama ile bir arada çok etiketli floresan transgenik fareler kullanılarak bir doku içinde hücre fenotipleri katkısını açıklanacaktır.

Hücre Origins, Türleri ve Etkileşimler Görselleştirme için Floresan Doku Nakli ardından Kantitatif Çokspektrumlu Analizi

Kemik iliğindeki histolojik verileri kantitatif olarak analiz etmek için bir strateji sunulmuştur. Doku kesitlerindeki floresan etiketli hücrelerin konfokal mikroskobu, otomatik olarak analiz edilen 2 boyutlu görüntülerle sonuçlanır. Farklı hücre tiplerinin birlikte lokalizasyon analizleri, simüle edilmiş görüntülerden elde edilen verilerle karşılaştırılarak hücresel etkileşimler hakkında nicel bilgiler verilir.

Hematopoetik Hücre Otomatik Ölçümü - undekalsifiye Kemik histolojik Görüntüler stromal hücre etkileşimleri

Primer multipl miyelom hücreleri için yüksek verimli bir ilaç duyarlılık testi tanımlıyoruz. Çok kuyulu plakalarda kemik iliği mikro çevresinin (hücre dışı matriks ve stroma dahil) yeniden yapılandırılmasından ve hücre canlılığının uzunlamasına ölçülmesi için invaziv olmayan bir yöntemden oluşur.

Primer Multipl Miyelom Hücrelerinin İlaç Duyarlılık Karakterizasyonu için bir Organotipik Yüksek Verimli Sistemi

İntravital Floresans mikroskobu (IVFM) hasta, posta ve kemik iliği (BM) niş içine hematopoetik hücrelerin engraftment çalışmaya genetik hayvan modelleri ile birlikte uygulanır.

Intravital floresan mikroskobu (IVFM) kemik iliği nişler hematopoetik hücrelerin Engraftment Dynamics çalışmaya genetik modelleri ile birleştirerek

Mevcut protokol, toplam vücut ışınlamasına maruz kaldıktan sonra farelerin kemik iliği hücrelerindeki kromozomal stabil anormallikleri tanımlamada çoklu floresan in situ hibridizasyon (mFISH) ve spektral karyotiplemenin (SKY) yararlılığını açıklamaktadır.

Çoklu Floresan Inter-kromozomal Kararlı sapmaları Algılama<em&gt; In Situ</em&gt; Hibridizasyon (mFISH) ve ışınlanmış Farelerde Spektral Karyotipik (SKY)

En küçük veya ölçülebilir rezidüel hastalığı (MRD) tespiti risk değerlendirme rafine ve Relaps Akut Miyeloid Lösemi (AML) içinde tahmin için önemli bir prognostik biyomarker olduğunu. Bu sõnõrlar ve önerileri ile tutarlı ve doğru kimlik ve MRD, tespiti için en iyi yöntemler yardımcı etkili AML tedavi karar verme.

Örnek ve işlem kemik iliği ölçülebilir artık hastalık ve akut Myeloid lösemi lösemik kök hücre ölçmek için kapsamlı iletişim kuralı

Burada tarif biz multiplex floresan immunohistokimyasal boyama ve lenfoma içinde birden fazla kanser ilişkili antijenleri eş zamanlı yerelleştirme için görüntüleme için bir iletişim kuralı. Bu iletişim kuralı tüm doku bölümleri içinde biyolojik colocalization analizine genişletilebilir.

Çoğaltılmış floresan immunohistokimyasal boyama, görüntüleme ve analiz lenfoma histolojik örneklerinde

Burada, miyelodisplastik sendromlar ve akut miyeloid löseminin murin modellerinden kemik iliği mikroçevre popülasyonlarını izole etmek ve karakterize etmek için ayrıntılı bir protokol sunulmaktadır. Bu teknik, endotelyal ve mezenkimal stromal hücreler dahil olmak üzere hematopoietik olmayan kemik iliği nişindeki değişiklikleri hastalık ilerlemesi ile tanımlar.

Miyelodisplastik Sendrom ve Akut Miyeloid Lösemide Kemik İliği Mikroçevresel Popülasyonlarının Belirlenmesi

Burada, farelere ksenogreftlenmiş ve kemik iliği aspiratlarından elde edilen akut insan miyeloid lösemi hücrelerinde mTORC1, JAK/STAT5 ve MAPK yollarının aşağı akışındaki sinyalleri analiz etmek için fosfoflow sitometri tabanlı bir yöntem açıklanmaktadır. p-STAT5, p-4EBP1, p-RPS6 ve p-ERK1/2 seviyeleri, yüksek duyarlılığa sahip yeni nesil spektral akış sitometresi kullanılarak eş zamanlı olarak ölçülür.

Akut Miyeloid Lösemi Hasta Kaynaklı Ksenotransplantların Hücre İçi Fosfoflow Sitometrisi

Öğrenin multipl miyelom tanısında kemik iliği yaymaları üzerinde interfaz FISH protokolünü. Bu yöntem, klonal plazma hücrelerinin hızlı tespitini sağlayarak maliyetleri düşürür ve tanı doğruluğunu artırır.

İnfaz Floresan in situ Multipl Miyelomun Kemik İliği Yaymalarının Hibridizasyonu

Daha fazla video keşfet