SNARE Kaçakçılığı kullanarak Geri Dönüşüm Endozomlarını İncelemek ve Analiz Etmek için Mikroskopi Tabanlı Tahlil
12 Şubat 2022
Geri dönüşüm endozomları endosomal tübüler ağın bir parçasıdır. Burada, GFP-STX13'i organel işaretleyici olarak kullanarak geri dönüşüm endozomlarının dinamiklerini ölçmek için bir yöntem sunuyoruz.
SNARE kaçakçılığı kullanarak geri dönüşüm endozomlarını incelemek ve analiz etmek için mikroskopi bazlı tahlil. Bunlar deri melanositler. Hücrelerin içinde gördüğünüz siyah renkli organellere melanozom denir.
Melanozomlar lizozom ile ilgili organeller veya LRO adı verilen bir organel sınıfı olarak bilinir. Geri dönüşüm endozomları erkenden tübüler veziküler organellerdir veya tüm hücre tiplerinde endozomları sıralarlar. Bu organeller, melanositler tarafından üretilen lizozomla ilgili bir organel olan melanozomların biyogenezinde önemli bir rol oynar.
Geri dönüşüm endozomları, oluşumları sırasında melanosit spesifik kargoyu prematüre melanozomlara ulaştırıyor. çeşitli sendromlarda gözlenen geri dönüşüm endozomlarının üretimi cilt, saç ve gözün hiperpigmentasyonundaki hücrelerdir. Bu nedenle, geri dönüşüm endozomlarının dinamiklerini incelemek, bu organellerin normal ve hastalık koşullarındaki işlevini anlamak için yararlıdır.
Bu çalışma, SNARE sözdizimini-13'ün tutuklanmasını kullanarak geri dönüşüm endozomlarının dinamiklerini ölçmeyi amaçlamaktadır. İlk adım, önceden işlenmiş kapak örtülerinde fare melanositlerinin tohumlaşılmasıdır. Cam kapakları Petri kabında bodrum membran matris ortamında kaplayın.
Ve doku kültürü kaputunda 15 dakika kurutun. Kullanmadan önce kapakları 1X PBS ile bir kez yıkayın. Bodrum membran orta kaplamalı kapaklardaki hücreleri% 50 ila 60 yetkinlikte tohumla.
Tam RPMI ortamlarında kaplamalı hücre süspansiyonu için her zaman 200 nanomolar PMA ekleyin. Hücreleri tohumladıktan sonra, CO2 inkübatörde hücre içeren kabı 12 ila 24 saat kuluçkaya yatırın. İkinci adım, hücrelerin sözdizimi-13 plazmidlerle transfeksiyondur.
DNA ve transfeksiyon reaktifi içeren uçları kuluçkaya yatırın, beş dakika karıştırın ve tekrarlanan pipetleme olmadan karıştırın. Oda sıcaklığında 30 dakika boyunca her on dakikada bir elinizle tüpe dokunun. Kuluçka sırasında, hücreleri 1X PBS ile iki kez, opti-MEM ile bir kez yıkayın ve ardından hücrelere 1 mil OPTI-MEM ekleyin.
30 dakikalık inkübasyon sonrası, transfeksiyon reaktif DNA karışımını yemeği kapatarak damla gibi hücrelere ekleyin. Hücreleri 37 santigrat derecede altı saat kuluçkaya yatır. OPTI-MEM ortamını transfeksiyon reaktifi ile epire edin ve 200 nanomolar PMA ile desteklenmiş eksiksiz RPMI ortamı ekleyin.
Hücreleri 48 saat boyunca 37 santigrat derecede kuluçkaya yatır. Üçüncü adım hücrelerin sabitlenmesidir. Aşağıdaki işlemin doku kültürü başlığı dışında yapıldığını lütfen unutmayın.
48 saatlik transfeksiyondan sonra, hücreleri 1X PBS ile iki kez yıkayın ve ardından hücreleri 30 dakika boyunca% 3 formaldehit ile sabitleyin. Sabitlemeden sonra, hücreleri 1X PBS ile iki kez yıkayın ve kapakları bir sonraki kullanıma kadar 1X PBS'de saklayın. Alternatif olarak, hücreler cam plakalara monte edilebilir veya dört santigrat derecede saklanabilir.
Dördüncü adım hücrelerin immün yetimidir. Nemli bir oda hazırlayın. Parafilm kesim parçasını petri kabındaki fare filtresi kağıdına yerleştirin.
Alüminyum folyo ile örtün. 25 mikrolitre birincil antikor çözeltisi hazırlayın. Bir ila 200 seyreltmede antikor ekleyin.
Bu çözeltiyi nemli haznedeki parafilme bir damla olarak ekleyin. Kapak kapağını dikps ile dikkatlice kaldırın. Birincil antikor boyama çözeltisinin damlasında ters çevirin ve ardından nemli odanın kapağını kapatın.
Oda sıcaklığında 30 dakika kuluçkaya yatır. Benzer şekilde, ikincil antikor çözeltisini bir ila 500 seyreltmede hazırlayın ve nemli haznedeki kapak zarının yanındaki parafilme yerleştirin. Çekirdeği boyamak için, çözeltiye 120, 000 ila 130,000 seyreltmede DAPI ekleyin.
Forseps kullanarak, kapak kapağını birincil antikor çözeltisinden dikkatlice alın ve 1X PBS'de iki kez batırın. Kapak üzerindeki fazla PBS'yi çıkarmak için kağıt mendil üzerindeki kapak kılıfı'na dokunun. Nemli haznedeki ikincil antikor boyama çözeltisine yerleştirin ve çözeltide floresan boyalı antikorların varlığı nedeniyle ışığa maruz bırakmayın.
Kuluçkadan sonra, kapak kapağını ikincil antikor çözeltisinden dikkatlice alın ve ardından 1X PBS'de iki kez batırın. Ayrıca, kapak üzerindeki fazla PBS'yi çıkarmak için kağıt mendil üzerindeki kapak kılıfı'na dokunun. Cam bir kaydırağa 12 mikrolitre görüntüleme reaktifi yerleştirin ve lekeli kapak kapağını montaj reaktifine dikkatlice yerleştirin.
Kağıt mendil üzerindeki cam kaydırağı ters çevirin ve ardından hafifçe bastırın. Ardından, kapak kapağını floresan mikroskop kullanarak görüntüleyin ve ImageJ kullanarak görüntüleri analiz edin. Altıncı adım, geri dönüşüm endozom lokalize proteinleri ve melanozomlar arasındaki örtüşın nicelemesidir.
Melanozomlarla sözdizimi-13 delta-129 kolokalizasyonunun ölçülmesi. Fare vahşi tip melanositlerinde sözdizimi-13 immünoforezans mikroskopisi, veziküler ve tübüler yapılar olarak lokalize GFP-sözdizimi-13 vahşi tip gösterdi. Ve GFP-sözdizimi-13 delta-129, hücre yüzeyine ek olarak halka benzeri yapıları lokalize eder.
Ayrıca hücre içi halka benzeri GFP-sözdizimi-13 delta-129 parlak alan görüntülü melanozomlarda melanozom proteini TYRP1 ile kolokalizasyon gösterdi. Daha önce de gösterildiği gibi, melanozomlarda aşırı ifade edilmiş GFP-sözdizimi-13 vahşi tip bir kohort gözlenir. GFP-sözdizimi-13 vahşi tipinin ve GFP-sözdizimi-13 delta-129'un melanozomlara göreli lokalizasyonunu ölçmek için Fiji yazılımı kullanıldı ve JACOP eklentisi ile analiz yapıldı.
TYRP1 ile GFP-sözdizimi-13 delta-129 arasındaki ölçülen Mander'in örtüşme katsayısı, yani MOC, TYRP1 ile GFP-sözdizimi-13 vahşi türüne kıyasla yaklaşık 1,5 kat daha yüksektir. İlginçtir ki, TYRP1 GFP-sözdizimi-13 delta-129 ile GFP-sözdizimi-13 vahşi türüne kıyasla 2,9 kat daha yüksek MOC değerleri gösterdi. Bu veriler, GFP-sözdizimi-13 delta-129 melanozomlarının lokalizasyonunun, sabit durumdaki GFP-sözdizimi-13 vahşi türüne kıyasla nispeten daha yüksek olduğunu göstermektedir.
Geri dönüşüm endozomlarının sözdizimi-13 vahşi tip lokalizasyonunun nicelleştirilmesi. GFP-sözdizimi-13 vahşi tipinde immünoforezans mikroskopisi bilinen geri dönüşüm endosomal proteini Rab11 ile kolokalizasyon gösterdi. mCherry-Rab11 ile GFP-sözdizimi-13 vahşi tipi arasındaki MOC, GFP-sözdizimi-13 vahşi tipine sahip mCherry-Rab11'e kıyasla yaklaşık 1,4 kat daha yüksektir.
GFP-sözdizimi-13 vahşi tip pozitif endosomal tübüllerin sayısını ve uzunluğunu ölçmek için, protokol bölümünde açıklandığı gibi Fiji yazılımı kullanılmıştır. mCherry-Rab11 deneylerde pozitif bir kontrol kullanılır. GFP-sözdizimi-13 vahşi tipi ile trans enfekte olan melanositler, mCherry-Rab11'i ifade eden hücrelere kıyasla hücre başına daha yüksek sayıda tübül gösterdi.
Bununla birlikte, tübüller hem GFP-sözdizimi-13 vahşi tipinin hem de hücrelerde mCherry-Rab11'in birlikte ifadelanmasıyla azalır. Yedinci adım, geri dönüşüm endozomlarının borulu sayısı ve uzunluğunun ölçülmesidir. Tübüller, hücrelerde hem GFP-sözdizimi-13 vahşi tipinin hem de mCherry-Rab11'in birlikte ifadelenmesiyle azalır.
İlginçtir ki, hem GFP-sözdizimi-13 vahşi türünden hem de mCherry-Rab11'den ortalama tübül uzunluğu, ayrı ayrı veya birlikte ifade eden hücrelerde birbiriyle karşılaştırılabilir. Birlikte, bu veriler GFP-sözdizimi-13 vahşi türünün Rab11'e benzer şekilde geri dönüşüm endozomlarına yerelleşerek yerelleştirdiğini göstermektedir. Bu çalışma, GFP-sözdizimi-13 delta-129 olan sözdizimi-13 mutantının N-terminal teslimatının, GFP-sözdizimi-13 delta-129 melanozomlarına lokalize olduğunu, muhtemelen geri dönüşüm endozomlarından hücre yüzeyine ve LRO'ya ve LRO'ya veziküler kaçakçılığın muhabiri olarak kullanılabileceğini göstermiştir.
Buna karşılık, GFP-sözdizimi-13 vahşi türü, endozomların Rab11'e benzer şekilde geri dönüştürülmesini yerelleştirir. Bu çalışma, GFP-sözdizimi-13 vahşi tipinin melanositlerde geri dönüşüm endozomlarını işaretlemek için de kullanılabileceğini göstermektedir. GFP-sözdizimi-13 vahşi türü, Rab11 endosomal dinamikleri değiştirdiğinden, Rab11'den daha iyi bir geri dönüşüm endosomal işaretleyici olabilir.
GFP-syntaxin-13 vahşi tipi, dinamikleri sabit durum koşullarında incelemek için potansiyel bir geri dönüşüm endosomal işaretleyicisi görevi görür.
Tam transkripti görüntüleyin ve binlerce bilimsel videoya erişin
Genel Bakış
Bu çalışma, cilt melanositlerinde GFP-STX13'ü bir marker olarak kullanarak reçine endosomlarının dinamiğini araştırmaktadır. Araştırma, reçine endosomlarının melanozomların biyogenezindeki rolüne, normal fizyolojik işlevlere ve hiperpigmentasyon gibi durumlardaki etkilerine odaklanmaktadır.
Çalışmanın Temel Bileşenleri
Araştırma Alanı
- Hücre biyolojisi
- Endozomal trafik
- Melanosit biyolojisi
Arka Plan
- Reçine endosomları, çeşitli hücre tiplerinde hücresel işlevler için esastır.
- Melanozomlar, melanositlerdeki reçine endosomlarından türetilen özel organellerdir.
- Reçine endozom dinamiklerinin anlaşılması, pigmentasyon bozuklukları hakkındaki bilgiler için kritik öneme sahiptir.
Kullanılan Yöntemler
- Endozomal dinamikleri görselleştirmek için immünofloresan mikroskopi.
- Biyolojik model sistemi olarak fare melanositler.
- Protein lokalizasyonunu analiz etmek için nicel görüntüleme teknikleri.
Ana Sonuçlar
- GFP-STX13'ün melanozomlar ve reçine endozomal markerleri ile ko-lokalizasyonunun gösterilmesi.
- Yabani tip ve mutant syntaxin-13 arasındaki farklı lokalizasyon dinamiklerinin gösterilmesi.
- Endosom ile ilgili proteinler arasındaki örtüşmenin nicel ölçümlerinin sağlanması.
Sonuçlar
- Çalışma, melanositlerde reçine endosomlarının karmaşık dinamiklerini gösterir.
- Bulgularla cilt pigmentasyonu ve ilgili bozukluklarda organel işlevinin anlaşılmasına katkıda bulunmaktadır.
Sıkça Sorulan Sorular
Executive Industry Relevance
This microscopy-based assay enables quantitative analysis of recycling endosome dynamics in melanocytes, providing a mechanistic tool to study organelle trafficking relevant to pigmentation disorders. By leveraging SNARE protein trafficking as a readout, the method supports target validation in lysosomal-related organelle biogenesis pathways. The assay generates reproducible imaging data that can inform early discovery decisions regarding endosomal trafficking modifiers.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of SNARE-mediated trafficking hypotheses in recycling endosome to melanosome transport.
- Operational Value: Provides a standardized imaging workflow to assess protein localization dynamics in live-cell models.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates quantitative colocalization metrics (Mander's overlap coefficient) to compare wild-type and mutant syntaxin-13 trafficking patterns.
- Operational Value: Establishes a reproducible fluorescence microscopy protocol for measuring endosomal tubule number and length.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Links recycling endosome dysfunction to hypopigmentation phenotypes observed in Hermansky-Pudlak syndrome models.
- Operational Value: Offers a disease-relevant system to evaluate trafficking modifiers that influence melanosome biogenesis.
Pipeline & Workflow Integration
The assay fits within early discovery workflows where endosomal trafficking mechanisms are probed for target validation and pathway clarification prior to assay development.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing of SNARE protein roles in organelle-specific cargo delivery.
- Screening: Delivers quantitative imaging outputs enabling comparison of trafficking conditions across genetic or pharmacological perturbations.
- Analytics: Provides Mander's overlap coefficient and tubule morphometry as measurable endpoints for trafficking efficiency.
- Translational Research: Connects endosomal dynamics to melanosome biogenesis, a process relevant to pigment-related disorders.
- Enterprise Reuse: The imaging and quantification approach can be adapted to other SNARE proteins or organelle trafficking studies.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Enhances predictive confidence in targeting endosomal trafficking nodes by visualizing flux between recycling endosomes and lysosome-related organelles.
- Operational Value: Standardizes fixation, immunostaining, and imaging protocols for consistent subcellular localization analysis.
- Strategic Value: Enables go/no-go decisions on trafficking targets based on quantitative colocalization and structural changes.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization of modifiers affecting organelle biogenesis pathways.
Implementation Considerations
- Requires expertise in immunofluorescence microscopy and quantitative image analysis using Fiji/JACOP.
- Depends on fluorescence microscopy infrastructure and compatible antibody reagents for SNARE and organelle markers.
- Necessitates standardization across cell seeding, transfection, and fixation timing for reproducible tubule quantification.
- Adaptation to other cell types may require optimization of basement membrane coating and PMA supplementation.
- Practical limitations include dependence on overexpression systems which may alter endogenous trafficking dynamics.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:06
Introduction
1:04
Seeding of Mouse Melanocytes on Pre-Treated Coverslips
1:42
Transfection of Cells with the STX13 Plasmids
2:39
Fixation of the Cells
3:11
Immunostaining of the Cells
5:05
Results: Quantification of Overlap Between the RE Localized Proteins and Melanosomes
7:25
Results: Quantification of Recycling Endosomes' Tublar Number and Length
7:56
Conclusion
