Kemirgenlerin Kafalarında Tanımlanmış İvmelenmeler Oluşturmak için Pasif Kafa Hareketinin Uygulanması
21 Temmuz 2022
Mevcut protokol, orta hızlarda çalışan koşu bandı sırasında üretilen kemirgenlerin kafalarında mekanik ivmelenmeleri yeniden üreten özel olarak tasarlanmış bir "pasif kafa hareketi" sistemini tanımlamaktadır. Mekanik faktörlerin / elementlerin fiziksel egzersizin faydalı etkilerinden diseksiyonuna izin verir.
Protokolümüz, fiziksel egzersizin organizma homeostazını nasıl desteklediği sorularını cevaplamaya yardımcı olur. Sistemler, beyin üzerindeki doğrudan mekanik etkileri, yürüyüş ve koşu gibi fiziksel aktivitelerin karmaşık sonuçlarından ayırmamıza izin verdi. Başlamak için, ivmeölçeri cerrahi bant kullanarak bir sıçanın başının üstüne sabitleyin.
Anesteziden tamamen kurtulduktan sonra, sıçanı koşu bandı makinesine yerleştirin. Koşu bandını dakikada 20 metrede orta bir hıza ayarlayın. Sıçan koşu bandını çalıştırırken X, Y ve Z ekseni boyunca dikey ivmelenmelerin büyüklüğünü ölçmek için uygulama yazılımını kullanın.
Yazılımdan elde edilen değerleri, PHM sistemindeki dikey ivme sıklığındaki büyüklükle eşleştirin. Platformun salınım genliğini ve pervane şeklindeki kamın dönme hızını önceden ayarlayın. Ardından, fareyi, kafası salınımlı ve vücudun geri kalanı statik platformlarda olacak şekilde eğilimli bir konuma getirin.
Platformu dikey olarak salınıma sokmak için motoru açın ve fareye PHM uygulayın. Şeffaf plastik kutuda, tüm alanı kaydetmek için video kamerayı 24 FPS kare hızında ayarlayın. Daha sonra, intraperitoneal olarak beş hidroksitriptofanı bir fareye uygulayın.
Fareyi şeffaf kafese yerleştirin ve 30 dakika boyunca kayda başlayın. Kaydedilen videoyu 0,5x hızında inceleyin ve kafa seğirmesini manuel olarak sayın. Fare beyninin kriyoseksiyonlarını slayt kutusundan alın.
Numuneler tamamen kuruyana kadar slaytları oda sıcaklığında temiz mendiller üzerinde bırakın. Kriyoseksiyonlu dokunun etrafına bir daire çizmek için sıvı bloker kalem kullanın. Ardından TBS-T çözümünü ekleyin.
Bir tepsinin altına, slaytlar için nemli bir ortam yaratmak üzere nemlendirilmiş mendiller yerleştirin. TBS-T ile permeablizasyondan sonra, bloke etmek için% 4 eşek serumu ekleyin ve bir saat boyunca oda sıcaklığında inkübe edin. Slaytları beş dakika boyunca TBS-T'ye batırarak bir kez durulayın.
Daha sonra her slayta 100 mikrolitre uygun şekilde seyreltilmiş birincil antikor ve dappy karışımı uygulayın. Tepsiyi örtün ve gece boyunca oda sıcaklığında inkübe edin. Kuluçkadan sonra, TBS-T ile her biri beş dakika boyunca üç kez durulayın.
Uygun şekilde seyreltilmiş türlerin 100 mikrolitresini floresan sekonder antikoru ile eşleştirin ve bir saat boyunca oda sıcaklığında inkübe edin. TBS-T ile her biri beş dakika boyunca üç kez duruladıktan sonra, kızakları montaj ortamıyla monte edin ve slaytları kapak fişleriyle örtün. Montajdan sonra, numuneyi bir floresan mikroskobu altında görüntüleyin.
PHM sistemi, koşu bandı çalışması sırasında sıçanların kafalarına eşdeğer olan yaklaşık 1.0 kat G'de dikey ivme zirveleri üretecek şekilde ayarlandı. Farelere PHM uygulaması, prefrontal korteks nöronlarında PHM'nin 5-HT2A reseptör sinyallemesi üzerindeki baskılayıcı etkisini temsil eden kontrol farelerine kıyasla kafa seğirme tepkisini önemli ölçüde azaltmıştır. PHM'de çalışan koşu bandı, 5-HT2A reseptör içselleştirmesini ve fare prefrontal korteks nöronlarını önemli ölçüde geliştirdi.
İçselleştirilmiş ve membranla ilişkili 5-HT2A reseptör pozitif alanlarının yeni ve pozitif alana göre nicelleştirilmesi bu gözlemi doğruladı. 5-HT2A reseptörü pozitif nöronlarda c-Fos ekspresyonunun immünosstaining ve nicelleştirilmesi, PHM'de çalışan koşu bandının 5-HTP'yi aşağı regüle ettiğini gösterdi. Bu, 5-HT2A reseptör aktivasyonu ve fare PFC nöronlarının aşağı akış hücresel olayıdır.
Egzersiz etkilerinin mekanik yönlerini araştırmak için kafa dışındaki vücut kısımlarına mekanik müdahale uygulanabilir.
Tam transkripti görüntüleyin ve binlerce bilimsel videoya erişin
Genel Bakış
Bu çalışma, yeni geliştirilen bir pasif baş hareket (PHM) sistemi aracılığıyla, fiziksel egzersizin, özellikle koşu bandı koşusunun, organizma homeostazını nasıl etkilediğini araştırmaktadır. Sıçanların maruz kaldığı mekanik ivmelenmeleri simüle eden bu protokol, mekanik faktörleri ve bunların beyin fonksiyonu üzerindeki spesifik etkilerini etkili bir şekilde izole etmektedir.
Çalışmanın Temel Bileşenleri
Araştırma Alanı
- Fiziksel egzersiz ve homeostaz
- Mekanotransdüksiyonun nörobilimi
- Mekanik faktörlerin beyin sinyal yolakları üzerindeki etkisi
Arka Plan
- Fiziksel aktivitenin fizyolojik düzenlemedeki rolü
- Nöronal yanıtlar üzerindeki mekanik etkiler
- Beynin egzersize verdiği yanıtı anlamanın önemi
Kullanılan Yöntemler
- Özel tasarlanmış pasif baş hareketi (PHM) sistemi
- Biyolojik modeller olarak kemirgenler (sıçanlar ve fareler)
- Beyin analizi için floresan boyama ve immünohistokimya
Ana Sonuçlar
- PHM, farelerde baş titreme yanıtlarını önemli ölçüde azaltmıştır
- Prefrontal korteks nöronlarında 5-HT2A reseptörlerinin internalizasyonunun artması
- Mekanik müdahale sonrası c-Fos ekspresyonunun azalması
Sonuçlar
- Çalışma, beyin üzerindeki mekanik etkilerin incelenmesi için geçerli bir yöntem sunmaktadır.
- Bulgular, egzersiz fizyolojisinin ve nöronal sinyalleşmenin daha derinlemesine anlaşılmasına katkıda bulunmaktadır.
Sıkça Sorulan Sorular
Sektörel Uygulama ve Önemi
Egzersizin beyin sinyalizasyonu üzerindeki doğrudan mekanik etkilerini ayrıştırmak, nörobiyolojik hedeflerin riskini azaltmak ve erken keşif aşamasındaki mekanistik hipotezleri netleştirmek için kritiktir. Pasif baş hareketi (PHM) sistemi, kemirgen başlarına tanımlanmış mekanik ivmelerin kontrollü ve tekrarlanabilir bir şekilde uygulanmasını sağlayarak mekanotransdüksiyon çalışmalarında öngörüsel güveni destekler. Bu yetenek, nöropsikiyatrik ve egzersizle ilgili terapötik programlar için hedef doğrulamaya ve translasyonel sürekliliğe temel oluşturur.
Biyofarma Ar-Ge'sinde Stratejik Uygulamalar
Erken Keşif ve Hedef Doğrulama
- Egzersizle tetiklenen beyin homeostazında rol oynayan mekanotransdüksiyon yolaklarının sorgulanmasına olanak tanır.
- Belirli nöronal popülasyonlarda serotonin reseptörü sinyalizasyonunun fonksiyonel validasyonunu destekler.
- Mekanik etkileri sistemik egzersiz etkilerinden izole ederek mekanistik risklerin azaltılmasını kolaylaştırır.
- Yolak aktivasyonu ve reseptör internalizasyonu için kantitatif referans değerler sağlar.
Tarama ve Analiz Geliştirme
- Alt nörofarmakolojik taramalar için valide edilmiş kemirgen modelleri hazırlar.
- Tekrarlanabilir analiz geliştirme için mekanik stimülasyon parametrelerini standartlaştırır.
- Kafa hızlanma profilleri ve reseptör lokalizasyon metrikleri gibi kantitatif çıktılar üretir.
- Mekanosensitif yolaklar üzerindeki bileşik etkilerinin güvenilir şekilde değerlendirilmesini sağlar.
Translasyonel ve Preklinik Araştırmalar
- Preklinik modelleri, insan egzersizinde gözlemlenen hastalıkla ilgili mekanik uyaranlarla uyumlu hale getirir.
- Mekanistik keşiflerden biyobelirteç odaklı preklinik doğrulamaya kadar sürekliliği destekler.
- Nöropsikiyatrik ve egzersiz mimetik adaylarının riskle uyumlu şekilde ilerlemesine bilgi sağlar.
- Mekanotransdüksiyonun translasyonel biyobelirteçlerini değerlendirmek için bir platform sunar.
İş Akışı ve Boru Hattı Entegrasyonu
PHM sistemi, kemirgen modellerinde mekanik sinyallemenin hipotez odaklı test edilmesine olanak tanıyarak keşiften preklinik aşamaya kadar olan sürece entegre olur; böylece hem hedef doğrulamayı hem de translasyonel biyobelirteç geliştirmeyi destekler.
- Keşif Biyolojisi: Beyin sinyal yolaklarının mekanik aktivasyonu için sıfır hipotezi testini destekler.
- Tarama: Analiz standardizasyonu için tekrarlanabilir, kantitatif mekanik stimülasyon sağlar.
- Analitikler: İvme profilleri, reseptör internalizasyonu ve c-Fos ekspresyonu gibi ölçülebilir çıktılar sunar.
- Translasyonel Araştırma: Mekanistik bulguları egzersiz ve nöropsikiyatrik araştırmalarla ilgili preklinik modellerle ilişkilendirir.
- Kurumsal Yeniden Kullanım: Çeşitli mekanotransdüksiyon ve nörobiyoloji çalışmaları için yeniden kullanılabilir bir platform sunar.
Operasyonel ve Kurumsal Etki
- Bilimsel Değer: Mekanistik hipotezlerdeki ve hedef doğrulamadaki öngörü güvenini artırır.
- Operasyonel Değer: Standartlaştırılmış, ölçeklenebilir ve tekrarlanabilir mekanik stimülasyon protokollerine olanak tanır.
- Stratejik Değer: Beyin hedefleri üzerindeki doğrudan mekanik etkileri netleştirerek devam/dur kararlarını iyileştirir.
- Portföy Etkisi: Nöropsikiyatrik ve egzersiz-mimetik programların riske göre ayarlanmış önceliklendirmesini destekler.
Uygulama Hususları
- Kemirgenlerle çalışma, nörobiyoloji ve kantitatif görüntüleme konularında uzmanlık gerektirir.
- Kontrollü mekanik stimülasyon ve yüksek çözünürlüklü floresan mikroskobu için cihaz donanımı gereklidir.
- Stimülasyon parametrelerinin ve analitik uç noktaların ekipler arası standartlaştırılmasını gerektirir.
- Farklı kemirgen türlerine ve egzersiz paradigmalarına adaptasyon, protokol optimizasyonu gerektirebilir.
- Mekanik müdahale erişilebilir vücut bölgeleriyle sınırlıdır ve sistemik egzersiz etkilerini tam olarak yansıtmayabilir.
Biyofarma SSS
Chapters in this video
0:05
Introduction
0:35
Measurement of Magnitudes of Accelerations and Adjustment of the PHM System
1:33
Quantification of Mouse Head-Twitch Response
2:03
Immunohistochemical Analysis of Prefrontal Cortex (PFC) Collected from Euthanized Mouse Brain
3:22
Results: Effect of Treadmill Running and PHM Application in Mouse PFC Neurons
4:37
Conclusion
